雙孢蘑菇子實體多糖的響應(yīng)面法優(yōu)化提取及其純化

王 琳， 趙荷娟， 魏啟舜， 周 影

(江蘇丘陵地區(qū)南京農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，江蘇 南京210046)

雙孢蘑菇因為其營養(yǎng)價值高、脂類含量低、口味佳等優(yōu)點，幾個世紀來一直是倍受人們喜愛的食物［1-4］。雙孢蘑菇含有豐富的多糖，雙孢蘑菇多糖具有清除自由基、防治敗血癥、抗炎鎮(zhèn)痛、增強免疫力等功效，是一類無毒、無副作用的免疫活性物質(zhì)［5-7］。常見的雙孢蘑菇多糖的提取方法有水提法、堿提法、酶輔助提取法、微波助提法、超聲波助提法等［8-12］，其中熱水浸提法是使用較為廣泛的從植物中提取多糖的方法［13］，但是提取時需要較高的溫度和多次提取合并，具有耗能和耗時的缺點［14］。超聲波輔助提取相對于其他提取方法具有速度快、對植物材料的細胞分子結(jié)構(gòu)破壞較少［15］、并且能夠在低溫下提取［16］等優(yōu)點，因此超聲波提取現(xiàn)在廣泛用于植物多糖的提?。?7］。但目前采用超聲波提取雙孢蘑菇多糖的研究較少，在工藝優(yōu)化上，多是在單因素或正交試驗的條件下獲得，而未建立多糖得率與考察因素間關(guān)系的數(shù)學(xué)模型，從而對過程的放大和優(yōu)化生產(chǎn)的指導(dǎo)產(chǎn)生了局限性。響應(yīng)面法是一種應(yīng)用較廣的試驗優(yōu)化方法，由于采用了較為合理的試驗設(shè)計，能以很少的試驗數(shù)量和時間對試驗進行全面研究，可以快速有效地確定多因子系統(tǒng)的最佳條件，目前已經(jīng)廣泛地應(yīng)用于各類條件優(yōu)化試驗。因此本研究應(yīng)用響應(yīng)面法優(yōu)化超聲波輔助提取的各個工藝參數(shù)，從而提高雙孢蘑菇多糖的提取效率，并使用離子交換層析的方法將多糖進行純化，測定每個組分的分子量，旨在為雙孢蘑菇的進一步利用打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料的準備

試驗材料雙孢蘑菇由江蘇無錫祥云菇業(yè)有限公司提供，其品種名為AS2796。雙孢蘑菇用自來水洗凈后切片，放入烘箱60 ℃烘3 d 后粉碎過60目篩，裝入塑料袋中密封儲存在干燥黑暗的地方備用。

1.2 多糖的提取

準確稱取一定量雙孢蘑菇粉末放入燒杯中，加適量的蒸餾水浸泡30 min，然后將燒杯置于超聲波破碎儀(南京先歐JY92-IIDN)中進行超聲波處理。提取液在離心機中以4 500 r/min的速度離心15 min，得到上清液后真空濃縮，濃縮至原體積的1/5 左右。在濃縮液中加入3 倍體積4 ℃體積分數(shù)95% 的乙醇，于4 ℃的冰箱中放置10 h，然后在離心機中以4 500 r/min的速度離心15 min，棄上清液，得到多糖粗品。取多糖粗品加蒸餾水重新溶解后，利用Sevage法［18］去除多糖粗品中的蛋白質(zhì)，即可得到雙孢蘑菇粗多糖產(chǎn)品。

1.3 多糖得率的測定

采用硫酸-苯酚法［9］，以葡萄糖為標準品，并按照以下公式計算:多糖得率= ［(測得多糖質(zhì)量×稀釋倍數(shù))/雙孢蘑菇樣品的稱樣質(zhì)量］ ×100%。

1.4 單因素試驗設(shè)計

1.4.1 水料比對雙孢蘑菇多糖得率的影響稱取2 g 雙孢蘑菇子實體干粉放入100 ml 的燒杯中，分別加入20 ml、40 ml、60 ml、80 ml、100 ml 水攪拌均勻，即水料比分別為10∶ 1、20∶ 1、30∶ 1、40∶ 1、50∶ 1。超聲功率585 W，超聲時間20 min，超聲處理后離心取上清測定總糖含量。

1.4.2 超聲功率對雙孢蘑菇多糖得率的影響 稱取2 g 雙孢蘑菇子實體干粉放入100 ml 的燒杯中，加入40 ml 水攪拌均勻，超聲波處理15 min，超聲功率分別為405 W、495 W、585 W、675 W、765 W、855 W，測定總糖含量。

1.4.3 超聲時間對雙孢蘑菇多糖得率的影響稱取2 g 雙孢蘑菇子實體干粉放入100 ml 的燒杯中，加入40 ml 水攪拌均勻，超聲功率為585 W，超聲時間分別為10 min、15 min、20 min、25 min、30 min，測定總糖含量。

1.5 響應(yīng)面法試驗設(shè)計

根據(jù)超聲波提取工藝的單因素試驗結(jié)果，以水料比、超聲時間、超聲功率3 個因素為研究對象，以提取液中多糖含量為響應(yīng)值設(shè)計Box-Benhnken 試驗，研究各因素對雙孢蘑菇子實體多糖得率影響的程度，優(yōu)化提取工藝，試驗因素水平及編碼見表1。

1.6 回歸模型驗證試驗

按照軟件Design Expert 7.0 給出的最優(yōu)參數(shù)進行試驗，重復(fù)3 次，計算試驗值與理論值之間的誤差。

表1 響應(yīng)面試驗因素水平設(shè)計Table 1 Factors and levels in response surface analysis

1.7 多糖的分離純化

將經(jīng)過脫蛋白質(zhì)、脫色的多糖樣品溶于pH5、0.1 mol/L醋酸緩沖液，用0.45 μm 的濾膜過濾。使用纖維素離子交換層析純化，層析柱規(guī)格1 cm×20 cm，用DEAE Sepharose F F 填料裝柱，用0.1 mol/L、pH 5.0 醋酸緩沖液平衡。每次上樣量為3 ml 10%的粗糖，先用2 倍柱體積緩沖液洗脫，再用0.2 mol/L NaCl(溶于pH 5.0 的0.1 mol/L HAc-NaAc緩沖溶液)進行線性洗脫，流速1 ml/min，每管收集3 ml。用苯酚-硫酸法檢測多糖含量，繪制曲線，合并單峰部分冷凍干燥。

1.8 多糖分子量和純度的測定

用高效凝膠滲透色譜(HPGPC)法檢測樣品純度。采用裝有凝膠過濾層析柱TSK-G4000 PWXL的安捷倫高效液相系統(tǒng)(Agilent 1100)。檢測條件:樣品濃度4 mg/ml，進樣量20 μl，流動相0.2 mol/L氯化鈉，流速0.6 ml/min，柱溫30 ℃。示差折光檢測器檢測。

用高效體積排阻凝膠滲透色譜法(HPGPCSEC)確定多糖的分子量［19］。測定條件:色譜柱為Agilent PL aquagel-OH MIXED-H 8 μm，樣品濃度為4 mg/ml，進樣量為20 μl，洗脫流速為1.5 ml/min，柱溫為30 ℃，流動相為0.2 mol/L NaCl，示差折光檢測器檢測。凝膠過濾柱通過葡聚糖標準品T-4.32、12.6、60.6、110、289、500 校正。

1.9 數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計分析

采用SPSS17.0 進行ANOVA 單因素方差分析及Ducan’s 多重檢驗。響應(yīng)曲面優(yōu)化及數(shù)據(jù)分析采用Design Expert7 .0 軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 水料比對雙孢蘑菇多糖得率的影響 水料比是提取過程中的一個重要影響因素，從傳質(zhì)速率的角度來說，主要表現(xiàn)在影響固相主體和液相主體之間的濃度差。溶劑用量越多，傳質(zhì)動力越大，擴散到溶劑里的多糖就越多［20］。但是在固液兩相間，除了擴散溶解平衡外，還存在吸附平衡，低溫有利于吸附。由于水料比的增大，在產(chǎn)生相同熱量的條件下，提取液溫度下降，吸附作用增強導(dǎo)致得率下降［21］。圖1 顯示，在開始階段多糖的含量隨著水料比的增大而增大，當水料比大于30∶ 1 時，浸提液中多糖的含量降低。統(tǒng)計分析結(jié)果表明，30∶ 1 與10∶ 1、20∶ 1、40∶ 1、50∶ 1 之間多糖的提取率差異顯著(P＜0.05)，20∶ 1、40∶ 1、40∶ 1 與50∶ 1 之間差異不顯著(P＞0.05)。表明，水料比小于30∶ 1 時，水料比與雙孢蘑菇提取率的影響正向顯著，大于30∶ 1時則負向顯著，因此選擇水料比30∶ 1 作為響應(yīng)面試驗設(shè)計的中心點。

圖1 水料比對雙孢蘑菇多糖得率的影響Fig.1 Effects of water to solid ratio on the yield of Agaricus bisporus polysaccharides

2.1.2 超聲時間對雙孢蘑菇多糖得率的影響 隨著超聲時間延長，多糖得率先增大后降低，在15 min時達到最大(圖2)。因為隨著超聲處理時間延長、細胞破碎程度增大，細胞內(nèi)部的多糖物質(zhì)開始向外擴散，使得溶劑中多糖的含量迅速升高。但超聲波具有較強的剪切作用，時間過長會使大分子的多糖鏈斷裂，多糖發(fā)生部分降解［22］，造成多糖含量下降。統(tǒng)計分析結(jié)果表明，超聲時間15 min 與其他超聲時間處理之間對多糖的提取率具有顯著差異(P＞0.05)，因此，以超聲時間15 min 作為響應(yīng)面設(shè)計的中心點。

圖2 超聲時間對雙孢蘑菇多糖得率的影響Fig.2 Effects of ultrasonic extraction time duration on the yield of A.bisporus polysaccharides

2.1.3 超聲功率對雙孢蘑菇多糖得率的影響 隨著超聲功率的提高，浸提液中多糖的含量也先增大后降低(圖3)。增大超聲波功率強化傳質(zhì)同時使細胞的破碎程度增加，從而有利于多糖的提取。然而當超聲功率過大時，會引起部分多糖的降解。統(tǒng)計分析結(jié)果表明:超聲功率585 W 處理與405 W、495 W、765 W、855 W 處理之間多糖的提取率有顯著差異(P＜0.05)，585 W 與675 W 處理之間多糖的提取率差異不顯著(P＞0.05)，而675 W 處理除了與405 W 處理之間多糖提取率差異顯著(P＜0.05)外，與其他處理不顯著(P＞0.05)。因此，選擇超聲功率585 W 作為響應(yīng)面試驗設(shè)計的中心點。

2.2 響應(yīng)曲面試驗

2.2.1 試驗結(jié)果 綜合單因素試驗結(jié)果，選擇水料比(X1)、超聲時間(X2)、超聲功率(X3)3 個因素所確定的水平范圍，用Design-Expert 7.0 軟件設(shè)計響應(yīng)面試驗。根據(jù)Box-Benhnken 設(shè)計原理，以雙孢蘑菇多糖含量為響應(yīng)值，進行3 因素3 水平共17 個試驗點的響應(yīng)面分析。試驗以隨機次序進行，結(jié)果見表2。雙孢蘑菇多糖的得率從4.84%到6.41%。當水料比為30∶ 1 時，超聲功率為585 W，超聲時間為15 min 時多糖的得率最高，為6.41%。

圖3 超聲功率對雙孢蘑菇多糖得率的影響Fig.3 Effects of ultrasonic extraction power on the yield of A.bisporus polysaccharides

表2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗設(shè)計及結(jié)果Table 2 Designs of three factors and polysaccharides yields

模型方差分析結(jié)果(表3)表明，對多糖得率所建立的二次多項模型具有高度顯著性(P=0.000 2＜0.01)。失擬項P=0.207 9，大于0.05，不顯著;模型的調(diào)整確定系數(shù)R2=0.924 6，該模型能解釋92.46%響應(yīng)值的變化，因而該模型擬合程度比較好，試驗誤差小，可以用此模型對超聲波提取雙孢蘑菇多糖進行分析和預(yù)測。

表3 雙孢蘑菇多糖提取回歸模型方差分析表Table 3 Variance analysis of regression model for A.bisporus polysaccaride extraction

模型方程回歸系數(shù)及其顯著性檢驗結(jié)果(表3)表明:模型一次項X1、X2極顯著，X3不顯著;二次項X1、X3極顯著，X2顯著;交互項X2X3不顯著，X1X2、X1X3極顯著。由F值可知，3 因素對多糖提取效率影響大小依次為時間＞水料比＞超聲功率。因此各個具體試驗因素與響應(yīng)值都不是線性關(guān)系。

2.2.2 擬合模型 對數(shù)據(jù)進行多元回歸分析，獲得二次多元回歸方程:Y= 6.330 0 - 0.160 0X1+0.150 0X2+0.250 0X3-0.002 5X1X2-0.240 0X1代表多糖的得率(%)，X1、X2、X3分別代表水料比、超聲時間、超聲功率。

2.2.3 響應(yīng)面分析 通過模型方程所作的響應(yīng)曲面圖及其等高線(圖4)顯示，多糖得率隨各兩因素的增加先呈上升趨勢，隨后略有下降。等高線的形狀為橢圓形時表示交互作用強，為圓形時表示交互作用弱。由圖4 可知，各兩因素交互作用的等高線均呈橢圓形，說明各兩因素之間交互作用明顯。而從等高線密度沿坐標軸的變化可知，沿水料比軸、超聲時間軸向等高線均比超聲功率軸向的密，表明超聲功率對多糖得率的影響最小，與表2 數(shù)據(jù)一致。

通過軟件分析，超聲波提取雙孢蘑菇多糖的最佳條件為超聲時間16.87 min、超聲功率596.91 W、水料比為35.99∶ 1.00。在此條件下多糖得率可達6.17%。為檢驗響應(yīng)面法法的可靠性，采用上述最優(yōu)提取條件進行多糖的超聲波提取試驗，同時考慮到實際操作情況，將多糖最佳提取條件修正為水料比36∶ 1、超聲時間17 min、超聲功率594 W，實際測得的多糖得率為6.63%，與理論預(yù)測值比較誤差為6.9%。因此采用響應(yīng)曲面法優(yōu)化得到的超聲波提取條件參數(shù)基本準確可靠，具有一定的實用價值。

2.3 粗糖的分離純化

如圖5 所示，DEAE Sepharose F F 層析柱對雙孢蘑菇多糖具有良好的分離效果。經(jīng)過梯度洗脫得到2 個洗脫峰，說明雙孢蘑菇多糖至少含有2 個多糖組分，命名為A I 和A II。收集各單峰部分，經(jīng)苯酚-硫酸法檢測，可知每個組分所占比例不同，不含NaCl 的緩沖液洗脫組分A I 占大部分，NaCl 梯度洗脫的組分A II 占少部分。

A I 和A II 的液相色譜圖見圖6，A I 的保留時間為5.124 min，A II 的保留時間為5.783 min，純度分別為74%和73%，說明組分還有部分雜質(zhì)，可以繼續(xù)通過凝膠色譜柱進一步分離純化。AⅠ和AⅡ的分子量分別為2.75 ×105和1.4 ×104。

圖4 不同因素對雙孢蘑菇多糖提取率影響的響應(yīng)曲面和等高線Fig.4 Response surface and contour showing the effects of different extraction parameters on yield of Agaricus bisporus polysaccharides

圖5 雙孢蘑菇多糖DEAE Sepharose F F 柱層析Fig.5 Elution profile of polysaccharides from A.bisporus through DEAE Sepharose F F column

3 討論

近年來，超聲波技術(shù)已廣泛應(yīng)用于功能成分的提取，具有提取效率高、提取時間短的特點，而且提取過程無需高溫，避免了因高溫對功能成分分子結(jié)構(gòu)的破壞，是雙孢蘑菇多糖工業(yè)比較理想的一種提取新工藝。通過對從雙孢蘑菇子實體中提取多糖的工藝條件的單因素和響應(yīng)曲面分析，得到超聲波輔助提取雙孢蘑菇多糖的最佳工藝條件為:超聲時間17 min，超聲功率594 W，水料比36∶ 1，在此條件下多糖得率為6.63%。

利用超聲波輔助提取效率高，操作簡便。喬德亮等［18］利用熱水浸提雙孢蘑菇多糖的得率為3.51%，而本研究通過超聲波輔助提取多糖的得率為6.63%，超聲波輔助提取大大提高了多糖的提取效率。Tian 等［23］利用響應(yīng)面法優(yōu)化雙孢蘑菇多糖的提取工藝，得到最佳提取參數(shù)為:超聲功率為230 W，提取溫度70 ℃，提取時間62 min，水料比為30 ∶ 1，多糖的提取率為6.02%。本試驗在提取中加大了超聲功率，使用常溫提取，避免了高溫對多糖分子的破壞，節(jié)約能源，縮短了提取時間。本研究結(jié)果表明使用響應(yīng)面法優(yōu)化超聲波輔助提取雙孢蘑菇子實體多糖的工藝參數(shù)是有效可行的。

不同品種的雙孢蘑菇所含多糖的組分并不一樣，目前報導(dǎo)的純化雙孢蘑菇多糖均為單一成分。高宏偉等［24］從雙孢蘑菇菌絲中分離出的胞內(nèi)多糖以及Tian 等［23］從雙孢蘑菇子實體中分離的多糖都由β-糖苷鍵組成，分子量均為1.58 ×105。Mao 等［7］從雙孢蘑菇(Agaricus bisporusMJ-0811)中也分離出一種多糖，而本試驗通過離子層析柱從雙孢蘑菇(Agaricus bisporusAS2796)的多糖中分離出2 個組分的多糖，分子量分別為2.75 ×105和1.4 ×104。不同組分不同分子量的多糖結(jié)構(gòu)有所差異從而有著不同的活性，對不同組分的多糖結(jié)構(gòu)和活性分析是我們下一步要做的工作。

［1］ CHIANG P D，YEN C T，MAU J L.Non-volatile taste components of canned mushrooms［J］.Food Chemistry，2006，97(3):431-437.

［2］ LIU Z Q，ZHOU J H，ZENG X L，et al.The enhancement and encapsulation ofAgaricus bisporusflavor［J］.Journal of Food Engineering，2004，65(3):391-396.

［3］ 張黎杰，姜若勇，王夏雯，等.新型菇菜連棚共生模式對環(huán)境因子的影響［J］.江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，41(4):131-133.

［4］ 于建光，李瑞鵬，常志州，等.雙孢蘑菇菇渣不同堆制方式制作有機肥試驗研究［J］.江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，41(2):334-335.

［5］ RUTHES A C，RATTMANN Y D，MALQUEVICZ O S M，et al.Agaricus bisporusfucogalactan:Structural characterization and pharmacological approaches［J］.Carbohydrate Polymers，2013，92(1):184-191.

［6］ YING Z，HAN X，LI J.Ultrasound-assisted extraction of polysaccharides from mulberry leaves［J］.Food Chemistry，2011，127(3):1273-1279.

［7］ MAO Y，MAO J，MENG X.Extraction optimization and bioactivity of exopolysaccharides fromAgaricus bisporus［J］.Carbohydrate Polymers，2013，92(2):1602-1607.

［8］ 熊 澤，邵 偉，黃 藝.雙孢磨菇多糖提取工藝優(yōu)化研究［J］.三峽大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版，2007，29(4):367-370.

［9］ 高振鵬，袁亞宏，岳田利，等.超聲波輔助提取雙孢蘑菇多糖的研究［J］.西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版，2012，40(7):215-220.

［10］ 吳 疆，班立桐.應(yīng)用雙水相萃取技術(shù)提取雙孢蘑菇多糖的研究［J］.食品研究與開發(fā)，2011(7):4-7.

［11］ 鄒 偉，張寶善，李 冰，等.水浴振蕩輔助酶法提取雙孢蘑菇多糖的工藝研究［J］.食品工業(yè)科技，2011(5):223-224.

［12］ 林 魁，魏云華，張燕青.酶法提取雙孢蘑菇多糖工藝研究［J］.現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2012(18):289-290.

［13］ LAI L S，YANG D H.Rheological properties of the hot-water extracted polysaccharides in Ling-Zhi (Ganoderma lucidum)［J］.Food Hydrocolloids，2007，21(5):739-746.

［14］ ZHONG K，WANG Q.Optimization of ultrasonic extraction of polysaccharides from dried longan pulp using response surface methodology［J］.Carbohydrate Polymers，2010，80(1):19-25.

［15］ VILKHU K，MAWSON R，SIMONS L，et al.Applications and opportunities for ultrasound assisted extraction in the food industry—A review［J］.Innovative Food Science ＆ Emerging Technologies，2008，9(2):161-169.

［16］ GANG X，HONG Z，JIAN H.Leaching method of flavone from bamboo leaves ［J］.Chinese Journal of Analytical Chemistry，2000，28(7):857-859.

［17］ PAN Y，HAO Y，CHU T，et al.Ultrasonic-assisted extraction，chemical characterization of polysaccharides from Yunzhi mushroom and its effect on osteoblast cells［J］.Carbohydrate Polymers，2010，80(3):922-926.

［18］ 喬德亮，陳乃富，張 莉，等.雙孢蘑菇子實體多糖提取條件優(yōu)化及部分特性研究［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2011，23(2):195-199.

［19］ LUO L，WU M，XU L，et al.Comparison of physicochemical characteristics and anticoagulant activities of polysaccharides from three sea cucumbers［J］.Marine Drugs，2013，11(2):399-417.

［20］ BENDAHOU A，DUFRESNE A，KADDAMI H，et al.Isolation and structural characterization of hemicelluloses from palm ofPhoenix dactyliferaL.［J］.Carbohydrate Polymers，2007，68(3):601-608.

［21］ 馮年平，郁 威.中藥提取分離技術(shù)原理與應(yīng)用［M］.北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2005.

［22］ 李鐘玉，張京東，李臨生.超聲波法提取靈芝多糖的研究［J］.中國食用菌，2004，23(2):42-44.

［23］ TIAN Y T，ZENG H L，XU Z B，et al.Ultrasonic-assisted extraction and antioxidant activity of polysaccharides recovered from white button mushroom (Agaricus bisporus)［J］.Carbohydrate Polymers，2012，88(2):522-529.

［24］ 高宏偉，李兆蘭，劉志禮，等.雙孢蘑菇胞外多糖及胞內(nèi)多糖的分離純化和化學(xué)結(jié)構(gòu)分析［J］.南京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)，1997，15(4):224-225.