豆渣蛋白提取及檢測試驗

馬秀婷，肖志剛，2，羅志剛，葉玲玲，孫 旭，高 洋，劉海飛

(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江哈爾濱150030;2.沈陽師范大學(xué)糧食學(xué)院，遼寧沈陽110034;3.華南理工大學(xué) 輕工與食品學(xué)院，廣東廣州510641)

國內(nèi)外對大豆副產(chǎn)物的研究大多集中在對大豆壓榨完豆油后的渣子豆粕的研究，而文中提到的豆渣是加工完豆腐、豆乳和豆皮等豆制品的副產(chǎn)物，人們往往忽略了對這種副產(chǎn)物的利用.目前國內(nèi)大豆食品行業(yè)每年可產(chǎn)生上千萬噸濕豆渣，大豆豆渣中含有較多的蛋白質(zhì)、膳食纖維、多糖、異黃酮等營養(yǎng)物質(zhì)［1］，對豆渣蛋白的綜合利用可以有效減輕對環(huán)境的污染.由于豆渣在加工過程中水溶性的蛋白質(zhì)已經(jīng)溶解在具體產(chǎn)品當(dāng)中，其余的蛋白質(zhì)幾乎都是很難溶于水的，因此對豆渣中剩余蛋白質(zhì)的提取研究存在很大困難.事實上對蛋白質(zhì)提取的方法還是比較多的，如堿溶酸沉法、酶法、反膠束法、鹽析法等［2］，目前大多提取蛋白方法是單一方法進行的，并且上述方法中都或多或少存在蛋白提取率低、蛋白純度達不到要求和所得蛋白加工性能降低等弊端.

超聲波作為一種輔助手段提取豆渣蛋白，具有費用低、毒副作用小、作用時間短及對產(chǎn)品營養(yǎng)性能影響較小等優(yōu)點.由于豆渣蛋白分子結(jié)構(gòu)復(fù)雜，影響豆渣蛋白功能性質(zhì)因素也十分復(fù)雜.所以不僅要進一步對豆渣蛋白提取工藝進行研究，還要加強豆渣蛋白基礎(chǔ)研究.目前通過對豆渣蛋白SDS-PAGE凝膠電泳，氨基酸組成和溶解性分析來衡量豆渣蛋白的變性程度［3-5］，文中為了證實堿溶酸沉法和超聲波輔助提取的豆渣蛋白相比是否存在變性，對豆渣蛋白的溶解性進行考察，即對豆渣蛋白的PDI和NSI進行測定，為提高大豆豆渣中蛋白提取率，采用超聲波和堿溶酸沉共同作用的方法進行研究.

1 材料與方法

1.1 材料、藥品和相關(guān)儀器

大豆豆渣來自哈爾濱阿幸豆制品加工廠，體積分?jǐn)?shù)為98%濃硫酸、95%乙醇、氫氧化鈉、鹽酸、硼酸等均為分析純.Analysenmuhce A10冷卻式粉碎機(德國W-Germany公司);JY92超聲波細(xì)胞粉碎機(寧波新芝生物科技股份有限公司);722可見光分光光度計(上海青華科技儀器有限公司);MA40電子分析天平(德國Sartorius公司);LD4-2A離心機(北京醫(yī)用離心機廠);電熱恒溫水浴鍋(余姚市東方電工儀器廠).

1.2 豆渣主要成分檢測

蛋白質(zhì)含量檢測:GB/T5009.5—2010，凱氏定氮法;纖維素含量檢測:GB/T5009.10—2010，重量法;淀粉含量檢測:GB/T5009.9—2008，酸水解法;灰分含量檢測:GB/T5009.4—2010，灼燒恒重法;水分含量檢測:GB/T5009.3—2010，105 ℃ 恒重法;脂肪含量檢測:GB/T 5009.6—2010，索氏抽提法.

1.3 試驗方法

經(jīng)預(yù)試驗確定大豆豆渣蛋白提取的技術(shù)路線，見圖1.

圖1 豆渣蛋白提取技術(shù)路線

蛋白提取率的計算如下:

1.4 豆渣蛋白等電點的測定

取過100目篩的豆渣粉50 g，在料液質(zhì)量濃度22 mL·g-1，45℃下用1 mol·L-1NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至9.5，攪拌提取1 h，提取過程中要不斷向溶液中加入1 mol·L-1NaOH保證體系的pH一直是9.5 不變，8 000 r·min-1離心 10 min，取上清液，用量筒平均分成10份，再用1 mol·L-1的HCI調(diào)節(jié)溶液的 pH 至 4.0，4.2，4.4，4.6，4.8，5.0，5.2，5.4，5.6，5.8，6.0，靜止 2 h 后 8 000 r·min-1離心 10 min，檢測沉淀蛋白質(zhì)的質(zhì)量，以pH為橫坐標(biāo)、以沉淀蛋白質(zhì)的質(zhì)量與原液質(zhì)量的百分比K為縱坐標(biāo)繪制曲線圖，得到不同pH條件下對豆渣蛋白沉淀質(zhì)量的影響，從而確定其等電點.

1.5 提取條件的確定

相關(guān)學(xué)者研究［6-10］發(fā)現(xiàn)，超聲波輔助提取的主要影響因素有液料比、溫度、超聲時間、超聲功率，故本試驗對這4個因素采用Sigma Plot軟件進行單因素分析，通過單因素試驗獲得豆渣蛋白提取率最優(yōu)參數(shù)組合.

經(jīng)預(yù)試驗已得出超聲輔助堿溶酸沉法的蛋白提取率遠遠大于堿溶酸沉法的蛋白提取率.準(zhǔn)確稱取10 g豆渣粉末，用1 mol·L-1氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)體系 pH 值為 7.5，8.5，9.5，10.5，在不同條件下進行超聲輔助堿溶酸沉法提取豆渣蛋白試驗，并用微量凱氏定氮法檢測蛋白含量.

根據(jù)預(yù)試驗和參考文獻［11］，固定其他因素考查某一因素的變化情況，進行以下單因素試驗.各個因素固定值為液料比22 mL·g-1、溫度45℃、超聲時間30 min、超聲功率500 W，考查各因素對蛋白提取率影響的單因素變化值分別為液料比18，20，22，24，26，28，30 mL·g-1;溫度 35，40，45，50，55，60 ℃;超聲時間 10，20，30，40，50，60 min;超聲功率100，200，300，400，500，600，700 W.每一單因素試驗點做3組平行對照.例如考核料液比對豆渣蛋白提取率影響時，固定其他因素條件為溫度45℃、超聲時間30 min、超聲功率 500 W，液料比為 18，20，22，24，26，28，30 mL·g-1.考查其他相關(guān)因素時與此類似.

1.6 豆渣蛋白熱力學(xué)性質(zhì)

稱取3 mg的豆渣蛋白樣品于小鋁盒中，以未裝任何物質(zhì)壓縮空鋁盒作為空白對照，檢測條件:掃描溫度范圍30～40℃，升溫速率為30℃·min-1，氣氛為氮氣，流率為30 mL·min-1，進行DSC掃描試驗，記錄DSC曲線.最終確定出豆渣蛋白變性焓值和變性溫度.

1.7 SDS-PAGE凝膠電泳檢測

分離膠含 10%Acr，0.15%Bis，0.57 mol·L-1Tris-HCl，0.1%SDS，pH 為 8.8，濃縮膠含 3.3%Acr，0.5%Bis，0.18 mol·L-1Tris-HCl，0.1%SDS，pH 為6.8.電極緩沖液含 Tris0.023，甘氨酸 1.44%，SDS 0.1%，pH 為 8.0.

1.8 豆渣蛋白氨基酸組成分析

準(zhǔn)確稱取20.00 mg樣品于一端封口的小玻璃管中，加入8 mL 6 mol·L-1HCl于水解管中，再將上述玻璃管開口朝上置于水解管中，注意不要使鹽酸漫過水解管邊緣.首先將水解管真空脫氣、再氮氣封管，利用鹽酸蒸氣在110℃下對樣品進行水解，體系反應(yīng)24 h后將水解液取出，再將其真空干燥，減壓的過程中除去水解液殘留的鹽酸.之后將6-氨基哇琳基-N-羥基琥珀酰亞氨基甲酸酯溶液和水解液加入事先準(zhǔn)備好的衍生管中，最后進行色譜分析.根據(jù)氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品色譜分離圖計算出所得圖譜的氨基酸含量.

1.9 豆渣蛋白溶解指數(shù)檢測

1.9.1 豆渣蛋白PDI測定

方法參考文獻［12］，有改動.準(zhǔn)確稱取20.00 g豆渣蛋白樣品、25℃蒸餾水于300 mL容量瓶中，取其50 mL于攪拌杯，將稱好的豆渣蛋白定量移入攪拌杯，用刮鏟攪拌至糊狀，用剩余水不斷沖洗攪杯壁和刮鏟，之后8 000 r·min-1攪拌10 min，將漿液移入500 mL燒杯中，靜止5 min，取40 mL于50 mL離心管中在8 000 r·min-1離心20 min，隨后采用GB/

1.9.2 豆渣蛋白NSI測定

方法參考文獻［13］，有改動.準(zhǔn)確稱取5.00 g豆渣蛋白樣品，置于500 mL燒杯中，用量筒量取200 mL 30℃的蒸餾水，分幾次加入到燒杯中，樣品混合后將其浸在30℃水槽中，120 r·min-1攪拌100 min再將混合物轉(zhuǎn)到250 mL容量瓶中，蒸餾水稀釋至刻度，靜止5 min，取40 mL于50 mL離心管中在8 000 r·min-1離心20 min，隨后采用 GB/T 5009.5—2010微量凱氏定氮法測定上清液中可溶解氮含量和樣品總氮含量，則T 5009.5—2010微量凱氏定氮法測定上清液分散蛋白質(zhì)和樣品總蛋白質(zhì)含量，則

2 結(jié)果與討論

豆渣蛋白等電點檢測結(jié)果見圖2.

圖2 豆渣蛋白等電點檢測

在pH5.4處，豆渣蛋白質(zhì)沉淀量最多，這主要是因為豆渣蛋白是肽鍵脫水縮合而成，雖然豆渣蛋白內(nèi)部的α-羧基和α-氨基殘基在形成脫水縮合過程中消除，但是某些氨基酸的殘基仍可電離，使得豆渣蛋白分子所帶靜電荷仍可隨溶液pH的變化而變化.根據(jù)等電點處蛋白質(zhì)溶解度最小原理，測得豆渣蛋白質(zhì)等電點為pH5.4，這也說明豆渣蛋白具有特定氨基酸種類和數(shù)量.

基本成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)測定結(jié)果為蛋白質(zhì)(13.02±0.09)%;纖維素(71.93 ±0.32)%;淀粉(3.17 ±0.05)%;灰 分 (3.76 ± 0.11)%;水 分 (3.12 ±0.23)%;脂肪(4.01 ±0.06)%，豆渣中主要成分是膳食纖維，其次就是蛋白質(zhì)，除了上述物質(zhì)外還可能含有多種維生素、礦物質(zhì)、胰蛋白酶抑制劑、血球凝結(jié)素、糜蛋白抑制劑等，它們含量較少并在豆渣蛋白提取過程中無明顯影響.

2.1 液料比對蛋白提取率的影響

液料比對蛋白提取率的影響見圖3.

圖3 液料比對蛋白提取率的影響

由圖3可看出，當(dāng)溫度45℃、超聲時間30 min、超聲功率500 W時，隨液料比增加蛋白提取率呈遞增趨勢.當(dāng)液料比較小時，蛋白質(zhì)擴散速率較低，蛋白質(zhì)分子和溶液分子之間分布不均勻，導(dǎo)致OH-分布不均勻，阻止體系中蛋白質(zhì)溶出.但若液料比過大，又會影響到濃縮等后續(xù)工作進行.與此同時pH值在7.5～9.5，蛋白提取率逐漸增加，OH-所帶的負(fù)電荷與蛋白質(zhì)所帶的負(fù)電荷彼此排斥，導(dǎo)致蛋白質(zhì)溶解作用和擴散作用增加［14］，表現(xiàn)為蛋白質(zhì)溶解度增加;pH值在9.5～10.5，蛋白提取率卻明顯下降，原因是當(dāng)pH值超過10后，會出現(xiàn)脫氨、脫羧和肽鍵斷裂等副反應(yīng)的發(fā)生［15］，再者由于OH-占主導(dǎo)作用，使—COO-增加了分子間靜電斥力，離散的雙電子層加厚，溶液界面膜增厚，易于形成膠束，進而導(dǎo)致蛋白質(zhì)的溶解和擴散作用降低.因此，液料比22 mL·g-1較為適宜.

2.2 溫度對蛋白提取率的影響

溫度對蛋白提取率的影響見圖4.

圖4 溫度對蛋白提取率的影響

由圖4可知，當(dāng)液料比22 mL·g-1、超聲時間30 min、超聲功率500 W時，在溫度從35～50℃，蛋白提取率呈增加趨勢，而最初蛋白提取率較低，因為此時溶劑的動能尚未達到將蛋白質(zhì)從豆渣顆粒中分離出來的水平，而后升高溫度，蛋白提取率不斷增大，這是因為隨著溫度的升高，使豆渣蛋白的溶解和擴散程度均呈增加趨勢.但當(dāng)溫度超過55℃，蛋白提取率又呈下降的趨勢，pH值在7.5～9.5，蛋白提取率逐漸增加，原因是堿液使蛋白與其他成分緊密結(jié)構(gòu)變得疏松，對蛋白質(zhì)分子具有增溶作用，隨著pH值增加，豆渣蛋白提取率呈遞增趨勢.因此，溫度50℃較為適宜.

2.3 超聲時間對蛋白提取率的影響

超聲時間對蛋白提取率的影響見圖5.

圖5 超聲時間對蛋白提取率的影響

由圖 5可知，當(dāng)液料比 22 mL·g-1、溫度45℃、超聲功率500 W時，隨超聲時間增長和pH值在7.5～9.5，豆渣蛋白質(zhì)分子在堿液中溶解度不斷增加，pH 值在9.5～10.5，蛋白提取率降低，此時隨超聲時間延長蛋白提取呈遞增趨勢，最終達到一個平衡值，幾乎不再發(fā)生變化.這是因為隨超聲時間增加，蛋白質(zhì)的溶出和擴散速度都不斷增加，表現(xiàn)為豆渣蛋白質(zhì)分子在體系中的溶解度不斷增加，當(dāng)時間大于30 min，pH值大于9.5，整個體系的滲透壓達到平衡，體系組分不再溶出.因此，超聲時間30 min較為適宜.

2.4 超聲功率對蛋白提取率的影響

超聲功率對蛋白提取率的影響見圖6.

圖6 超聲功率對蛋白提取率的影響

如圖6所示，當(dāng)液料比22 mL·g-1、溫度45℃、超聲時間30 min時，隨超聲功率增加，豆渣蛋白提取率逐漸增加，最后趨于平緩，這是由于超聲功率增大，可產(chǎn)生強烈空化、湍動、微擾、界面等效應(yīng)，從而提高了蛋白質(zhì)分子的質(zhì)量傳遞能力.當(dāng)超聲強度達到或超過空化閥聲壓，此時空化作用明顯，豆渣蛋白提取率增加，并且蛋白質(zhì)溶出量遠遠超過其他雜質(zhì)，表現(xiàn)為蛋白提取率增加.在超聲功率為100 W和700 W時，分別面臨著豆渣蛋白提取率較低和蛋白質(zhì)變性失活的弊端，所以在響應(yīng)面試驗時不將超聲功率為100 W和700 W的點列入可以考查的參數(shù)范圍，進而使研究的結(jié)論更加清晰和突出.而pH 值7.5，8.5，9.5所對應(yīng)的蛋白提取率幾乎都高于pH值10.5時蛋白提取率.因此，超聲功率400 W較為適宜.綜上所述，當(dāng)pH值為9.5時，豆渣蛋白提取率幾乎都高于其他條件，因此進一步試驗時pH值選為9.5.

2.5 豆渣蛋白熱力學(xué)性質(zhì)測定

如圖7和8所示，蛋白質(zhì)變性與其焓值的變化是伴隨發(fā)生的，可利用DSC分析提取豆渣蛋白的熱變性溫度.當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)沒有發(fā)生變性時，是一種天然、有序的結(jié)構(gòu)，由DSC測得的吸熱焓值△H較大;而一旦發(fā)生變性，蛋白分子會由有序結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變?yōu)闊o序結(jié)構(gòu)，吸熱焓值△H隨之變小.由圖可見，堿溶酸沉和超聲波輔助所得的豆渣蛋白變性溫度均為98.65℃，兩者的熱焓值分別為20.09 J·g-1和19.39 J·g-1，兩者相差不大，說明超聲波的輔助作用幾乎未引起豆渣蛋白的變性.

與此同時，DSC的圖譜可以提供比較多的信息，如分子間相互作用、溶劑條件的不同對變性的影響，以及加工條件的不同對蛋白質(zhì)功能性質(zhì)分析的影響等.

圖7 堿溶酸沉豆渣蛋白DSC曲線

圖8 超聲波輔助豆渣蛋白DSC曲線

2.6 豆渣蛋白SDS-PAGE電泳圖

豆渣蛋白SDS-PAGE電泳圖見圖9.

圖9 2種蛋白的SDS-PAGE電泳圖

圖9中，標(biāo)示2泳道為超聲波輔助提取豆渣蛋白電泳圖譜，其濃縮膠中的顏色較標(biāo)示1泳道堿溶酸沉所得豆渣蛋白稍微加深，可能是因為超聲處理產(chǎn)生的“空穴作用”使得豆渣蛋白分子發(fā)生輕度交聯(lián)，而兩方法所得豆渣蛋白在分離膠中的電泳區(qū)帶幾乎相似，分子量沒有什么變化，其區(qū)帶的顏色深淺差別不明顯，這說明在超聲作用得到的豆渣蛋白并沒有產(chǎn)生亞基的斷裂.

2.7 豆渣蛋白氨基酸組成和分析

2種試驗方法所得豆渣蛋白氨基酸組成和質(zhì)量分?jǐn)?shù)如表1所示，由表可知兩者氨基酸含量相差不大.豆渣蛋白氨基酸組成豐富，其中谷氨酸含量最高為17.65%左右，天冬氨酸為9.91%左右，再之后就是亮氨酸為7.58%左右.

表1 2種方法所得豆渣蛋白氨基酸組成分析結(jié)果 %

2.8 豆渣蛋白溶解性分析

不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的豆渣蛋白對其PDI和NSI有重要影響，結(jié)果見圖10.

圖10 蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)對豆渣蛋白PDI和NSI影響

無論是單一堿溶酸沉法提取的豆渣蛋白還是超聲波輔助堿溶酸沉提取的豆渣蛋白都存在PDI值高于NSI值，后者提取的豆渣蛋白的PDI值要大于前者的PDI值，2種方法得到蛋白的PDI值和NSI值都隨豆渣蛋白濃度的增加呈現(xiàn)升高趨勢，這是因為豆渣蛋白的主要組成為球蛋白，其為緊密的橢圓狀分子，親水性的側(cè)鏈和基團多分布于其表面［16］.然而隨豆渣蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，體系中不溶解蛋白逐漸增加，致使體系的表面黏度提高;再者因為當(dāng)豆渣蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于8%時，其分子聚集和相互作用亦加劇，最終聚集為厚厚的索狀進一步形成凝膠，導(dǎo)致PDI和NSI呈降低趨勢.當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)量分?jǐn)?shù)為6%左右時PDI達到最大值，蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%左右時NSI達到最大值，這可能是因為豆渣蛋白特定的分子結(jié)構(gòu)、分子表面和電荷性以及親水性決定的.綜上所述超聲處理可破壞蛋白與纖維之間的結(jié)合程度，使一些蛋白質(zhì)易于溶出，遠遠大于不溶出的量進而抵消變性的程度;再者在增大蛋白提取率的同時豆渣蛋白溶解性變化不大，可說明本試驗采用的超聲波輔助堿溶酸沉提取豆渣蛋白較單一堿溶酸沉法相比并沒出現(xiàn)特別大程度的變性.

3 結(jié)論

1)本研究表明影響蛋白提取率的先后順序為超聲時間、超聲功率、溫度、液料比.

2)豆渣蛋白提取率較高時各參數(shù)取值范圍是液料比20.5 ～22.1 mL·g-1，溫度 51.0 ～53.4 ℃，時間28.8 ～30.7 min，超聲功率 398.1 ～399.3 W，在此條件下可獲得較高的蛋白提取率，經(jīng)多次試驗驗證豆渣蛋白提取率可達到80.19%.

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