禽6型副粘病毒JL-127株的分離與鑒定及其毒力基因序列分析

田志革，柴洪亮，華育平(東北林業(yè)大學(xué)野生動物資源學(xué)院，黑龍江哈爾濱150040)

副粘病毒形態(tài)多樣，有囊膜，其基因組為單股負(fù)義RNA［1］。禽副粘病毒(Avian paramyxovirus，APMV)屬于副粘病毒科禽腮腺炎病毒屬，其成員有9個(gè)血清型，分別為APMV1 ～APMV9，其中 APMV1 即為新城疫病毒(NDV)［2］。禽6型副粘病毒(APMV6)基因組長度為16 236 nt，結(jié)構(gòu)為3’－NP－P－M－F－SH－HN －L－5’，依次編碼 NP、P、M、HN、SH、F和L蛋白［3］。F蛋白是病毒囊膜上的一種表面糖蛋白，其功能是使病毒囊膜與靶細(xì)胞融合，HN蛋白具有血凝素和神經(jīng)氨酸酶活性，能介導(dǎo)病毒吸附細(xì)胞膜［4］。

APMV6能夠在9～11日齡的雞胚中繁殖，病毒粒子具有血凝活性，該病毒能引起火雞、野鴨輕微的呼吸道癥狀和產(chǎn)蛋量下降［5］。1977年，第1株APMV6/duck/Hongkong/18/199/77(HK)在香港地區(qū)家鴨中被首次被分離［6］，其后在我國臺灣(duck/Taiwan/Y1/99)、遠(yuǎn)東地區(qū)(goose/FarEast/4440/2003)及意大利等地區(qū)有分離報(bào)道。筆者從吉林省某自然保護(hù)區(qū)的野鴨中分離到1株APMV6，對其進(jìn)行全基因組測序，并對毒力基因進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析，可為了解其基因組特點(diǎn)及生物學(xué)特性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料的采集和處理。將采集的野鴨鼻拭子與泄殖腔拭子置于含有青霉素(100 U/ml)和鏈霉素(100 μg/ml)的磷酸鹽緩沖液(PBS)中，在4℃孵育4 h;經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后，取200 μl接種9～11日齡的SPF雞胚中，在37℃溫箱中孵育72 h，期間棄掉死亡的雞胚。72 h后按常規(guī)方法收集尿囊液，保存于－70℃?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 SPF雞胚。SPF雞胚，由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所提供。

1.1.3 主要試劑。DL2000DNA Marker和Taq DNA聚合酶，購自寶生物(大連)工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 形態(tài)學(xué)觀察。取1 ml收集的尿囊液，15 000 r/min離心10 min，棄去上清液，用100 μl PBS將沉淀物懸浮，取1滴負(fù)染，進(jìn)行電鏡觀察。

1.2.2 細(xì)胞凝集試驗(yàn)。在血凝板中每孔加入50 μl PBS，在第1個(gè)孔內(nèi)加入50 μl待檢尿囊液，依次倍比稀釋至第11孔，最后1孔作為紅細(xì)胞對照孔，每孔加入50 μl 1%雞血紅細(xì)胞，輕輕振蕩均勻，室溫條件下靜置30 min，觀察試驗(yàn)結(jié)果，使所有紅細(xì)胞凝集的最高稀釋度作為血凝(HA)判定終點(diǎn)。

1.2.3 樣品的PCR鑒定。取血凝檢測為陽性的樣品，提取總RNA，以AIV、NDV 特異性引物，副粘病毒通用引物［7］進(jìn)行RT-PCR檢測。鑒定引物序列為:AIV-F:5’GGAATGATHGAYGGNTGGTATGG3’;AIV-R:5’ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGGTGTTTT3’;NDV-F:5’TTGATGGCAGGCCTCTTGC3’;NDV-R:5’GGAGGATGTTGGCAGCATT3’;PARF1:5’GAAGGITATTGTCAIAARNINTGGAC3’;PAR-F2:5’GTTGCTTCAATGGTTCARGGNGAYAA3’;PAR-R:5’GCTGAAGTTACIGGITCICCDATRTTNC3’。

1.2.4 引物的設(shè)計(jì)與合成。根據(jù)GenBank上公布的APMV6 HK、TW、FE株全序列(GenBank登錄號分別為EU622637、NC_003043和EF569970)，利用Oligo6.0軟件設(shè)計(jì)16對特異性引物擴(kuò)增JL-127的全基因組，其中相鄰的引物擴(kuò)增片段需要至少200 bp的重疊區(qū)域，便于對測序片段進(jìn)行拼接。引物由哈爾濱博仕生物公司合成，引物序列見表1。

表1 引物相關(guān)信息

1.2.5 PCR擴(kuò)增。按照OMEGA提取試劑盒提取病毒基因組RNA，經(jīng)隨機(jī)引物反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，此cDNA作為PCR反應(yīng)的模板。取5 μl cDNA，依次加入 10 ×PCR Buffer 5 μl、2.5 mmol/L dNTP 4 μl、上、下游引物(20 pmol/L)各 1 μl，Ex Taq DNA聚合酶1 μl，加水補(bǔ)足50 μl并混勻。通過梯度PCR確定適宜擴(kuò)增條件為:95℃ 5 min;94℃ 30 s;45℃ 30 s;70℃ 1 min 30 s，共30個(gè)循環(huán);72℃延伸10 min。取5 μl PCR產(chǎn)物在1%瓊脂糖上進(jìn)行電泳，經(jīng)鑒定后將PCR產(chǎn)物直接測序。為了獲得準(zhǔn)確的基因組末端序列，3’leader及5’Trailer序列利用RACE商品化試劑盒進(jìn)行擴(kuò)增并測序。

1.2.6 F、HN基因序列分析。將測序結(jié)果進(jìn)行有效拼接，獲得JL-127株病毒全基因組序列，利用DNAStar生物軟件對F、HN基因序列與已經(jīng)公布的APMV1至APMV9病毒株的序列進(jìn)行同源性分析，繪制進(jìn)化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 病毒分離結(jié)果 通過血凝試驗(yàn)、電鏡觀察和RT－PCR鑒定，可鑒定出JL-127為APMV6病毒。

2.2 血凝試驗(yàn)結(jié)果 雞胚在接種JL-127后72 h未出現(xiàn)死亡，收取尿囊液進(jìn)行HA試驗(yàn)，HA效價(jià)為23。

2.3 電鏡觀察結(jié)果 從圖1可以看出，病毒粒子呈圓形或橢圓形，表面有囊膜，直徑為200～350 nm。

圖1 APMV6病毒的電鏡觀察結(jié)果

2.4 病毒全基因組測序 將各段PCR產(chǎn)物測序結(jié)果進(jìn)行拼接(圖2)，獲得JL-127的全基因組序列，全長為16 236 nt，GenBank登錄號為KF267717;與此前報(bào)道的HK、TW、FE株全基因組長度相同，符合“6堿基原則”?；蚪M結(jié)構(gòu)為3’leader－NP－P－M －F－SH －HN －L－Trailer5’，與 HK、TW、FE株的氨基酸及核苷酸比對結(jié)果見表2。

圖2 PCR產(chǎn)物的鑒定結(jié)果

表2 JL-127與HK、TW和FE株系的氨基酸及核苷酸比對結(jié)果 %

2.5 F和HN基因進(jìn)化分析 從GenBank數(shù)據(jù)庫上獲得APMV1～APMV9的F和HN氨基酸序列，與JL-127的F和HN基因氨基酸序列構(gòu)建進(jìn)化樹，分析發(fā)現(xiàn)JL-127屬于APMV6血清型，與TW和FE遺傳關(guān)系較近，與HK遺傳關(guān)系較遠(yuǎn)(圖3)。

3 討論

在禽副粘病毒中，NDV能夠引起家禽嚴(yán)重的病癥，因此受到廣泛的研究與關(guān)注，而對APMV2－9的相關(guān)研究報(bào)道卻很少，這對于了解及防控副粘病毒的蔓延是極為不利的。筆者在2011年1次樣品采集中，分離到1株野鴨源的APMV6，經(jīng)測序獲得其基因組信息，經(jīng)氨基酸及核苷酸比對發(fā)現(xiàn)該株病毒屬于APMV6血清型，且與TW和FE株病毒的同源性較高，均達(dá)到90%以上，說明該病毒變異小。另外，雞胚接種試驗(yàn)表明該病毒致病力弱，暫時(shí)沒有大規(guī)模爆發(fā)和蔓延的危險(xiǎn)。筆者首次獲得我國野鴨源APMV6全基因組序列，為今后對APMV6的生態(tài)分布及遺傳進(jìn)化關(guān)系研究奠定基礎(chǔ)，也為禽副粘病毒各血清型間遺傳進(jìn)化及變異規(guī)律提供數(shù)據(jù)支持。

圖3 F和HN氨基酸序列遺傳進(jìn)化分析

［1］LAMB R A，PARKS G D.Paramyxoviridae:the viruses and their replication［M］//KNIPE D M，HOWLEY P M.Fields Virology.5thend.Philadelphia:Lippincott Williams and Wilkins，2007:1449-1496.

［2］LAMB R A，COLLINS P L，KOLAKOFSKY D，et al.Virus Taxonomy:classification and nomenclature of viruses.The eighth report of the international committee in taxonomy of viruses［M］.USA:Elsevier Academic Press，2005.

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［4］ALEXANDER D J.Newcastle disease and other avian paramyxoviruses［J］.Rev Sci Tech，2009，19(2):443-462.

［5］ALEXANDER D J.Newcastle disease and other avian paramyxoviridae infections［M］.Ames:Iowa State University Press，1997:541-569.

［6］SHORTRIDGE K F，ALEXANDER D J，COLLINS M S.Isolation and properties of viruses from poultry in HongKong which represent a new(sixth)distinct group of avian paramyxoviruses［J］.J Gen Virol，1980，49(2):255-262.

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