馬蘭葉總黃酮的提取及其含量的測定

顧霞敏，許海丹，梁丹霞

(臺(tái)州學(xué)院 醫(yī)藥化工學(xué)院，浙江 臨海 317000)

馬蘭［Kalimeris indica (Linn.)Sch.］為菊科馬蘭屬多年生草本植物，中國南方各地有分布。在我國，部分地區(qū)馬蘭作為草本花卉栽培，是兼有食用、藥用的多用經(jīng)濟(jì)植物。馬蘭中營養(yǎng)豐富，含有氨基酸、黃酮、多糖、礦物質(zhì)等多種營養(yǎng)成分［1-2］，具有鎮(zhèn)痛、抗炎等功效［3］。黃酮類化合物具有抗氧化、抗病毒、增強(qiáng)人體免疫能力等［4-5］多種生物活性。目前，國內(nèi)外對馬蘭黃酮化合物的研究報(bào)道相對還較少，報(bào)道中，馬蘭總黃酮含量的測定多為NaNO2-Al(NO3)3-NaOH 體系的紫外分光光度法［6-9］，該法存在顯色繁瑣、操作復(fù)雜、檢測時(shí)間長等不足。

本實(shí)驗(yàn)建立AlCl3顯色法測定馬蘭葉總黃酮的含量，并以黃酮提取率為考察指標(biāo)，優(yōu)化馬蘭葉總黃酮的超聲提取工藝，從而為馬蘭總黃酮進(jìn)一步開發(fā)提供指導(dǎo)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料與儀器

新鮮馬蘭葉;蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(批號(hào)100080-200707)，來自中國藥品食品檢定研究院;甲醇、乙醇、石油醚(60 ～90 ℃)、AlCl3·6H2O 均為分析純。

UV-2401PC 島津紫外分光光度計(jì);中草藥粉碎機(jī);RE-52AA 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器;KQ-500DE 型醫(yī)用數(shù)控超聲波清洗器。

1.2 馬蘭葉的預(yù)處理

新鮮馬蘭葉用清水洗凈，105 ℃殺青20 min，80 ℃下真空干燥至恒重，粉碎過60 目篩。將干燥粉末分批于索氏提取器中，用石油醚脫脂處理。脫脂后，揮去石油醚，即為馬蘭葉脫脂粉末，脫脂粉末質(zhì)量約占原干燥粉末60%。將脫脂粉末保存于干燥器中，備用。

1.3 溶液制備

1.3.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 精密稱取于120 ℃干燥至恒重的蘆丁50. 0 mg，加甲醇適量，超聲溶解，放冷，用甲醇定容至50 mL，即為1 mg/mL 的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.3.2 樣品溶液的制備 稱取馬蘭葉脫脂粉末1.0 g 于錐形瓶中，加90%乙醇50 mL，70 ℃超聲提取2 次，每次40 min［10］。抽濾，合并兩次濾液，減壓濃縮除去溶劑，用甲醇溶解，并定容至25 mL。

1.4 馬蘭葉總黃酮含量的測定

移取一定量的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣品溶液于10 mL 容量瓶中，加入1%AlCl3-甲醇溶液2 mL，用甲醇稀釋至刻度。搖勻、顯色15 min 后，以空白試劑作參比，在418 nm 波長處讀取吸光度。

1.5 馬蘭葉總黃酮的提取

稱取1.0 g 馬蘭葉脫脂粉末于錐形瓶中，加入試劑浸泡30 min，使粉末充分浸潤，進(jìn)行超聲提取。提取液減壓濃縮除去溶劑，用甲醇溶解并定容至25 mL。馬蘭葉總黃酮提取率按下式計(jì)算:

2 結(jié)果與討論

2.1 馬蘭葉總黃酮含量的測定方法

2.1.1 檢測波長的選擇 分別移取1 mL 的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品溶液，按實(shí)驗(yàn)方法顯色15 min 后，在300 ～600 nm 進(jìn)行掃描，見圖1。

圖1 蘆丁與樣品溶液吸收譜圖Fig.1 Absorption spectra of rutin and sample solution 1.蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液;2.樣品溶液

由圖1 可知，確定檢測波長為418 nm。

2.1.2 顯色劑用量的確定 按實(shí)驗(yàn)方法分別取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液與樣品溶液各1 mL，分別加入顯色劑1% AlCl3-甲醇溶液0 ～9 mL(間隔1 mL)，用甲醇定容至10 mL，在418 nm 處測定吸光度值。結(jié)果表明，在0 ～2 mL，吸光度值隨顯色劑用量的增加而顯著增加，2 ～9 mL 吸光度值變化幅度不大。因此，確定顯色劑用量為2 mL。

2.1.3 顯色時(shí)間的選擇 各取標(biāo)準(zhǔn)溶液與樣品溶液1 mL，加入2 mL 顯色劑，甲醇定容至10 mL。每隔1 min 在418 nm 處測定吸光度。結(jié)果表明，樣品溶液與標(biāo)準(zhǔn)溶液，顯色15 min 后，吸光度幾乎維持穩(wěn)定。

2.1.4 線性關(guān)系 把蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋成表1 中的濃度，按實(shí)驗(yàn)方法，取1 mL 檢測吸光度。以吸光度A 為縱坐標(biāo)，濃度C 為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為:A =17.355C +0.002 1，R2=0.998 6，表明濃度在0.004 ～0.100 mg/mL，有良好的線性關(guān)系。

表1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度與吸光度Table 1 Rutin standard solution concentration and absorbency

2.1.5 方法學(xué)驗(yàn)證

2.1.5.1 精密度 取樣品溶液5 份，按上述實(shí)驗(yàn)確定的參數(shù)測定吸光度，得RSD =0.487%，表明該方法精密度良好。

2.1.5.2 穩(wěn)定性 取1 份樣品溶液，顯色15 min后，分別測定在0 ～90 min(間隔10 min)內(nèi)吸光度。RSD=0.407%，表明該顯色反應(yīng)至少在90 min 內(nèi)是穩(wěn)定的。

2.1.5.3 重復(fù)性 對同一批馬蘭葉脫脂粉末5 份，按上述方法提取、分析，得RSD =2.07%，說明該方法重復(fù)性良好。

2.1.5.4 加樣回收率 取5 份樣品溶液各1 mL，分別添加已知含量的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液，測定總黃酮量。得平均加樣回收率為97.4%，RSD=0.96%。

2.2 馬蘭葉總黃酮超聲提取工藝優(yōu)化

2.2.1 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果 因素水平見表2，結(jié)果見表3。由表3 可知，影響馬蘭葉總黃酮超聲提取的主次順序?yàn)?A(提取溫度)＞C(乙醇體積分?jǐn)?shù))＞B(提取時(shí)間)＞D(料液比)，最佳方案為A3B3C2D2，即提取溫度50 ℃，提取50 min，乙醇體積分?jǐn)?shù)80%，料液比1/50(g/mL)。

表2 正交因素水平Table 2 Factors and levels of the orthogonal design

表3 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 3 Orthogonal experimental results

2.2.2 優(yōu)選條件的驗(yàn)證 在最佳條件下超聲提取馬蘭葉總黃酮，平行操作3 次，平均提取率為7.01%，RSD =1.64%?？梢夾3B3C2D2條件下，黃酮提取率均高于表3 中的每項(xiàng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，該條件為最佳選擇。

3 結(jié)論

(1)建立了以1% AlCl3-甲醇溶液為單一顯色劑，紫外分光光度法快速測定馬蘭葉總黃酮含量的方法，該方法簡便、結(jié)果可靠。

(2)馬蘭葉總黃酮的超聲提取最優(yōu)條件為:乙醇體積分?jǐn)?shù)80% 提取，料液比1 ∶50(g/mL)，在50 ℃提取50 min。在此條件下，總黃酮的提取率為7.01%。

［1］ 林彬彬，王剛，劉勁松，等.馬蘭化學(xué)成分研究［J］. 安徽中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2008，27(6):48-49.

［2］ 夏海濤，劉玉芬，董超男，等. 響應(yīng)曲面法優(yōu)化野生馬蘭頭總黃酮的提取工藝［J］.食品科學(xué)，2011，32(24):191-195.

［3］ 姚曉偉，余甜女，鄭小云，等. 馬蘭干浸膏鎮(zhèn)痛抗炎作用的實(shí)驗(yàn)研究［J］.海峽藥學(xué)，2010，22(2):34-35.

［4］ 湯須崇，葉靜，徐偉，等. 貓須草總黃酮的超聲提取工藝［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2011，37(11):229-234.

［5］ 李穎暢，孟憲軍，李小紅.大孔樹脂純化藍(lán)莓葉總黃酮的工藝研究［J］. 食品與發(fā)酵工業(yè)，2008，34(1):133-137.

［6］ 鄭和權(quán)，周守標(biāo)，朱肖鋒，等. 馬蘭總黃酮提取工藝優(yōu)化及不同部位含量測定［J］. 食品與發(fā)酵工業(yè)，2008，34(11):185-189.

［7］ 張燦，張海暉，武妍，等. 馬蘭黃酮類化合物的提取及其抗氧化活性［J］.農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào)，2011，27(14):307-311.

［8］ 王貴軍，胡娟，羅琦，等. 馬蘭黃酮類化合物提取的研究［J］.中國林副特產(chǎn)，2007(2):13-14.

［9］ 姜顯光，侯冬巖，回瑞華，等. 馬蘭葉中總黃酮的提?。跩］.天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2011，23(5):967-969.

［10］徐靈源，謝集照，謝云峰，等. 紫外分光光度法測定青天葵藥材總黃酮含量［J］. 中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2012，18(12):88-90.