TGFβ1T29C多態(tài)性與NSCLC易感性及放射敏感性的相關(guān)性研究

黃友為，周光華

(湖南師范大學(xué)第二附屬醫(yī)院，解放軍第163 醫(yī)院，湖南 長(zhǎng)沙 410003)

轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1 (TGFβ1)是人體內(nèi)一種維持內(nèi)平衡的重要多效細(xì)胞因子，其主要作用是調(diào)節(jié)炎癥、免疫反應(yīng)、細(xì)胞生長(zhǎng)及分化，誘導(dǎo)上皮間質(zhì)化(EMT)發(fā)生和腫瘤血管生成，調(diào)控細(xì)胞增殖和凋亡等。TGFβ1 廣泛表達(dá)于正常組織及腫瘤組織，在早期腫瘤組織中起抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)、遷移，表現(xiàn)為抑癌作用;而在晚期腫瘤中促進(jìn)腫瘤組織生長(zhǎng)，與腫瘤發(fā)展、預(yù)后相關(guān)［1］。當(dāng)TGFβ1 編碼區(qū)第29 位核苷酸由T 突變?yōu)镃，引起密碼子10 編碼的氨基酸從Leu變成Pro，不僅影響了該細(xì)胞因子的血漿含量，還導(dǎo)致其功能的改變［2，3］。許多研究表明，TGFβ1 T29C多態(tài)性與腫瘤疾病密切相關(guān)，尤其集中在乳腺癌、胃癌，但也有不少研究認(rèn)為它們之間無明顯相關(guān)性，隨著越來越多的最新研究加入，TGFβ1 T29C 多態(tài)性與腫瘤相關(guān)性得到肯定。TGFβ1 T29C 多態(tài)性與非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)之間的相關(guān)性研究目前國內(nèi)外報(bào)道不多，本研究通過比較對(duì)照組與NSCLC 組TGFβ1 T29C 等位基因分布情況，探討TGFβ1 T29C單核苷酸多態(tài)性(SNP)與NSCLC 易感性是否存在相關(guān)性，同時(shí)進(jìn)一步研究該位點(diǎn)與NSCLC 的放射敏感性是否存在相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象的選擇

收集60 例(31 例男性，29 例女性，平均年齡為65.6 歲)2013年5月～2013年10月在湖南師范大學(xué)第二附屬醫(yī)院腫瘤中心病理確診為ⅢB 期NSCLC患者的血樣(5mL)，所有患者放療前未行其它治療。同時(shí)收集62 例(32 例男性，30 例女性，平均年齡為62.5 歲)2013年9月在湖南師范大學(xué)第二附屬醫(yī)院進(jìn)行體檢的健康人的血樣(5mL)作為對(duì)照組，對(duì)照組排除患有心血管疾病、腎臟疾病、風(fēng)濕病、糖尿病等其他可能導(dǎo)致假陽性結(jié)果的人群。肺癌組與對(duì)照組成員均為湖南省長(zhǎng)沙地區(qū)漢族人。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法與判斷標(biāo)準(zhǔn)

DNA 提取:采用OMEGA(D3471-02)全血基因組提取試劑盒按照說明書步驟提取外周靜脈血白細(xì)胞DNA。

引物的合成:引物合成及PCR 產(chǎn)物測(cè)序由武漢華大基因公司完成。TGF-β1 T29C 上游引物為:5'-CCC TAT TCA AGA CCA CCC A-3'，下游引物為:5'-GCC AGT CAC TTC CTA CCC G-3'。

目的基因擴(kuò)增:PCR 反應(yīng)體系為50 μL，包括ddH2O 37.5 μL，10mM dNTP 1μL，10 ×PCR buffer 5 μL，25mM Mgcl2 3 μL，上、下游引物各1 μL，DNA模板1 μL。PCR 擴(kuò)增條件:94℃變性1min，58℃退火50sec，72℃延伸1min30sec，進(jìn)行40 個(gè)循環(huán)，然后72℃延伸10min 后4℃保溫。最后PCR 產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

PCR 產(chǎn)物測(cè)序步驟:①測(cè)序DNA 模板的純度與用量:DNA 純度:OD260/OD280 =1.6 ～2.0。使用酒精/NaAc 法在測(cè)序前對(duì)PCR 產(chǎn)物進(jìn)行純化，然后再進(jìn)行DNA 測(cè)序的PCR 反應(yīng)。②質(zhì)粒和PCR 產(chǎn)物測(cè)序:反應(yīng)體系為20μL，包括引物1μL，DNA 模板1μL，BigDye 8μL，滅菌去離子水10μL。測(cè)序PCR熱循環(huán)條件:96℃1 min→(96 ℃10 sec→50 ℃5 sec→60 ℃4 min)×25 個(gè)循環(huán)→4 ℃保溫。③測(cè)序產(chǎn)物純化:20 μL 反應(yīng)體系，酒精/EDTA/NaAc 法純化后使用ABI3730xl 測(cè)序儀測(cè)序。

觀察指標(biāo):TGFβ1T29C 基因TT、TC、CC 基因型及T、C 等位基因頻率分布情況。并統(tǒng)計(jì)TGFβ1 29位點(diǎn)多態(tài)性在肺癌組與對(duì)照組的分布，分析肺癌組TGFβ1 29 位點(diǎn)多態(tài)性與放射敏感性的關(guān)系 依據(jù)放療前后患者胸部CT 檢查測(cè)量放療前后腫瘤大小，計(jì)算腫瘤縮小百分比。療效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)按照WHO 制定的標(biāo)準(zhǔn)分為有效和無效兩組，有效組包括完全緩解(CR)和部分緩解(PR)，無效組包括穩(wěn)定(SD)和進(jìn)展(PD)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用雙側(cè)卡方檢驗(yàn)比較NSCLC 組與對(duì)照組的TGFβ1 基因29 位點(diǎn)頻率分布差異，用以評(píng)估TGFβ1 SNP 與NSCLC 易感性的相關(guān)性。統(tǒng)計(jì)NSCLC 患者放療前后腫瘤縮小百分比，應(yīng)用雙側(cè)卡方檢驗(yàn)比較NSCLC 患者TGFβ1 基因29 位點(diǎn)頻率分布與療效的相關(guān)性，用以評(píng)估TGFβ1 SNP 與NSCLC 放射敏感性的相關(guān)性。所有統(tǒng)計(jì)分析采用SHEsis 和SPSS 13.0 統(tǒng)計(jì)軟件處理。

2 結(jié)果

2.1 Hardy-weinberg 平衡檢驗(yàn)結(jié)果

結(jié)果發(fā)現(xiàn)肺癌組和對(duì)照組χ2值分別為0.258和0.003(P ＞0.05)，符合Hardy-weinberg 平衡，具有群體代表性。

2.2 TGFβ1 T29C PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖及各表型測(cè)序圖

圖1 擴(kuò)增膠圖，1%瓊脂糖凝膠電泳，3μL 上樣量，MARKER 為DL2000 PLUS

圖2 TGFβ1 T29C 各表型測(cè)序圖(分別為CC、TC、TT 型)

2.3 TGFβ1 基因29 位點(diǎn)多態(tài)性在NSCLC 組和對(duì)照組的分布

由表1 可見，NSCLC 組和對(duì)照組的T 與C 等位基因頻率分別為51.7%、58.1%和48.3%、41.9%。NSCLC 組的T 等位基因頻率略低于對(duì)照組，C 等位基因頻率略高于對(duì)照組，但經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析兩組無顯著性差異(χ2=1.008 P ＞0.05)。

表1 TGFβ1 基因29 位點(diǎn)等位基因在非小細(xì)胞肺癌組和對(duì)照組的分布頻率

兩組的TGFβ1 基因型分布見表2。NSCLC 組的TT、TC、CC 基因型頻率分別為28.3%、46.7%及25.0%。對(duì)照組的TT、TC、CC 基因型頻率分別為33.9%、48.4%及17.7%。NSCLC 組中CC 純合子基因型的頻率要高于正常組，TT 基因型要低于健康對(duì)照組，但兩組之間的差異尚不顯著(P ＞0.05)。CC 基因型相對(duì)于TT 基因型患肺癌的OR(相對(duì)風(fēng)險(xiǎn)度)為0.59(95% CI:0.22 ～1.63)，TC 基因型相對(duì)于TT 基因型患肺癌的OR 為0.87(95% CI:0.38～1.97)，C 等位基因OR 為1.30(95% CI:0.78 ～2.15)。

表2 TGFβ1 基因29 位點(diǎn)基因型分布情況

2.4 NSCLC 組TGFβ1 基因29 位點(diǎn)多態(tài)性與放射敏感性的關(guān)系

從表3 可以看出，不同TGFβ1 基因29 位點(diǎn)基因型的NSCLC 患者對(duì)放療的有效率不盡相同，TC基因型的患者對(duì)放療的有效率低，僅為28.6%，其次為CC 基因型，為50.0%，而TT 基因型的患者對(duì)放療的有效率較高，為64.7%，三者之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=6.125 P ＜0.05)。

表3 不同基因型非小細(xì)胞肺癌患者放療的療效比較

3 討論

TGFβ1 自1972年發(fā)現(xiàn)以來，其相關(guān)研究取得了很大進(jìn)展。TGFβ1 基因定位于19q13.1，cDNA 全長(zhǎng)2745 bp，含7 個(gè)外顯子和6 個(gè)內(nèi)含子［4］。TGFβ 主要通過TGFβ/SMAD 信號(hào)通路發(fā)揮作用，TGFβ(TGFβ1、TGFβ2、TGFβ3)在多數(shù)細(xì)胞類型中與膜受體TGFβR1(ALK5)、TGFβR2 結(jié)合，活化的TGFβ 受體使其位于羧基端的絲氨酸磷酸化，SMAD 蛋白(SMAD2、SMAD3、SMAD4)就形成二聚體，直接轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞核，行使轉(zhuǎn)錄因子的功能，最終表現(xiàn)出細(xì)胞生長(zhǎng)抑制及凋亡;在內(nèi)皮細(xì)胞中，TGFβ 與ALK1 膜受體結(jié)合，激活胞內(nèi)SMAD1、SMAD5 作用于細(xì)胞核，從而影響細(xì)胞增殖、遷移［5］。此外，TGFβ 還存在非SMAD 信號(hào)通路，包括Erk，JNK/p38 ，RhoA，PI3K/AKT 等［6］。TGFβ1 SNP 與腫瘤易感性的相關(guān)性研究結(jié)果一直處于矛盾狀態(tài)。不少研究顯示，TGFβ1 29 位點(diǎn)為C/C 型的TGFβ1 分泌量明顯高于T/T型［3，7］，TGFβ1 T29C/C 型患腫瘤的風(fēng)險(xiǎn)顯著升高［5，8，9］。然而也有學(xué)者得到相反的結(jié)果［3，10］，這種矛盾的現(xiàn)象可能是TGFβ 雙重作用所致，即TGFβ 減少早期腫瘤的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展［3］。不同區(qū)域、人群之間TGFβ1 T29C 基因型分布各不相同［7，11］，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，湖南地區(qū)漢族人TGFβ1 T29C 基因型分布情況與其他省份地區(qū)相差不大［12］;湖南地區(qū)漢族人TGFβ1 T29C 的多態(tài)性與NSCLC 的易感性之間無顯著相關(guān)性，與Lu Bai 等人［13］研究遼寧省漢族人群TGFβ1 T29C 的多態(tài)性與NSCLC 易感性的結(jié)果相同。

TGFβ1 T29C 多態(tài)性與肺癌進(jìn)展及預(yù)后存在相關(guān)性，Xianglin Yuan 等人回顧性研究發(fā)現(xiàn)TGFβ1 T29C CT/CC 基因型NCSLC 患者有更差的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移率及頭部轉(zhuǎn)移率，同時(shí)他們通過慢病毒轉(zhuǎn)染A549和PC9 細(xì)胞體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)C 等位基因型對(duì)比T 型有更強(qiáng)的活力及侵襲性，TGFβ1 29C 基因型細(xì)胞具有很強(qiáng)的轉(zhuǎn)移及侵襲潛能［14］。 Mukaddes ColakogμLlari 等人［15］進(jìn)行土耳其人群肺癌患者與健康人對(duì)照臨床研究發(fā)現(xiàn)，TGFβ1 的T29C 多態(tài)性與肺癌患者的生存時(shí)間密切相關(guān)，T/T 基因型患者較C/C 基因型患者生存時(shí)間長(zhǎng)。C 基因攜帶者具有更強(qiáng)的進(jìn)展風(fēng)險(xiǎn)及更差的預(yù)后，可能導(dǎo)致C 基因攜帶者對(duì)放療療效不佳。本研究結(jié)果表明，TGFβ1 29 位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性與NSCLC 患者的放射敏感性具有相關(guān)性，其中TT 患者對(duì)放療敏感，而CT 和CC 患者對(duì)放療敏感性較差。但限于本實(shí)驗(yàn)病例數(shù)較少，仍需進(jìn)一步大樣本臨床研究驗(yàn)證，以期通過檢測(cè)放療患者的TGFβ1 T29C 不同基因型的方法來選擇不同劑量強(qiáng)度，以達(dá)到個(gè)體化治療的目的。

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