宜興百合鱗莖不定芽的誘導(dǎo)及增殖

代建麗+吳興超+劉夢(mèng)婷+袁婧+蔡青青

摘要：以宜興百合（Lilium lancifalium Thunb.）鱗片為外植體誘導(dǎo)小鱗莖的形成，并通過正交設(shè)計(jì)增殖鱗莖不定芽。結(jié)果在MS+1.0 mg/L 6-BA + 0.1 mg/L NAA培養(yǎng)基上，鱗片以直接發(fā)生方式形成了鱗莖不定芽，誘導(dǎo)率為100%，平均不定芽數(shù)為5.5。6-BA濃度在0.4～1.2 mg/L范圍內(nèi)，鱗莖不定芽的增殖率隨6-BA濃度的升高而增大，在MS+1.2 mg/L 6-BA +0.2 mg/L IAA +0.1 mg/L NAA培養(yǎng)基上，不定芽的增殖系數(shù)為3.83，不定芽在1/2MS+1.0 mg/L NAA培養(yǎng)基上生根良好。

關(guān)鍵詞：宜興百合（Lilium lancifalium Thunb.）;鱗莖誘導(dǎo);不定芽增殖

中圖分類號(hào)：S644.1 ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A ? ? ? ?文章編號(hào)：0439-8114（2014）21-5282-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2014.21.060

Inducement and Proliferation of Adventitious Buds from Bulb of Lilium lancifalium Thunb.

DAI Jian-li，WU Xing-chao，LIU Meng-ting，YUAN Jing，CAI Qing-qing

（College of Life Science， Wuchang University of Technology， Wuhan 430223， China）

Abstract： The scale of Lilium lancifalium Thunb. was used to induce bulb and the adventitious buds developed from the bulb were proliferated by orthogonal experiment. Results showed that the scale explants formed bulb without callus formation in the medium MS+1.0 mg/L 6-BA + 0.1 mg/L NAA and the induction rate and differentiation coefficient were 100 % and 5.5， respectively. The proliferation rate of adventitious buds was improved with the added concentration of 6-BA in the range of 0.4～1.2 mg/L and the largest proliferation coefficient was 3.83 with the medium MS+ 1.2 mg/L 6-BA + 0.2 mg/L IAA +0.1 mg/L NAA. The optimal medium for rooting was 1/2 MS+ 1.0 mg/L NAA.

Key words： Lilium lancifalium Thunb.; induction of bulb; proliferation of adventitious buds

宜興百合（Lilium lancifalium Thunb.）學(xué)名卷丹，又名虎皮百合，原產(chǎn)我國(guó)宜興及湖州一帶。其鱗莖肉質(zhì)肥厚，營(yíng)養(yǎng)豐富，具有良好的藥效和保健功能;花型奇特，花色艷麗，具有較高的觀賞價(jià)值[1]。市場(chǎng)需求的旺盛促進(jìn)了宜興百合的引種及栽培面積的擴(kuò)大[2]。

組織培養(yǎng)技術(shù)越來越多的應(yīng)用到種苗的快速繁殖中，已有研究表明，鱗片是宜興百合最佳的快速繁殖外植體，優(yōu)于珠芽、根和葉片[1-5]，且基部鱗片誘導(dǎo)率最高[3，4]。6-BA、NAA、KT、2，4-D、IBA是最常用的植物激素，在不定芽誘導(dǎo)中以6-BA和NAA組合最為常見，6-BA的濃度范圍為0.5～3.0 mg/L，NAA的濃度范圍為0.1～2.0 mg/L，6-BA與NAA濃度比值的適宜范圍為1∶2～6∶1;2，4-D常用于愈傷組織的誘導(dǎo)中，濃度范圍為0～1.0 mg/L;NAA和IBA是生根培養(yǎng)最常用的激素，濃度范圍為0.1～1.0 mg/L[1-8]。宜興百合的植株再生以間接途徑為主[1，3，8]，也存在直接發(fā)生方式[7]，現(xiàn)有研究多集中在外植體的選擇、不定芽發(fā)生途徑和初代培養(yǎng)中分化培養(yǎng)基的篩選，以獲得再生頻率最高的外植體和最大量的不定芽，對(duì)不定芽的增殖研究較少。為減少變異的發(fā)生，本試驗(yàn)通過誘導(dǎo)宜興百合鱗片外植體，以直接發(fā)生方式形成小鱗莖再生不定芽，并應(yīng)用正交試驗(yàn)篩選不定芽增殖的最佳培養(yǎng)基，以期通過高效增殖小鱗莖形成的不定芽達(dá)到快速繁殖的目的。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

當(dāng)年收獲的宜興百合健康鱗莖，產(chǎn)自江蘇宜興。

1.2 ?方法

1.2.1 ?百合鱗片小鱗莖的誘導(dǎo) ?挑取長(zhǎng)勢(shì)良好的宜興百合鱗莖，剝?nèi)≈袑樱ǖ?～4層）鱗片，用自來水徹底洗凈泥土，再用去離子水沖洗3次。將鱗片上的水用吸水紙吸干，用75%乙醇浸泡25 s，無(wú)菌水洗滌一次，再用0.1%氯化汞消毒12 min，無(wú)菌水洗滌4次。取鱗片的基部，切成約8 mm×8 mm大小，接種到鱗莖誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，培養(yǎng)基為MS+1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA，每瓶3個(gè)外植體，共接種12瓶，置于培養(yǎng)室培養(yǎng)。培養(yǎng)溫度為25～28 ℃，光照度為1 500 lx，光照時(shí)間為10～12 h/d。

1.2.2 ?百合不定芽的增殖 ?選用L9（34）正交試驗(yàn)篩選百合不定芽增殖培養(yǎng)基，以不同濃度6-BA、IAA、NAA為考察因素，進(jìn)行三因素三水平正交試驗(yàn)，具體水平見表1。將百合鱗片上通過鱗莖發(fā)生途徑形成的不定芽切割下來，選取葉色翠綠、葉長(zhǎng)約2 cm、生長(zhǎng)一致的不定芽，轉(zhuǎn)入附加各種激素的MS培養(yǎng)基中，每瓶3個(gè)外植體，每處理3次重復(fù)，置于培養(yǎng)室培養(yǎng)。28 d后統(tǒng)計(jì)不定芽的增殖情況。

1.2.3 ?生根培養(yǎng) ?選取葉色翠綠、葉長(zhǎng)約2 cm、生長(zhǎng)一致的百合不定芽，轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中進(jìn)行生根培養(yǎng)，培養(yǎng)基為：①1/2MS+0.5 mg/L NAA;②1/2MS+1.0 mg/L NAA;③1/2MS+0.5 mg/L IBA;④1/2MS+1.0 mg/L IBA。每瓶3個(gè)外植體，每處理3次重復(fù)。20 d后觀察不定芽的生根情況，篩選最適生根培養(yǎng)基。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?宜興百合鱗片小鱗莖的誘導(dǎo)

接種2 d后，百合鱗片開始膨大，5 d時(shí)出現(xiàn)不規(guī)則翹起，局部顏色發(fā)生分化，一些區(qū)域變白，另一些區(qū)域顏色變深，呈深紫色或亮紫色，偶有褐色或黑色斑點(diǎn)，切口處變黑（圖1a）。10 d時(shí)，鱗片切口處和貼著培養(yǎng)基的一面開始出現(xiàn)米粒狀突起，呈淺綠色或淡黃色（圖1b）。15 d時(shí)，米粒狀突起逐漸長(zhǎng)大形成小鱗莖，顏色翠綠，鱗片遠(yuǎn)離培養(yǎng)基的一面也變成綠色（圖1c）。20 d后，小鱗莖抽出翠綠的葉片，漸漸形成帶有2～3片葉片的不定芽（圖1d）。28 d時(shí)觀察到，所有鱗片外植體都以直接發(fā)生方式形成了小鱗莖，鱗莖誘導(dǎo)率為100%，且小鱗莖都形成了不定芽，大部分不定芽葉色翠綠、長(zhǎng)約2 cm，平均每個(gè)鱗片形成的不定芽數(shù)為5.5（圖1e、f）。

2.2 ?鱗莖不定芽的增殖

將宜興百合鱗片上的不定芽切割下來，轉(zhuǎn)入增殖培養(yǎng)基培養(yǎng)。7 d內(nèi)只觀察到不定芽葉片的伸長(zhǎng)，沒有新的不定芽產(chǎn)生，10 d后陸續(xù)從一些葉片的基部長(zhǎng)出顆粒狀的小突起，20 d后小突起長(zhǎng)大成新的不定芽（圖2），28 d時(shí)統(tǒng)計(jì)不定芽的增殖，結(jié)果見表2。

從表2、表3可以看出，不定芽的增殖系數(shù)與6-BA濃度的升高呈正相關(guān)，IAA和NAA的濃度變化對(duì)不定芽的增殖影響較小。方差分析表明，3個(gè)因素對(duì)不定芽的增殖均無(wú)顯著影響，影響因素由大到小為A、B、C，得到的最佳組合為A3B3C2，即增殖培養(yǎng)基添加1.2 mg/L 6-BA、0.2 mg/L IAA、0.1 mg/L NAA。

2.3 ?生根培養(yǎng)

宜興百合不定芽轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基后生長(zhǎng)迅速，7 d左右基部長(zhǎng)出1～4條白色細(xì)根，14 d左右有新的不定根形成，原有細(xì)根長(zhǎng)1 cm，21 d后根繼續(xù)生長(zhǎng)，長(zhǎng)約2～4 cm。21 d時(shí)不定芽的生根情況見表4。從表4可以看出，在宜興百合鱗片不定芽的生根培養(yǎng)中，NAA的效果優(yōu)于IBA，以處理2的生根效果最好，其生根系數(shù)最高，且根較為粗壯。

3 ?討論

鱗片是百合組織培養(yǎng)最常用的外植體[9，10]，本試驗(yàn)以宜興百合鱗片為外植體誘導(dǎo)小鱗莖的形成，結(jié)果以直接發(fā)生方式形成了小鱗莖，鱗莖誘導(dǎo)率為100%，平均芽數(shù)為5.5。相對(duì)于間接發(fā)生方式，本試驗(yàn)形成不定芽的時(shí)間相對(duì)較短?，F(xiàn)有的鱗片外植體直接形成小鱗莖的研究中，潘理云等[7]的研究表明，宜興百合的鱗莖誘導(dǎo)率最高為2.08，最適培養(yǎng)基為 MS+ 3.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA;席夢(mèng)利等[4]的研究表明，宜興百合鱗莖的最高誘導(dǎo)率為6.8，最適培養(yǎng)基為MS+0.3 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA;劉龍昌等[9]的研究表明，新豫百合鱗莖的最高誘導(dǎo)率為4.6，最適培養(yǎng)基為MS+1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA。本試驗(yàn)結(jié)果中，宜興百合鱗莖誘導(dǎo)率處于較高水平。

繼代培養(yǎng)中以正交試驗(yàn)增殖培養(yǎng)不定芽，結(jié)果所選因素水平對(duì)不定芽增殖影響均不顯著，可能是試驗(yàn)樣本較少，導(dǎo)致誤差較大;也可能是所選的激素濃度不在最適范圍內(nèi)。繼代培養(yǎng)激素濃度的設(shè)定來自于初代培養(yǎng)，結(jié)果表明需要進(jìn)行調(diào)整，提高6-BA的濃度和6-BA與生長(zhǎng)素的比值是繼續(xù)研究的方向。本試驗(yàn)不定芽的最大增殖系數(shù)為3.83，與潘理云等[7]的試驗(yàn)結(jié)果3.63比較接近。宜興百合增殖培養(yǎng)的研究較少，還需要進(jìn)一步研究確定最適增殖培養(yǎng)基。NAA和IBA是組織培養(yǎng)中常用的促進(jìn)不定芽生根的激素，在宜興百合的生根試驗(yàn)中，NAA和IBA都有應(yīng)用，但效果不盡相同。本試驗(yàn)中NAA促進(jìn)宜興百合不定芽生根的效果優(yōu)于IBA，這與潘理云等[7]的試驗(yàn)結(jié)果相反，可能是使用的不定芽增殖培養(yǎng)基不同導(dǎo)致不定芽增殖培養(yǎng)后的生理狀態(tài)不同。此外，何微等[1]的研究表明，NAA適合宜興百合不定芽的生根培養(yǎng)，0.5 mg/L NAA的生根率最高。席夢(mèng)利等[4]的研究也表明，NAA適合宜興百合不定芽的生根培養(yǎng)，NAA結(jié)合多效唑PP333生根效果更佳。NAA可以作為宜興百合不定芽生根培養(yǎng)的優(yōu)選激素。

參考文獻(xiàn)：

[1] 何 ?微，景丹龍，陳 ?強(qiáng)，等.卷丹的原球莖誘導(dǎo)及植株再生[J]. 湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，51（2）：396-399.

[2] 柴春燕，胡東旭.宜興百合特性及高產(chǎn)栽培技術(shù)[J].廣西園藝，2003（3）：24-25.

[3] PAN Y Z， ZHAO Y Y， LIU X L， et al. Different explants of Lilium lancifolium have different potential to differentiate and regenerate in tissue culture[J]. Agricultural Science & Technology，2011，12（10）：1437-1440.

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[6] 周春華，尤 ?超，陳凝華.百合組織培養(yǎng)研究進(jìn)展[J].北方園藝， 2013，（14）：193-195.

[7] 潘理云，張海洋.宜興百合組培快繁技術(shù)的研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，40（10）：5748-5750.

[8] 謝 ?杰，余沛濤，王全喜.宜興百合通過愈傷組織誘導(dǎo)再生鱗莖的研究[J].上海農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2007，23（3）：96-100.

[9] 劉龍昌，張 ?輝，馬廣濤，等.新豫百合的組織培養(yǎng)與快速繁殖[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，40（2）：30-31.

[10] 鄭一強(qiáng)，孫紅梅.東方百合試管鱗莖形成條件優(yōu)化[J].中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2011，27（6）：90-94.

（責(zé)任編輯 ?趙 ?娟）

1.2.2 ?百合不定芽的增殖 ?選用L9（34）正交試驗(yàn)篩選百合不定芽增殖培養(yǎng)基，以不同濃度6-BA、IAA、NAA為考察因素，進(jìn)行三因素三水平正交試驗(yàn)，具體水平見表1。將百合鱗片上通過鱗莖發(fā)生途徑形成的不定芽切割下來，選取葉色翠綠、葉長(zhǎng)約2 cm、生長(zhǎng)一致的不定芽，轉(zhuǎn)入附加各種激素的MS培養(yǎng)基中，每瓶3個(gè)外植體，每處理3次重復(fù)，置于培養(yǎng)室培養(yǎng)。28 d后統(tǒng)計(jì)不定芽的增殖情況。

1.2.3 ?生根培養(yǎng) ?選取葉色翠綠、葉長(zhǎng)約2 cm、生長(zhǎng)一致的百合不定芽，轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中進(jìn)行生根培養(yǎng)，培養(yǎng)基為：①1/2MS+0.5 mg/L NAA;②1/2MS+1.0 mg/L NAA;③1/2MS+0.5 mg/L IBA;④1/2MS+1.0 mg/L IBA。每瓶3個(gè)外植體，每處理3次重復(fù)。20 d后觀察不定芽的生根情況，篩選最適生根培養(yǎng)基。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?宜興百合鱗片小鱗莖的誘導(dǎo)

接種2 d后，百合鱗片開始膨大，5 d時(shí)出現(xiàn)不規(guī)則翹起，局部顏色發(fā)生分化，一些區(qū)域變白，另一些區(qū)域顏色變深，呈深紫色或亮紫色，偶有褐色或黑色斑點(diǎn)，切口處變黑（圖1a）。10 d時(shí)，鱗片切口處和貼著培養(yǎng)基的一面開始出現(xiàn)米粒狀突起，呈淺綠色或淡黃色（圖1b）。15 d時(shí)，米粒狀突起逐漸長(zhǎng)大形成小鱗莖，顏色翠綠，鱗片遠(yuǎn)離培養(yǎng)基的一面也變成綠色（圖1c）。20 d后，小鱗莖抽出翠綠的葉片，漸漸形成帶有2～3片葉片的不定芽（圖1d）。28 d時(shí)觀察到，所有鱗片外植體都以直接發(fā)生方式形成了小鱗莖，鱗莖誘導(dǎo)率為100%，且小鱗莖都形成了不定芽，大部分不定芽葉色翠綠、長(zhǎng)約2 cm，平均每個(gè)鱗片形成的不定芽數(shù)為5.5（圖1e、f）。

2.2 ?鱗莖不定芽的增殖

將宜興百合鱗片上的不定芽切割下來，轉(zhuǎn)入增殖培養(yǎng)基培養(yǎng)。7 d內(nèi)只觀察到不定芽葉片的伸長(zhǎng)，沒有新的不定芽產(chǎn)生，10 d后陸續(xù)從一些葉片的基部長(zhǎng)出顆粒狀的小突起，20 d后小突起長(zhǎng)大成新的不定芽（圖2），28 d時(shí)統(tǒng)計(jì)不定芽的增殖，結(jié)果見表2。

從表2、表3可以看出，不定芽的增殖系數(shù)與6-BA濃度的升高呈正相關(guān)，IAA和NAA的濃度變化對(duì)不定芽的增殖影響較小。方差分析表明，3個(gè)因素對(duì)不定芽的增殖均無(wú)顯著影響，影響因素由大到小為A、B、C，得到的最佳組合為A3B3C2，即增殖培養(yǎng)基添加1.2 mg/L 6-BA、0.2 mg/L IAA、0.1 mg/L NAA。

2.3 ?生根培養(yǎng)

宜興百合不定芽轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基后生長(zhǎng)迅速，7 d左右基部長(zhǎng)出1～4條白色細(xì)根，14 d左右有新的不定根形成，原有細(xì)根長(zhǎng)1 cm，21 d后根繼續(xù)生長(zhǎng)，長(zhǎng)約2～4 cm。21 d時(shí)不定芽的生根情況見表4。從表4可以看出，在宜興百合鱗片不定芽的生根培養(yǎng)中，NAA的效果優(yōu)于IBA，以處理2的生根效果最好，其生根系數(shù)最高，且根較為粗壯。

3 ?討論

鱗片是百合組織培養(yǎng)最常用的外植體[9，10]，本試驗(yàn)以宜興百合鱗片為外植體誘導(dǎo)小鱗莖的形成，結(jié)果以直接發(fā)生方式形成了小鱗莖，鱗莖誘導(dǎo)率為100%，平均芽數(shù)為5.5。相對(duì)于間接發(fā)生方式，本試驗(yàn)形成不定芽的時(shí)間相對(duì)較短。現(xiàn)有的鱗片外植體直接形成小鱗莖的研究中，潘理云等[7]的研究表明，宜興百合的鱗莖誘導(dǎo)率最高為2.08，最適培養(yǎng)基為 MS+ 3.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA;席夢(mèng)利等[4]的研究表明，宜興百合鱗莖的最高誘導(dǎo)率為6.8，最適培養(yǎng)基為MS+0.3 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA;劉龍昌等[9]的研究表明，新豫百合鱗莖的最高誘導(dǎo)率為4.6，最適培養(yǎng)基為MS+1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA。本試驗(yàn)結(jié)果中，宜興百合鱗莖誘導(dǎo)率處于較高水平。

繼代培養(yǎng)中以正交試驗(yàn)增殖培養(yǎng)不定芽，結(jié)果所選因素水平對(duì)不定芽增殖影響均不顯著，可能是試驗(yàn)樣本較少，導(dǎo)致誤差較大;也可能是所選的激素濃度不在最適范圍內(nèi)。繼代培養(yǎng)激素濃度的設(shè)定來自于初代培養(yǎng)，結(jié)果表明需要進(jìn)行調(diào)整，提高6-BA的濃度和6-BA與生長(zhǎng)素的比值是繼續(xù)研究的方向。本試驗(yàn)不定芽的最大增殖系數(shù)為3.83，與潘理云等[7]的試驗(yàn)結(jié)果3.63比較接近。宜興百合增殖培養(yǎng)的研究較少，還需要進(jìn)一步研究確定最適增殖培養(yǎng)基。NAA和IBA是組織培養(yǎng)中常用的促進(jìn)不定芽生根的激素，在宜興百合的生根試驗(yàn)中，NAA和IBA都有應(yīng)用，但效果不盡相同。本試驗(yàn)中NAA促進(jìn)宜興百合不定芽生根的效果優(yōu)于IBA，這與潘理云等[7]的試驗(yàn)結(jié)果相反，可能是使用的不定芽增殖培養(yǎng)基不同導(dǎo)致不定芽增殖培養(yǎng)后的生理狀態(tài)不同。此外，何微等[1]的研究表明，NAA適合宜興百合不定芽的生根培養(yǎng)，0.5 mg/L NAA的生根率最高。席夢(mèng)利等[4]的研究也表明，NAA適合宜興百合不定芽的生根培養(yǎng)，NAA結(jié)合多效唑PP333生根效果更佳。NAA可以作為宜興百合不定芽生根培養(yǎng)的優(yōu)選激素。

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[8] 謝 ?杰，余沛濤，王全喜.宜興百合通過愈傷組織誘導(dǎo)再生鱗莖的研究[J].上海農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2007，23（3）：96-100.

[9] 劉龍昌，張 ?輝，馬廣濤，等.新豫百合的組織培養(yǎng)與快速繁殖[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，40（2）：30-31.

[10] 鄭一強(qiáng)，孫紅梅.東方百合試管鱗莖形成條件優(yōu)化[J].中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2011，27（6）：90-94.

（責(zé)任編輯 ?趙 ?娟）

1.2.2 ?百合不定芽的增殖 ?選用L9（34）正交試驗(yàn)篩選百合不定芽增殖培養(yǎng)基，以不同濃度6-BA、IAA、NAA為考察因素，進(jìn)行三因素三水平正交試驗(yàn)，具體水平見表1。將百合鱗片上通過鱗莖發(fā)生途徑形成的不定芽切割下來，選取葉色翠綠、葉長(zhǎng)約2 cm、生長(zhǎng)一致的不定芽，轉(zhuǎn)入附加各種激素的MS培養(yǎng)基中，每瓶3個(gè)外植體，每處理3次重復(fù)，置于培養(yǎng)室培養(yǎng)。28 d后統(tǒng)計(jì)不定芽的增殖情況。

1.2.3 ?生根培養(yǎng) ?選取葉色翠綠、葉長(zhǎng)約2 cm、生長(zhǎng)一致的百合不定芽，轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中進(jìn)行生根培養(yǎng)，培養(yǎng)基為：①1/2MS+0.5 mg/L NAA;②1/2MS+1.0 mg/L NAA;③1/2MS+0.5 mg/L IBA;④1/2MS+1.0 mg/L IBA。每瓶3個(gè)外植體，每處理3次重復(fù)。20 d后觀察不定芽的生根情況，篩選最適生根培養(yǎng)基。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?宜興百合鱗片小鱗莖的誘導(dǎo)

接種2 d后，百合鱗片開始膨大，5 d時(shí)出現(xiàn)不規(guī)則翹起，局部顏色發(fā)生分化，一些區(qū)域變白，另一些區(qū)域顏色變深，呈深紫色或亮紫色，偶有褐色或黑色斑點(diǎn)，切口處變黑（圖1a）。10 d時(shí)，鱗片切口處和貼著培養(yǎng)基的一面開始出現(xiàn)米粒狀突起，呈淺綠色或淡黃色（圖1b）。15 d時(shí)，米粒狀突起逐漸長(zhǎng)大形成小鱗莖，顏色翠綠，鱗片遠(yuǎn)離培養(yǎng)基的一面也變成綠色（圖1c）。20 d后，小鱗莖抽出翠綠的葉片，漸漸形成帶有2～3片葉片的不定芽（圖1d）。28 d時(shí)觀察到，所有鱗片外植體都以直接發(fā)生方式形成了小鱗莖，鱗莖誘導(dǎo)率為100%，且小鱗莖都形成了不定芽，大部分不定芽葉色翠綠、長(zhǎng)約2 cm，平均每個(gè)鱗片形成的不定芽數(shù)為5.5（圖1e、f）。

2.2 ?鱗莖不定芽的增殖

將宜興百合鱗片上的不定芽切割下來，轉(zhuǎn)入增殖培養(yǎng)基培養(yǎng)。7 d內(nèi)只觀察到不定芽葉片的伸長(zhǎng)，沒有新的不定芽產(chǎn)生，10 d后陸續(xù)從一些葉片的基部長(zhǎng)出顆粒狀的小突起，20 d后小突起長(zhǎng)大成新的不定芽（圖2），28 d時(shí)統(tǒng)計(jì)不定芽的增殖，結(jié)果見表2。

從表2、表3可以看出，不定芽的增殖系數(shù)與6-BA濃度的升高呈正相關(guān)，IAA和NAA的濃度變化對(duì)不定芽的增殖影響較小。方差分析表明，3個(gè)因素對(duì)不定芽的增殖均無(wú)顯著影響，影響因素由大到小為A、B、C，得到的最佳組合為A3B3C2，即增殖培養(yǎng)基添加1.2 mg/L 6-BA、0.2 mg/L IAA、0.1 mg/L NAA。

2.3 ?生根培養(yǎng)

宜興百合不定芽轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基后生長(zhǎng)迅速，7 d左右基部長(zhǎng)出1～4條白色細(xì)根，14 d左右有新的不定根形成，原有細(xì)根長(zhǎng)1 cm，21 d后根繼續(xù)生長(zhǎng)，長(zhǎng)約2～4 cm。21 d時(shí)不定芽的生根情況見表4。從表4可以看出，在宜興百合鱗片不定芽的生根培養(yǎng)中，NAA的效果優(yōu)于IBA，以處理2的生根效果最好，其生根系數(shù)最高，且根較為粗壯。

3 ?討論

鱗片是百合組織培養(yǎng)最常用的外植體[9，10]，本試驗(yàn)以宜興百合鱗片為外植體誘導(dǎo)小鱗莖的形成，結(jié)果以直接發(fā)生方式形成了小鱗莖，鱗莖誘導(dǎo)率為100%，平均芽數(shù)為5.5。相對(duì)于間接發(fā)生方式，本試驗(yàn)形成不定芽的時(shí)間相對(duì)較短。現(xiàn)有的鱗片外植體直接形成小鱗莖的研究中，潘理云等[7]的研究表明，宜興百合的鱗莖誘導(dǎo)率最高為2.08，最適培養(yǎng)基為 MS+ 3.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA;席夢(mèng)利等[4]的研究表明，宜興百合鱗莖的最高誘導(dǎo)率為6.8，最適培養(yǎng)基為MS+0.3 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA;劉龍昌等[9]的研究表明，新豫百合鱗莖的最高誘導(dǎo)率為4.6，最適培養(yǎng)基為MS+1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA。本試驗(yàn)結(jié)果中，宜興百合鱗莖誘導(dǎo)率處于較高水平。

繼代培養(yǎng)中以正交試驗(yàn)增殖培養(yǎng)不定芽，結(jié)果所選因素水平對(duì)不定芽增殖影響均不顯著，可能是試驗(yàn)樣本較少，導(dǎo)致誤差較大;也可能是所選的激素濃度不在最適范圍內(nèi)。繼代培養(yǎng)激素濃度的設(shè)定來自于初代培養(yǎng)，結(jié)果表明需要進(jìn)行調(diào)整，提高6-BA的濃度和6-BA與生長(zhǎng)素的比值是繼續(xù)研究的方向。本試驗(yàn)不定芽的最大增殖系數(shù)為3.83，與潘理云等[7]的試驗(yàn)結(jié)果3.63比較接近。宜興百合增殖培養(yǎng)的研究較少，還需要進(jìn)一步研究確定最適增殖培養(yǎng)基。NAA和IBA是組織培養(yǎng)中常用的促進(jìn)不定芽生根的激素，在宜興百合的生根試驗(yàn)中，NAA和IBA都有應(yīng)用，但效果不盡相同。本試驗(yàn)中NAA促進(jìn)宜興百合不定芽生根的效果優(yōu)于IBA，這與潘理云等[7]的試驗(yàn)結(jié)果相反，可能是使用的不定芽增殖培養(yǎng)基不同導(dǎo)致不定芽增殖培養(yǎng)后的生理狀態(tài)不同。此外，何微等[1]的研究表明，NAA適合宜興百合不定芽的生根培養(yǎng)，0.5 mg/L NAA的生根率最高。席夢(mèng)利等[4]的研究也表明，NAA適合宜興百合不定芽的生根培養(yǎng)，NAA結(jié)合多效唑PP333生根效果更佳。NAA可以作為宜興百合不定芽生根培養(yǎng)的優(yōu)選激素。

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（責(zé)任編輯 ?趙 ?娟）