高磁場響應性蛋白偶聯(lián)磁性微球的制備及其在藥物-蛋白結(jié)合常數(shù)測定中的應用

潘曉霞

(天津大學 藥物科學與技術學院，天津 300072)

藥物進入體內(nèi)一般都要通過血漿的貯存和轉(zhuǎn)運，到達作用部位，發(fā)生藥理作用。血清白蛋白是血漿中含量最豐富的載體蛋白，藥物與白蛋白之間的作用，影響藥物在體內(nèi)的分布、代謝與排泄，從而影響藥物的作用強度和時間。因此，藥物與白蛋白相互作用的研究無論對于新藥研發(fā)還是指導臨床合理用藥都具有重要意義［1-3］。

常用的研究藥物與白蛋白相互作用的方法有平衡透析法、超濾法、紫外-可見吸收光譜法、熒光光譜法、圓二色譜法以及親和色譜法和核磁共振法等［3-5］。其中平衡透析法、超濾法等傳統(tǒng)方法存在步驟繁瑣、藥物在透析膜或超濾膜表面的吸附問題［6］;紫外-可見吸收光譜法、熒光光譜法、圓二色譜法等光譜學方法［7］要求受體蛋白有較高的純度，對于一些昂貴的受體蛋白研究很不利，且蛋白與藥物的結(jié)合時間和結(jié)合溫度難以準確控制。親和色譜法是將蛋白固定于載體上，固定化的生物高聚物具有良好的穩(wěn)定性和恒定的結(jié)合行為，但不易表征，且非生理實驗條件可能改變蛋白質(zhì)的構象和蛋白與藥物的結(jié)合行為［8］。核磁共振法能提供大量蛋白結(jié)構信息，復雜程度也最高，但此法不適宜定量研究，且解析實驗數(shù)據(jù)非常耗時［9-10］。

近年來，磁性微球在生物化學和生物技術學方面的應用受到廣泛關注。用修飾蛋白的磁性微球研究藥物與蛋白的相互作用，通過測定游離的藥物濃度，計算藥物與蛋白的結(jié)合常數(shù)，這種方法高效、快速［11-12］。但是使用的磁性微球磁響應性低，對藥物的非特異性吸附明顯;蛋白在磁性微球上的鍵合量低，需要使用較低濃度的藥物，不利于藥物的檢測;而且缺乏對藥物-蛋白作用模式的研究。針對以上問題，本課題以與人血清白蛋白(HSA)高度同源的牛血清白蛋白(BSA)為模型蛋白［13］，通過對磁性微球基質(zhì)的篩選、磁性微球與BSA 偶聯(lián)條件的優(yōu)化及藥物與BSA 的結(jié)合、洗脫條件的研究，建立了一種新的用BSA 包覆的磁性微球用于測定藥物-白蛋白結(jié)合常數(shù)的方法。該方法克服了前人工作中磁性微球磁響應低、對藥物非特異性吸附強及蛋白在磁性微球上鍵合量低的缺點，并且對藥物與蛋白的作用模式作了進一步探討。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

牛血清白蛋白，分子生物學級，純度98%;1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC);N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)、戊二醛(純度50%)、吡啶、甘氨酸、考馬斯亮藍G250 均為分析純;布洛芬、色氨酸、羅氟司特、安立生坦、瑞替加濱均為醫(yī)藥級;表面氨基化的四氧化三鐵磁性微球(Fe3O4-MB)、脲醛樹脂磁性微球(UF-MB)、聚苯乙烯磁性微球(PSMB)均為色譜純。

島津高效液相色譜儀(包括LC-600 恒流泵，SPD-6AV 紫外檢測器和N2000 色譜工作站);島津UV-2450 紫外-可見分光光度計;C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)。

1.2 BSA 包覆的磁性微球的制備

分別采用EDC/NHS 和戊二醛作為偶聯(lián)劑，將BSA 偶聯(lián)至氨基修飾的磁性微球上。

1.2. 1 EDC/NHS 法 100 mg 磁性微球分散于2 mL 磷酸鹽緩沖液(PBS 緩沖鹽，10 mmol/L，pH 7.4)中，加入50 mg EDC，25 mg NHS 和適量BSA，室溫振蕩反應2 h。磁分離，保留上清，磁性微球用PBS 洗滌3 次。

1.2.2 戊二醛法 100 mg 磁性微球用吡啶緩沖液(10 mmol/L，pH 5.5)洗滌后，分散于2 mL 含5%戊二醛的吡啶緩沖液中，37 ℃反應5 h。用吡啶緩沖液洗滌磁性微球3 次;再將磁性微球分散于2 mL 吡啶緩沖液中，加入適量BSA，37 ℃反應16 h。磁分離，收集上清，磁性微球加入1 mL 甘氨酸終止液(1 mol/L，pH 8.0)，于37 ℃反應1 h，用PBS 溶液洗滌3 次。

1.3 布洛芬與MB-BSA 上的相互作用

1.3.1 平衡吸附時間的考察在1.5 mL 的離心管中，加入200 μL MB-BSA(50 mg/mL)和200 μL 布洛芬(10 μmol/L)，37 ℃振蕩反應不同時間，磁分離，上清用高效液相色譜(HPLC)檢測布洛芬的濃度。

1.3.2 洗脫條件的考察布洛芬與MB-BSA 作用后，收集上清，用HPLC 檢測布洛芬的含量;用洗脫液將布洛芬洗脫后，將MB-BSA 再次與布洛芬作用，如此重復6 次。

1.3.3 結(jié)合常數(shù)的測定將布洛芬用PBS 緩沖鹽溶解并稀釋至不同濃度(1.0 ～40.0 μmol/L)。在1.5 mL 的離心管中加入 200 μL MB-BSA(50 mg/mL)和200 μL 一系列不同濃度的布洛芬，37 ℃振蕩反應，磁分離，上清用高效液相色譜(HPLC)檢測布洛芬的濃度，通過羅森塔爾方程［11-12］計算布洛芬與BSA 的結(jié)合常數(shù)。

1.4 藥物和MB-BSA 的結(jié)合

步驟同1.5.2 節(jié)，測定色氨酸、安立生坦、瑞替加濱和羅氟司特4 種藥物與BSA 的結(jié)合常數(shù)。

1.5 分析方法

1.5.1 蛋白鍵合量的測定采用Bradford 蛋白定量法，通過考馬斯亮藍G250 與蛋白的顯色反應，測定鍵合前后上清液中的蛋白含量的變化，計算磁性微球上BSA 的鍵合量。

1.5.2 布洛芬的含量測定 HPLC 檢測條件C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相為甲醇/pH 2.5 的磷酸水溶液(85/15)，速流1 mL/min，檢測波長222 nm，進樣量20 μL。

1.5.3 四種藥物的含量測定

1.5.3.1 色氨酸流動相為甲醇/pH 2.5 的磷酸水溶液(35/65)，檢測波長225 nm。

1.5.3.2 安立生坦流動相為甲醇/pH 2.5 的磷酸水溶液(75/25)，檢測波長220 nm。

1.5.3.3 瑞替加濱流動相為甲醇/pH 2.5 的磷酸水溶液(60/40)，檢測波長220 nm。

1.5.3.4 羅氟司特流動相為甲醇/pH 2.5 的磷酸水溶液(80/20)，檢測波長213 nm。

2 結(jié)果與討論

2.1 磁性載體的選擇

藥物與BSA 結(jié)合的同時，也會在載體磁性微球上產(chǎn)生非特異性吸附。磁性微球?qū)λ幬锏姆翘禺愋晕皆礁?，藥物與BSA 之間的特異性吸附越不明顯，實驗誤差就越大。因此，應當保證盡量低的非特異性吸附。對幾種常用的商品化的磁性微球——UF-MB、PS-MB 和Fe3O4-MB 和對瑞替加濱、布洛芬、色氨酸3 種藥物的非特異性吸附進行了考察，結(jié)果見圖1。

圖1 不同基質(zhì)磁性微球?qū)Σ煌幬锏目瞻孜紽ig.1 Nonspecific binding of different drugs to different MB

由圖1 可知，UF-MB 和PS-MB 對布洛芬和色氨酸的非特異性吸附較低，而對瑞替加濱的非特異性吸附較明顯;Fe3O4-MB 對3 種藥物的非特異性吸附均較低，在10% 以下。在pH 7.4 的環(huán)境下，磁性微球表面的氨基帶正電，瑞替加濱、布洛芬和色氨酸分別帶正電、負電以及不帶電，但是3 種磁性微球?qū)Σ悸宸液蜕彼岬姆翘禺愋晕骄^弱，說明藥物與磁性微球表面的氨基之間的靜電作用不是引起非特異性吸附的主要原因。由于UF-MB 內(nèi)部較疏松，骨架中含有豐富的胺、酰基和羥基，PS-MB 也含有疏水性骨架，而瑞替加濱的極性最弱，藥物分子易透過外面的包覆層與骨架通過疏水作用結(jié)合，導致了較高的吸附量;Fe3O4-MB 只能通過表面包覆的硅羥基和鐵羥基與藥物發(fā)生作用，因而對藥物吸附較少。此外Fe3O4-MB 制備簡單，磁響應性高(飽和磁化率＞70 emu/g)，比表面積大，有利于磁分離及進一步的蛋白修飾，因此，實驗中選擇四氧化三鐵磁性微球為載體。

2.2 蛋白鍵合量

EDC 與NHS 聯(lián)合使用，與蛋白上的羧基反應，形成活性中間體，該活性中間體與磁性微球上的氨基脫水形成酰胺鍵。戊二醛則是通過分子兩端的醛基分別與蛋白和磁性微球上的氨基形成亞胺，從而將蛋白固定于微球上，結(jié)果見圖2。

由圖2 可知，當BSA 加入量較少時，蛋白鍵合量較低，但體系中BSA 幾乎完全與磁球偶聯(lián)，蛋白利用率接近100%;隨著BSA 用量的增加，蛋白鍵合量隨之增加，而蛋白利用率也隨之降低;當BSA 與磁性微球的質(zhì)量比達到100 μg/mg 左右時，鍵合量達到飽和，不再增加。EDC 法的蛋白最大鍵合量為44 μg/mg，蛋白利用率為44%;戊二醛法的最大鍵合量為49 μg/mg，蛋白利用率為49%。兩種方法均比報道顯著提高［11］，使得研究藥物-蛋白相互作用時可以使用較少的磁性微球，減少非特異性吸附的影響;同時可以使用較高的藥物濃度，提高分析方法的準確度。兩種方法的最大鍵合量相近，因EDC 法步驟簡單。因此，實驗中選擇的蛋白偶聯(lián)條件為:用EDC/NHS 作為偶聯(lián)劑，BSA 與磁性微球的質(zhì)量比為100 μg/mg。

圖2 EDC/NHS 法(a)和戊二醛法(b)的蛋白鍵合量Fig.2 Binding capacity of BSA to MB by EDC/NHS method (a)and glutaraldehyde method (b)

2.3 布洛芬與MB-BSA 的作用

BSA 的晶體結(jié)構有3 個類似的結(jié)構域:I、II、III，每個結(jié)構域有2 個亞域結(jié)構A 和B，這些亞域結(jié)構被命名為IA、IB、IIA、IIB、IIIA 和IIIB，而藥物分子主要結(jié)合在亞域結(jié)構IIA 和IIIA，其中，IIIA 中的結(jié)合空腔最活躍，布洛芬、色氨酸等藥物是在結(jié)構域IIIA 結(jié)合的典型藥物［14-15］。本課題以布洛芬為模型藥評價該方法，研究布洛芬與MB-BSA 的平衡作用時間、布洛芬在MB-BSA 上的洗脫及MB-BSA 的重復利用性，并測定布洛芬與BSA 的結(jié)合常數(shù)。

2.3.1 MB-BSA 對布洛芬的吸附時間布洛芬與空白磁性微球和BSA 包覆的磁性微球作用前后的上清液色譜圖，結(jié)果見圖3。

由圖3 可知，BSA 包覆的磁性微球?qū)Σ悸宸揖哂忻黠@的吸附作用，而空白磁性微球?qū)Σ悸宸規(guī)缀鯖]有吸附作用。

圖3 對照組和實驗組磁性微球與布洛芬作用前后上清中布洛芬液相色譜圖Fig.3 HPLC analysis of ibuprofen of collected supernatant from control MB and MB-BSA

以布洛芬為模型藥物，考察了MB-BSA 與藥物的作用時間對結(jié)合量的影響，結(jié)果見圖4。

圖4 MB-BSA 與布洛芬作用時間對結(jié)合量的影響Fig.4 Equilibrium binding time of ibuprofen to MB-BSA

由圖4 可知，布洛芬在20 min 之前與MB-BSA迅速作用，并在20 min 達到吸附平衡。因此，固定MB-BSA 與藥物的作用時間為20 min。

2.3.2 洗脫條件及MB-BSA 的重復利用性以布洛芬為模型藥物，研究藥物與BSA 的相互作用模式，結(jié)果見圖5。

圖5 用不同溶液洗脫MB-BSA 對布洛芬的相對吸附量的影響Fig.5 Relative binding amount of ibuprofen on MB-BSA of repeated use

由圖5 可知，不洗脫時，隨著重復使用次數(shù)的增加，MB-BSA 對布洛芬的結(jié)合量逐漸降低，在第4 次利用時，吸附量幾乎為零，說明此時MB-BSA 對布洛芬的吸附達到了飽和。用純甲醇洗脫后，MB-BSA對布洛芬的吸附量幾乎沒有變化;用緩沖鹽洗脫后，MB-BSA 對布洛芬的相對吸附量約為80%。這說明BSA 與布洛芬之間存在疏水作用力和靜電作用力，其中疏水作用力占主導。當用甲醇作為洗脫劑時，甲醇破壞了BSA 與布洛芬之間的疏水作用力，布洛芬從BSA 上完全解吸附;緩沖鹽破壞了BSA 與布洛芬之間的靜電作用，而疏水作用力仍存在，因此，布洛芬從BSA 上部分解吸附。另一方面，用甲醇作為洗脫劑并不影響MB-BSA 的重復利用，與文獻中有機溶劑會影響B(tài)SA 活性的報道［16］并不相符，這是由于洗脫后BSA 在緩沖鹽體系中又復性的緣故。用甲醇作為洗脫劑對MB-BSA 進行重復利用6 次，磁性微球?qū)λ幬锏奈綆缀醪蛔?，說明該MB-BSA可以重復利用。

2.3.3 布洛芬與BSA 的結(jié)合常數(shù)藥物與蛋白的作用是一個動態(tài)過程，用S 代表蛋白上的位點，D 代表藥物小分子，DB代表蛋白-藥物分子復合物。假設藥物與蛋白上的結(jié)合位點進行可逆結(jié)合，并且每個結(jié)合位點完全相同，且互不影響，則有:

當藥物與蛋白的作用達到平衡時，藥物與蛋白的結(jié)合常數(shù)Ka為:

假設蛋白上所有活性位點的濃度為Bmax，則整理式(2)可得羅森塔爾方程:

［DB］即結(jié)合藥物的濃度，［D］為游離藥物的濃度，用［DB］/［D］對［DB］作圖，斜率即為Ka值。

圖6 和圖7 分別為布洛芬在MB-BSA 上的飽和吸附曲線及羅森塔爾曲線?？梢杂嬎悴悸宸业腒a值為0.71 ×106L/mol，比Vowles 等［17］報道的數(shù)值0.47 ×106L/mol 大，比Kober 等［18］報道的數(shù)值1.3×106L/mol 小，與測定方法有關。

2.4 藥物與BSA 的結(jié)合常數(shù)

各藥物在MB-BSA 上的飽和吸附曲線圖，結(jié)果見圖6。

由圖6 可知，隨著藥物濃度的增加，吸附量隨之增加并趨于飽和。

圖6 不同藥物在MB-BSA 上的飽和吸附曲線Fig.6 Adsorption curve of different drugs on MB-BSA

不同藥物的羅森塔爾曲線圖，結(jié)果見圖7。

圖7 不同藥物的羅森塔爾曲線Fig.7 Rosenthal plots obtained from incubation of different drugs with MB-BSA

由圖7 可知，色氨酸及3 類新藥安立生坦、瑞替加濱、羅氟司特與BSA 的結(jié)合常數(shù)與布洛芬的結(jié)合常數(shù)均在一個數(shù)量級上。

3 結(jié)論

建立了一種用BSA 包覆的Fe3O4磁球用于測定藥物與白蛋白結(jié)合常數(shù)的方法，并測定了5 種藥物與牛血清白蛋白的結(jié)合常數(shù)。通過選用對藥物非特異性吸附小的Fe3O4磁性微球作為載體和優(yōu)化蛋白鍵合方法，提高了方法準確度。用甲醇作為洗脫劑洗脫藥物-蛋白復合物，可以實現(xiàn)對該磁性微球的重復利用。該方法快速、簡單，對于新藥研發(fā)和指導臨床合理用藥都具有重要意義。

［1］ 高保安，陳建明. 藥物與白蛋白相互作用的研究進展［J］.藥學實踐雜志，2008，26(4):241-244.

［2］ Bohnert T，Gan L S.Plasma protein binding:From discovery to development［J］. Journal of Pharmaceutical Sciences，2013，102(9):2953-2994.

［3］ Zhang F L，Xue J P，Shao J W，et al.Compilation of 222 drugs’plasma protein binding data and guidance for study designs［J］. Drug Discovery Today，2012，17(9/10):475-485.

［4］ 周大煒，李樂道，李發(fā)美.藥物蛋白結(jié)合作用的分析方法研究［J］.色譜，2004，22(2):116-120.

［5］ 劉睿，謝躍生，潘桂湘，等. 藥物血漿蛋白結(jié)合率測定方法的研究進展［J］. 天津中醫(yī)藥，2007，24(6):526-528.

［6］ Barré J，Chamouard J M，Houin G，et al.Equilibrium dialysis，ultrafiltration，and ultracentrifugation compared for determining the plasma-protein-binding characteristics of valproic acid［J］. Clinical Chemistry，1985，31(1):60-64.

［7］ Tajmir-Riahi H A.An overview of drug binding to human serum albumin:Protein folding and unfolding［J］.Scientia Iranica，2007，14(2):87-95.

［8］ Baynham M T，Patel S，Moaddel R，et al.Multidimensional on-line screening for ligands to the α3β4neuronal nicotinic acetylcholine receptor using an immobilized nicotinic receptor liquid chromatographic stationary phase［J］.Journal of Chromatography B，2002，772(1):155-161.

［9］ Meyer B，Peters T. NMR spectroscopy techniques for screening and identifying ligand binding to protein receptors［J］.Angewandte Chemie International Edition，2003，42(8):864-890.

［10］ Goldflam M，Tarragó T，Gairí M，et al. NMR studies of protein-ligand interactions［J］. Methods in Molecular Biology，2012，831:233-259.

［11］MarszaM P，Bucińsk A.A protein-coated magnetic beads as a tool for the rapid drug-protein binding study ［J］.Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis，2010，52:420-424.

［12］MarszaM P，Bucińsk A，Kruszewski S. A new approach to determine camptothecin and its analogues affinity to human serum albumin［J］. Pharmacokinetics，Pharmacodynamics and Drug Metabolism，2011，100:1142-1146.

［13］Gelamo E L，Silva C H P T，Imasato H，et al. Interaction of bovine (BSA)and human (HSA)serum albumins with ionic surfactants:Spectroscopy and modeling ［J］.Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Protein Structure and Molecular Enzymology，2002，1594(1):84-89.

［14］謝余寰.酚酸類及生物堿類藥物小分子和牛血清蛋白相互作用研究［D］.桂林:廣西師范大學，2008.

［15］周大煒.藥物-蛋白結(jié)合作用的HPCE 和HPLC 法研究［D］.沈陽:沈陽藥科大學，2003.

［16］王秋玲，潘曉霞，呂波.磁性微球用于蛋白-抑制劑復合物解離常數(shù)的快速測定［J］. 應用化工，2013，42(5):950-954.

［17］Vowles D T，Marchant B.Protein binding of ibuprofen and its relationship to drug interaction［J］. British Journal of Clinical Practice Supplement，1979，6:13-19.

［18］Kober A，Sjoholm I.The binding sites on human serum albumin for some nonsteroidal anti-inflammatory drugs［J］.Molecular Pharmacology，1980，18:421-426.