珍稀泌鹽植物長(zhǎng)葉紅砂RtSOD基因的克隆及功能分析

索雅飛,杜超,李寧寧，王燕，王迎春

(內(nèi)蒙古大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古自治區(qū)牧草與特色作物生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，內(nèi)蒙古 呼和浩特010021)

逆境脅迫是制約植物生長(zhǎng)發(fā)育，影響作物產(chǎn)量和品質(zhì)的主要因素[1]。逆境脅迫主要分為兩種：生物脅迫和非生物脅迫。目前非生物脅迫對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育的影響是人們研究的一大熱點(diǎn)。非生物脅迫主要包括干旱、鹽、高溫、紫外照射等，其中鹽、干旱是主要的環(huán)境抑制因素[2]。鹽、干旱脅迫下植物體內(nèi)會(huì)積累過(guò)多的活性氧，如：-OH，O2-·，H2O2等，活性氧會(huì)導(dǎo)致膜脂過(guò)氧化，對(duì)膜質(zhì)造成損傷，形成氧化脅迫，嚴(yán)重影響植物的生長(zhǎng)發(fā)育[3]。因此，抗氧化系統(tǒng)的研究對(duì)了解植物抗逆機(jī)制具有重要意義。

超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)，是生物體內(nèi)普遍存在的金屬酶，是一種極有效的抗氧化劑[4]，其主要功能是清除生物體內(nèi)過(guò)多的O2-·，防止膜脂過(guò)氧化，使植物細(xì)胞免受O2-·的破壞[5-6]，SOD作為植物體中抗氧化酶系統(tǒng)中的第一道防線(xiàn)，對(duì)植物抵御逆境脅迫發(fā)揮著重要作用。目前，SOD基因已從擬南芥(Arabidopsisthaliana)[7]、煙草(Nicotianatabacum)[8]、水稻(Oryzasativa)[9]、小麥(Triticumaestivum)[10]、豌豆(Pisumsativum)[11]、番茄(Lycopersicumesculentum)[12]、陸地棉(Gossypiumhirsutum)[13]等多種植物中被克隆，且研究表明，在擬南芥、煙草、苜蓿(Medicagosativa)等植物中過(guò)表達(dá)不同的SOD基因均可提高其抗逆性。例如將小麥的Cu/ZnSOD基因轉(zhuǎn)入擬南芥后，擬南芥中SOD、CAT、APX、GR等酶活性及NADPH氧化酶(NOX)活性升高，植株對(duì)鹽和H2O2的抗性增強(qiáng)[10]；將擬南芥的FeSOD轉(zhuǎn)入煙草中后，煙草的抗氧化性增強(qiáng)[7]；將煙草的MnSOD轉(zhuǎn)入紫花苜蓿后，MnSOD在線(xiàn)粒體中過(guò)量表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)植物的耐冷性增強(qiáng)，產(chǎn)量增加[8]。由此可見(jiàn)，SOD基因作為植物體內(nèi)重要的抗氧化相關(guān)基因與植物抗逆性密切相關(guān)，但目前這些研究主要集中在一些模式植物和農(nóng)作物中，針對(duì)野生植物的研究較少。已有研究發(fā)現(xiàn)一些來(lái)源于野生植物的抗氧化相關(guān)基因在增強(qiáng)植物抗逆性方面具有突出的表現(xiàn)[14-15]，因此，從野生植物中挖掘抗氧化相關(guān)基因并驗(yàn)證其功能具有重要意義。

長(zhǎng)葉紅砂(Reaumuriatrigyna)，又名黃花紅砂、黃花琵琶柴，隸屬于檉柳科(Tamarieaceae)琵琶柴屬(Reaumuria)，是亞洲中部亞區(qū)東阿拉善-西鄂爾多斯特有種，內(nèi)蒙古自治區(qū)重點(diǎn)保護(hù)植物[16-18]。長(zhǎng)葉紅砂具有鹽腺、針狀肉質(zhì)葉片及下陷的氣孔等特殊的形態(tài)結(jié)構(gòu)，對(duì)鹽生荒漠環(huán)境具有獨(dú)特的適應(yīng)性[19-25]。在對(duì)環(huán)境的適應(yīng)過(guò)程中，其體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)被顯著激活，進(jìn)行活躍的解毒活動(dòng)[26]。黨振華[27]對(duì)長(zhǎng)葉紅砂轉(zhuǎn)錄組的研究發(fā)現(xiàn)，植物體內(nèi)抗氧化相關(guān)基因SOD、POD、APX、GSH、GRX等在脅迫條件下被顯著誘導(dǎo)表達(dá)，說(shuō)明這些基因可能在長(zhǎng)葉紅砂抵抗逆境過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用。因此，長(zhǎng)葉紅砂抗氧化系統(tǒng)的研究對(duì)探索植物耐鹽機(jī)制，發(fā)現(xiàn)特有耐鹽決定因子，挖掘相關(guān)抗逆基因具有重要意義。本研究利用PCR技術(shù)克隆得到RtSOD基因的開(kāi)放閱讀框，對(duì)其進(jìn)行序列及表達(dá)分析，之后構(gòu)建植物表達(dá)載體pPZP221-RtSOD，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法對(duì)擬南芥進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，獲得純合的轉(zhuǎn)基因植株后對(duì)其進(jìn)行鹽、干旱脅迫處理，進(jìn)一步分析該基因在植物抵抗非生物脅迫過(guò)程中發(fā)揮的功能。此研究對(duì)深入了解長(zhǎng)葉紅砂在非生物脅迫下的抗氧化機(jī)制具有重要意義，為研究野生植物的抗逆機(jī)制奠定了基礎(chǔ)，對(duì)開(kāi)發(fā)和利用野生植物資源，篩選優(yōu)異基因，培育抗逆牧草新品種具有重要作用。

1 材料與方法

1.1 材料

長(zhǎng)葉紅砂(Reaumuriatrigyna)種子由本實(shí)驗(yàn)室保存，擬南芥哥倫比亞野生型種子(Col-0)和農(nóng)桿菌GV3101均由內(nèi)蒙古大學(xué)祁智教授惠贈(zèng)，植物表達(dá)載體pPZP221由內(nèi)蒙古大學(xué)哈斯阿古拉教授惠贈(zèng)。

1.2 長(zhǎng)葉紅砂幼苗培養(yǎng)及脅迫處理

長(zhǎng)葉紅砂種子剪去絨毛，NaClO溶液浸泡10 min，無(wú)菌水沖洗3次后將其播種于固體MS培養(yǎng)基中。在24 ℃、濕度70%，16 h光照/8 h黑暗條件下培養(yǎng)一個(gè)月，長(zhǎng)到約10 cm高度，轉(zhuǎn)移到1/2 MS液體培養(yǎng)基中繼續(xù)生長(zhǎng)，在液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)10 d后，收集植物材料，分別對(duì)其根、莖、葉的RNA進(jìn)行提取，3組重復(fù)，用于RtSOD基因的組織特異性分析。

挑選長(zhǎng)勢(shì)相近幼苗分別用NaCl(0、200、400、600 mmol·L-1)、PEG(20%)、4 ℃、H2O2(20 mmol·L-1)、ABA(10 μmol·L-1)處理0、3、6、12、24、48、72 h，每個(gè)處理分別為3個(gè)株系，且每個(gè)處理重復(fù)3次。收集材料，液氮速凍，提取植株RNA，然后保存于-80 ℃，用于分析不同脅迫條件下該基因在長(zhǎng)葉紅砂中的表達(dá)特性。

1.3 長(zhǎng)葉紅砂RtSOD基因開(kāi)放閱讀框的克隆

長(zhǎng)葉紅砂總RNA的提取參照RNA Plant Plus Regen (TaKaRa)中多糖多酚植物組織RNA提取說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，cDNA合成參照PrimeScriptTMII 1st Strand cDNA synthesis kit (TaKaRa)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。根據(jù)已有的長(zhǎng)葉紅砂轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)及ORF Finder找出RtSOD基因預(yù)測(cè)的開(kāi)放閱讀框，在其兩端設(shè)計(jì)帶有BamHI和KpnI酶切位點(diǎn)的引物，RtSOD-F:5′-CGGGATCCATGGCCACCAAC-3′;RtSOD-R:5′-GGGGTACCTCAGT TCGGAGTCAG-3′，以反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板擴(kuò)增ORF，PCR反應(yīng)總體系25 μL，內(nèi)含10×Buffer 2.5 μL、dNTP 2 μL、上下游引物各0.5 μL、模板1 μL、Taq 酶0.5 μL、ddH2O 18 μL。反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性 5 min；95 ℃變性 5 s；60 ℃復(fù)性 30 s；72 ℃退火 2 min；72 ℃延伸 10 min，35個(gè)循環(huán)。PCR結(jié)束后將產(chǎn)物插入pMD-19T載體中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，之后經(jīng)菌液PCR驗(yàn)證后測(cè)序。

1.4 長(zhǎng)葉紅砂RtSOD基因的生物信息學(xué)分析

利用NCBI的ORF Finder(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)識(shí)別開(kāi)放閱讀框(open reading frame， ORF)并翻譯推測(cè)出氨基酸序列；通過(guò)在線(xiàn)軟件 ProtParam(http://www.expasy.org)進(jìn)行預(yù)測(cè)基因編碼的蛋白分子量、理論等電點(diǎn)及保守結(jié)構(gòu)域等；利用ClustalX和Mega5.05[28]軟件分別進(jìn)行多序列比對(duì)分析及系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建。

1.5 qRT-PCR分析RtSOD基因的表達(dá)量

本實(shí)驗(yàn)利用Rotor Gene Q Real-time PCR Platform系統(tǒng)進(jìn)行，RtSOD用于qRT-PCR的特異引物為RtSOD-F′:5′-AACTATCTCGCCACTCCCTCTCT-3′；RtSOD-R′：5′-TTGGGTCAAAGTAACAACTCCTTC-3′；β-Actin內(nèi)參基因引物序列Actin-F′: 5′-CTGGATTCTGGTGATGGTGTGTCT-3′; Actin-R′:5′-GAACCACCGATCCAGACACTGTAC-3′。反應(yīng)總體系20 μL，內(nèi)含SYBR Premix Ex TaqII 10 μL、上下游引物各0.5 μL、模板1 μL、ddH2O 8 μL。反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃預(yù)變性30 s，94 ℃變性5 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸10 s，40個(gè)循環(huán)，溶解曲線(xiàn)從65～95 ℃，3次重復(fù)。用2-ΔΔCt法[28]計(jì)算不同處理?xiàng)l件下RtSOD基因的相對(duì)表達(dá)水平。

1.6 植物表達(dá)載體的構(gòu)建

選取測(cè)序正確的陽(yáng)性克隆提取質(zhì)粒，利用限制性?xún)?nèi)切酶BamHI和KpnI雙酶切pPZP221和pMD-19T-RtSOD質(zhì)粒，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)酶切產(chǎn)物，回收RtSOD基因和pPZP221載體的目的片段。將雙酶切得到的目的基因片段與pPZP221真核表達(dá)載體進(jìn)行連接。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到克隆菌中，涂到含有壯觀霉素(spectinomycin， Spe)的抗性平板上過(guò)夜培養(yǎng)，挑菌，PCR驗(yàn)證，將條帶正確的菌液送去測(cè)序，最終得到pPZP221-RtSOD陽(yáng)性重組載體。

1.7 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的擬南芥遺傳轉(zhuǎn)化

將植物表達(dá)載體pPZP221-RtSOD轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌，在篩選培養(yǎng)基(LB+100 mg·L-1Spe+50 mg·L-1Rif)上獲得轉(zhuǎn)化菌落，PCR驗(yàn)證，得到RtSOD農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化菌株。

將攜帶重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌活化擴(kuò)培后，離心收集菌體，加入5%的蔗糖溶液重懸，將A600調(diào)到0.8后加入0.1% 6-BA和0.03% Silwet L-77，混勻。挑選健壯的擬南芥進(jìn)行浸染，用準(zhǔn)備好的浸染液浸染擬南芥花序5 min后，罩膜，置于培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)24 h，之后在正常條件下培養(yǎng)。待角果成熟后，收集種子，加入變色硅膠干燥，之后進(jìn)行篩選。

1.8 RtSOD轉(zhuǎn)基因擬南芥純合體的篩選及驗(yàn)證

將經(jīng)過(guò)消毒處理的100粒轉(zhuǎn)基因擬南芥T1代種子播種于含50 μg·mL-1的慶大霉素(gentamicin,Gent)的1/2MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)，約1周后，選擇長(zhǎng)根及有4片綠色真葉的幼苗移到營(yíng)養(yǎng)土中繼續(xù)培養(yǎng)，待幼苗健壯，取植株組織進(jìn)行PCR鑒定，方法參照TransDirectTMPlant Tissue PCR Kit 試劑盒，電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，挑選有明顯條帶的株系繼續(xù)進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證，最終篩選出表達(dá)量較高的3個(gè)株系繼續(xù)培養(yǎng)收獲種子，之后取T2代種子繼續(xù)播種于含50 μg·mL-1Gent的1/2 MS培養(yǎng)基上，選出呈3∶1性狀分離培養(yǎng)皿上的陽(yáng)性幼苗移至營(yíng)養(yǎng)土中繼續(xù)培養(yǎng)，收種子。之后取T3代的種子繼續(xù)播種到抗性培養(yǎng)基上，篩選100%成活培養(yǎng)皿上的幼苗移到營(yíng)養(yǎng)土中，得到穩(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)基因擬南芥純合體。

1.9 RtSOD轉(zhuǎn)基因擬南芥抗逆性分析

1.9.1鹽、干旱脅迫后RtSOD轉(zhuǎn)基因擬南芥根長(zhǎng)的測(cè)定 將野生型(WT)和RtSOD轉(zhuǎn)基因擬南芥種子(S2，S5，S6)表面消毒后播種在1/2MS培養(yǎng)基中，培養(yǎng)5 d后將幼苗移到0，100，150 mmol·L-1NaCl和0，100，150，200 mmol·L-1甘露醇(mannitol)的培養(yǎng)基上，培養(yǎng)10 d后分別測(cè)定不同濃度NaCl和甘露醇處理后幼苗的根長(zhǎng)，每個(gè)處理3次重復(fù)。

1.9.2鹽、干旱脅迫后RtSOD轉(zhuǎn)基因擬南芥鮮重及葉綠素含量的測(cè)定 將野生型(WT)和RtSOD轉(zhuǎn)基因擬南芥種子(S2，S5，S6)表面消毒后播種在1/2 MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)，10 d后移到營(yíng)養(yǎng)土中繼續(xù)培養(yǎng)20 d后，將植株分為3組，一組作為對(duì)照繼續(xù)培養(yǎng)，一組植株用150 mmol·L-1NaCl處理10 d，另一組植株停止?jié)菜珊堤幚?0 d，同一時(shí)間分別收集脅迫處理和未經(jīng)脅迫處理的植株，分別測(cè)定其鮮重、葉綠素含量，之后將材料用液氮凍干，保存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.9.3SOD、POD、CAT活性及MDA、脯氨酸(Pro)、H2O2含量的測(cè)定 參照科銘生物公司的SOD、POD、CAT、MDA、H2O2、Pro等檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行測(cè)定。

1.10 鹽、干旱脅迫下轉(zhuǎn)基因擬南芥脅迫相關(guān)基因表達(dá)量的測(cè)定

將野生型和轉(zhuǎn)基因擬南芥用鹽和干旱脅迫處理后(如1.9.1所示)，收集植株，液氮凍干，提取RNA后將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA，利用Rotor Gene Q Real-time PCR Platform系統(tǒng)測(cè)定植株中擬南芥脅迫相關(guān)基因的表達(dá)量。通過(guò)登錄號(hào)查找到相關(guān)基因引物序列(表1)。

2 結(jié)果與分析

2.1 長(zhǎng)葉紅砂RtSOD基因ORF的克隆

從長(zhǎng)葉紅砂轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)中得到RtSOD的基因序列，在其序列兩端設(shè)計(jì)帶有BamHI和KpnI酶切位點(diǎn)的引物進(jìn)行克隆，結(jié)果與預(yù)期相符，得到長(zhǎng)為663 bp的目的條帶(圖1)，之后進(jìn)行膠回收，連接，轉(zhuǎn)化，菌液PCR驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)在663 bp處有明亮條帶，表明重組菌中成功轉(zhuǎn)入目的基因，將菌液送去測(cè)序。測(cè)序結(jié)果顯示所得序列正確，可進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

表1 擬南芥脅迫相關(guān)基因引物序列Table 1 The primer sequence of stress-related gene in A. thaliana

2.2 RtSOD基因氨基酸序列的生物信息學(xué)分析

圖1 RtSOD基因ORF片段的PCR擴(kuò)增Fig.1 The ORF amplification of RtSOD gene M：DL2000 marker; S:RtSOD gene.

氨基酸序列比對(duì)分析結(jié)果顯示，RtSOD與剛毛檉柳(Tamarixhispida，GenkBank登錄號(hào)AHH91635.1)、鹽角草(Salicorniaeuropaea，登錄號(hào)AFD50705.1)、葡萄(Vitisvinifera，登錄號(hào)NP_001268067.1)、陸地棉(Gossypiumhirsutum，登錄號(hào)AAZ41971.1)、擬南芥(Arabidopsisthaliana，登錄號(hào)NP_565666.1)中SOD基因的同源性較高，分別為92%，84%，81%，80%和75%。多重序列比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，RtSOD屬于Cu/Zn超氧化物歧化酶家族，同家族其他蛋白一樣，含有部分保守結(jié)構(gòu)，包含4個(gè)銅離子結(jié)合位點(diǎn)和4個(gè)鋅離子結(jié)合位點(diǎn)(圖2)。RtSOD與Cu/Zn超氧化物歧化酶家族的其他蛋白進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，RtSOD與檉柳科的剛毛檉柳的SOD基因親緣關(guān)系最近，聚為一類(lèi)(圖3)。

2.3 RtSOD基因表達(dá)特性分析

2.3.1RtSOD基因的組織特異性表達(dá)分析 qRT-PCR分析結(jié)果顯示，RtSOD在不同組織中表達(dá)量有顯著差異，主要在莖中表達(dá)，根和葉中表達(dá)量均較低，表達(dá)趨勢(shì)為：根<葉<莖(圖4)。

圖2 長(zhǎng)葉紅砂、鹽角草、剛毛檉柳、葡萄、陸地棉和擬南芥SOD氨基酸序列比對(duì)Fig.2 Amino acid sequence alignment of Cu/Zn SOD from R. trigyna, S. europaea, T. hispida, G. hirsutum, V. vinifera and A. thaliana 黑色陰影表示保守氨基酸序列; 線(xiàn)內(nèi)區(qū)域表示Cu/Zn SOD家族保守區(qū); 星號(hào)和黑點(diǎn)分別代表銅、鋅離子結(jié)合位點(diǎn)Black backgrounds show conserved amino acid. Red line show conserved region of Cu/Zn SOD superfamily proteins. Asterisks and black spot mean Cu2+ and Zn2+ binging site.

圖3 RtSOD與其他植物SOD蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.3 The phylogenetic tree of RtSOD and the other plants SOD protein

2.3.2不同非生物脅迫RtSOD基因表達(dá)特性分析

圖4 RtSOD基因組織特異性表達(dá)分析Fig.4 Tissue specific expression analysis of RtSOD 不同小寫(xiě)字母表示P<0.05水平上的顯著差異性The different letters mean significant difference at P<0.05.下同The same below.

qRT-PCR分析RtSOD基因在NaCl、4 ℃、20% PEG、H2O2和ABA處理后長(zhǎng)葉紅砂中的表達(dá)特性(圖5)。結(jié)果顯示：在不同濃度NaCl脅迫下，隨濃度的升高RtSOD基因表達(dá)量呈先降低后升高之后又降低的趨勢(shì)，在200和600 mmol·L-1濃度下顯著低于對(duì)照組，而在400 mmol·L-1NaCl濃度下升高且顯著高于對(duì)照組(圖5A)，因此之后選取400 mmol·L-1NaCl對(duì)其進(jìn)行脅迫，分析不同時(shí)間梯度RtSOD基因的表達(dá)量，結(jié)果表明鹽脅迫3和6 h時(shí)無(wú)明顯差異，脅迫12 h后逐漸升高，24 h達(dá)到最高，之后逐漸降低，且48 h后顯著低于對(duì)照(圖5B)。在4 ℃脅迫下，隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，RtSOD基因表達(dá)量呈先升高后降低的趨勢(shì)，在12 h時(shí)達(dá)到最高，之后逐漸降低(圖5C)。PEG脅迫和ABA、H2O2處理下，RtSOD基因表達(dá)量均隨時(shí)間的延長(zhǎng)呈先降低后上升之后又降低的趨勢(shì)，PEG脅迫下其表達(dá)量在6 h時(shí)顯著降低，12 h時(shí)達(dá)到最高(圖5D)。ABA處理下3 h時(shí)顯著降低，之后逐漸升高，在6 h時(shí)達(dá)到最高，之后降低(圖5E)。 H2O2處理下RtSOD基因在6 h時(shí)表達(dá)量顯著降低， 12 h時(shí)達(dá)到最高，之后降低(圖5F)。以上結(jié)果表明不同非生物脅迫均可誘導(dǎo)長(zhǎng)葉紅砂RtSOD基因的表達(dá)。

2.4 植物表達(dá)載體的構(gòu)建

經(jīng)含KpnI和BamHI酶切位點(diǎn)的引物擴(kuò)增RtSOD基因ORF序列后，目的基因質(zhì)粒酶切后與pPZP221酶切質(zhì)粒連接，構(gòu)建真核表達(dá)載體pPZP221-RtSOD(圖6)。陽(yáng)性菌落通過(guò)PCR進(jìn)行驗(yàn)證，上下游引物分別為RtSOD-BamHI-F、RtSOD-KpnI-R，對(duì)其質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定。PCR結(jié)果與預(yù)期結(jié)果一致，得到663 bp的pPZP221-RtSOD序列。重組質(zhì)粒酶切后得到的兩條片段與目的基因和載體片段大小相符，最終確定重組載體構(gòu)建成功。

圖5 RtSOD基因在不同脅迫處理幼苗中表達(dá)量Fig.5 Expression of RtSOD in R. trigyna seedlings under different stress treatments

2.5 RtSOD轉(zhuǎn)基因擬南芥的鑒定

圖6 pPZP221-RtSOD重組表達(dá)載體Fig.6 pPZP221-RtSOD recombinate vector

將pPZP221-RtSOD陽(yáng)性重組質(zhì)粒通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化擬南芥，篩選出的T1代擬南芥通過(guò)基因組PCR和qRT-PCR的方法進(jìn)行鑒定，結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)基因擬南芥的7個(gè)株系中S1，S2，S3，S5，S6，S7均可擴(kuò)增出RtSOD的特異片段，而野生型擬南芥無(wú)擴(kuò)增，說(shuō)明RtSOD基因成功在S1，S2，S3，S5，S6，S76個(gè)株系中表達(dá)，而S4株系可能出現(xiàn)了假陽(yáng)性。之后通過(guò)qRT-PCR進(jìn)一步鑒定轉(zhuǎn)基因株系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)RtSOD在S2，S5，S6株系中表達(dá)量最高且明顯高于野生型(圖7)，最終篩選出S2，S5，S6三個(gè)株系繼續(xù)傳代，在含50 μg·mL-1Gent的1/2 MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)，到T3代獲得成活率100%、穩(wěn)定遺傳的RtSOD轉(zhuǎn)基因擬南芥植株(圖8)，用于后續(xù)研究。

圖7 RtSOD轉(zhuǎn)基因擬南芥qRT-PCR驗(yàn)證Fig.7 qRT-PCR identification of transgenic A. thaliana

圖8 抗生素培養(yǎng)基上篩選的T3代轉(zhuǎn)基因擬南芥Fig.8 Screening of transgenic A. thaliana on medium with gentamycin

M: DL2000 marker; WT: 野生型Wild-type; S1～S7:RtSOD轉(zhuǎn)基因擬南芥RtSODtransgenicA.thaliana. WT:野生型Wild-type; S2,S5,S6:轉(zhuǎn)基因擬南芥TransgenicA.thaliana.下同The same below.

2.6 不同脅迫下RtSOD轉(zhuǎn)基因擬南芥抗逆性分析

2.6.1RtSOD基因的過(guò)表達(dá)提高了轉(zhuǎn)基因擬南芥對(duì)鹽、干旱脅迫的耐受性 首先對(duì)野生型擬南芥和S2，S5，S6三個(gè)純合的轉(zhuǎn)基因株系根長(zhǎng)進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)在正常條件下野生型和轉(zhuǎn)基因幼苗的根長(zhǎng)無(wú)明顯差別，在100、150 mmol·L-1NaCl脅迫下，幼苗根長(zhǎng)隨濃度增加逐漸縮短，但轉(zhuǎn)基因株系明顯長(zhǎng)于野生型，且在150 mmol·L-1NaCl濃度下差異顯著(圖9)。在100、150、200 mmol·L-1甘露醇脅迫下，隨著甘露醇濃度的增加幼苗生長(zhǎng)受到影響，但轉(zhuǎn)基因株系根長(zhǎng)仍顯著長(zhǎng)于野生型(圖10)。上述結(jié)果都表明RtSOD基因的過(guò)表達(dá)可提高轉(zhuǎn)基因植株對(duì)鹽、干旱脅迫的耐受性。

圖9 NaCl脅迫下野生型和轉(zhuǎn)基因擬南芥根長(zhǎng)的檢測(cè)Fig.9 Measurement of primary root length of RtSOD transgenic and wild-type A. thaliana under NaCl stress

為了進(jìn)一步確定RtSOD基因與植物抗逆性的關(guān)系，對(duì)野生型和轉(zhuǎn)基因擬南芥在鹽、干旱脅迫下的表型進(jìn)行了分析，并測(cè)定其鮮重和葉綠素含量?；谏鲜鰧?shí)驗(yàn)結(jié)果，選取150 mmol·L-1為最適NaCl脅迫濃度對(duì)植物進(jìn)行鹽脅迫，停止?jié)菜畬?duì)其進(jìn)行干旱脅迫，脅迫時(shí)間10 d。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：正常條件下野生型和轉(zhuǎn)基因擬南芥生長(zhǎng)狀況無(wú)明顯差異，鹽和干旱脅迫后轉(zhuǎn)基因植株明顯好于野生型(圖11A)。且脅迫后轉(zhuǎn)基因植株的鮮重和葉綠素含量都顯著高于野生型(圖11B、C)。綜合分析說(shuō)明，RtSOD基因的過(guò)表達(dá)可提高轉(zhuǎn)基因植物對(duì)鹽和干旱脅迫的耐受性。

2.6.2RtSOD基因的過(guò)表達(dá)提高了轉(zhuǎn)基因擬南芥在鹽、干旱脅迫下的抗氧化能力 由于RtSOD基因與植物的抗氧化系統(tǒng)相關(guān)，因此，為了確定脅迫條件下RtSOD在擬南芥抗氧化系統(tǒng)中發(fā)揮的功能，檢測(cè)了鹽、干旱脅迫下RtSOD轉(zhuǎn)基因和野生型擬南芥中SOD，POD，CAT活性，MDA、脯氨酸及H2O2含量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：在鹽和干旱脅迫下，轉(zhuǎn)基因擬南芥中SOD，POD，CAT活性升高且顯著高于野生型(圖12)。MDA和H2O2的含量較對(duì)照升高，但轉(zhuǎn)基因顯著低于野生型(圖12)。此外，脅迫條件下，轉(zhuǎn)基因擬南芥的脯氨酸含量升高且顯著高于野生型(圖12)。這些結(jié)果表明，RtSOD基因的過(guò)表達(dá)可提高轉(zhuǎn)基因植株中的抗氧化酶活性及脯氨酸含量，降低活性氧積累，減輕膜損傷，從而提高轉(zhuǎn)基因植物的抗氧化性。

圖10 甘露醇脅迫下野生型和轉(zhuǎn)基因擬南芥根長(zhǎng)的檢測(cè)Fig.10 Measurement of primary root length of RtSOD transgenic and wild-type A. thaliana under mannitol stress

圖11 RtSOD轉(zhuǎn)基因擬南芥抗逆分析Fig.11 Resistance analysis of RtSOD transgenic A. thaliana

圖12 野生型和RtSOD轉(zhuǎn)基因擬南芥中SOD,POD,CAT活性及MDA,H2O2,脯氨酸含量Fig.12 SOD,POD,CAT activity and MDA,H2O2, proline content of wild-type and RtSOD transgenic A. thaliana

圖13 NaCl脅迫下野生型和RtSOD轉(zhuǎn)基因擬南芥株系中脅迫相關(guān)基因表達(dá)量分析Fig.13 Expression analysis of stress-related genes in RtSOD transgenic lines and wild-type plants under salt stress

2.6.3鹽、干旱脅迫下RtSOD的過(guò)表達(dá)促進(jìn)轉(zhuǎn)基因擬南芥中脅迫相關(guān)基因的表達(dá) 利用qRT-PCR測(cè)定了150 mmol·L-1NaCl和干旱脅迫后轉(zhuǎn)基因擬南芥中脅迫相關(guān)基因的表達(dá)量。結(jié)果顯示，在鹽脅迫下(圖13)，RtSOD轉(zhuǎn)基因植株中抗氧化相關(guān)基因AtAPX1，AtCAT1和AtPOD1，鹽脅迫相關(guān)基因AtSOS1及脯氨酸合成相關(guān)基因AtP5CS2表達(dá)量都顯著高于野生型。干旱脅迫下，RtSOD轉(zhuǎn)基因植株中抗氧化相關(guān)基因AtSOD1，AtCAT1，AtPOD1，脯氨酸合成相關(guān)基因AtP5CS1以及干旱脅迫相關(guān)基因AtRD29A的表達(dá)量都高于野生型(圖14)。由此說(shuō)明，鹽、干旱脅迫條件下，擬南芥中RtSOD基因的過(guò)表達(dá)可能通過(guò)提高抗氧化、脯氨酸合成以及離子轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因表達(dá)量，從而增強(qiáng)其對(duì)脅迫的耐受性。

圖14 干旱脅迫下野生型和RtSOD轉(zhuǎn)基因擬南芥中脅迫相關(guān)基因表達(dá)量分析Fig.14 Expression analysis of stress-related genes in RtSOD transgenic lines and wild-type plants under drought stress

3 討論

作為植物響應(yīng)逆境脅迫過(guò)程中重要抗氧化酶，SOD可被多種逆境脅迫誘導(dǎo)表達(dá)，從而發(fā)揮作用，使得植物能夠適應(yīng)脅迫環(huán)境。研究發(fā)現(xiàn)鹽、干旱、高溫、低溫等非生物脅迫均可誘導(dǎo)植物體內(nèi)SOD的表達(dá)，從而提高其抗逆性[29-34]。長(zhǎng)葉紅砂作為一種獨(dú)特的強(qiáng)旱生泌鹽鹽生植物，鹽脅迫下其體內(nèi)SOD活性明顯升高，進(jìn)而推測(cè)長(zhǎng)葉紅砂對(duì)荒漠環(huán)境具有極強(qiáng)適應(yīng)性的原因之一是由于SOD活性水平的升高[26]，因此，研究RtSOD基因的功能對(duì)進(jìn)一步挖掘長(zhǎng)葉紅砂逆境調(diào)控機(jī)制具有深遠(yuǎn)的意義。本研究從長(zhǎng)葉紅砂中克隆得到RtSOD基因，之后根據(jù)逆境脅迫下其他植物中SOD的表達(dá)特點(diǎn)選取了NaCl、4 ℃、PEG、H2O2以及ABA等非生物脅迫研究RtSOD的表達(dá)特性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在4 ℃脅迫下RtSOD基因表達(dá)量呈先升高后降低的趨勢(shì)，而在NaCl、PEG、H2O2以及ABA脅迫下，RtSOD基因表達(dá)量隨時(shí)間變化呈先降低后升高之后又降低的趨勢(shì)，說(shuō)明多種環(huán)境脅迫均可誘導(dǎo)該基因的表達(dá)，不同脅迫下基因的表達(dá)模式有一定差異，但其表達(dá)峰值均出現(xiàn)在6 h以后，說(shuō)明當(dāng)植物遭受環(huán)境脅迫時(shí)，其體內(nèi)的活性氧積累逐漸增加，當(dāng)活性氧積累達(dá)到一定水平時(shí)，才會(huì)誘導(dǎo)植物體內(nèi)RtSOD基因的表達(dá)，并達(dá)到峰值，之后隨著體內(nèi)活性氧被清除，其表達(dá)量降低。

將RtSOD轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)入擬南芥，進(jìn)一步研究RtSOD基因的抗逆功能，結(jié)果顯示，在鹽、干旱脅迫下轉(zhuǎn)基因植株中的根長(zhǎng)、生物量及葉綠素含量都較野生型高，說(shuō)明RtSOD基因的過(guò)表達(dá)增強(qiáng)了擬南芥對(duì)非生物脅迫的耐受性。這與先前其他關(guān)于SOD基因的研究結(jié)果相一致，轉(zhuǎn)基因煙草中Cu/ZnSOD基因的過(guò)表達(dá)增強(qiáng)其對(duì)非生物脅迫的抗性[35]。Negi等[36]的研究表明,SOD基因可通過(guò)提高植物中其他抗氧化酶活性及促進(jìn)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的積累來(lái)增強(qiáng)植物抗鹽能力。在本研究中發(fā)現(xiàn)RtSOD基因過(guò)表達(dá)后，鹽和干旱脅迫條件下轉(zhuǎn)基因擬南芥中SOD、POD、CAT等抗氧化酶活性及脯氨酸含量均升高，H2O2和MDA含量降低，表明RtSOD基因也可通過(guò)提高抗氧化酶活性及促進(jìn)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)積累來(lái)增強(qiáng)其對(duì)鹽、干旱脅迫的耐受性。此外，轉(zhuǎn)基因擬南芥中抗氧化相關(guān)基因AtSOD1、AtPOD1、AtCAT1，脯氨酸合成關(guān)鍵基因AtP5CS1，以及離子轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因AtSOS1的表達(dá)量均上調(diào)，基于這些抗逆相關(guān)基因在植物抵御逆境脅迫過(guò)程中發(fā)揮的重要功能[37-39]，推測(cè)RtSOD基因也可能通過(guò)誘導(dǎo)這些脅迫相關(guān)基因的表達(dá)來(lái)提高植物的抗氧化能力、促進(jìn)植物的滲透調(diào)節(jié)能力及維持植物體內(nèi)離子平衡能力，從而增強(qiáng)其抗逆性。

參考文獻(xiàn)References：

[1] Boyer J S. Plant productivity and environment. Science, 1982, 218: 443-448.

[2] Das S K, Patra J K, Thatoi H. Antioxidative response to abiotic and biotic stresses in mangrove plants: A review. International Review of Hydrobiology, 2016, 101(1/2): 3-19.

[3] Potters G, Horemans N, Jansen M A. The cellular redox state in plant stress biology-A charging concept. Plant Physiology & Biochemistry, 2010, 48(5): 292-300.

[4] Alscher R G, Erturk N, Heath L S. Role of superoxide dismutases (SODs) in controlling oxidative stress in plants. Journal of Experimental Botany, 2002, 53: 1331-1341.

[5] Neill S J, Desikan R, Clarke A,etal. Hydrogen peroxide and nitric oxideas signalling molecules in plants. Journal of Experimental Botany, 2002, 53: 1237-1247.

[6] Bowler C, Montagu M V, Inze D. Superoxide dismutase and stress tolerance. Annual Review of Plant Biology, 2003, 43(1): 83-116.

[7] Van C W, Capiau K, Van M M,etal. Enhancement of oxidative stress tolerance in transgenic tobacco plants overproducing Fe-superoxide dismutase in chloroplasts. Plant Physiology, 1996, 112(4): 1703-1714.

[8] McKersie B D, Chen Y. Superoxide dismutase enhances tolerance of freezing stress in transgenic alfalfa (MedicagosativaL.). Plant Physiology, 1993, 103(4): 1155-1163.

[9] Feng W, Wang H, Bing L,etal. Cloning and characterization of a novel splicing isoform of the iron-superoxide dismutase gene in rice (OryzasativaL.). Plant Cell Reports, 2006, 24(12): 734-742.

[10] Wang M, Xin Z, Zhen X,etal. A wheat superoxide dismutase gene TaSOD2, enhances salt resistance through modulating redox homeostasis by promoting NADPH oxidase activity. Plant Molecular Biology, 2016, 91(1/2): 1-16.

[11] Pitcher L H, Zilinskas B A. Overexpression of copper/zinc superoxide dismutase in the cytosol of transgenic tobacco confers partial resistance to ozone-induced foliar necrosis. Plant Physiology, 1996, 110(2): 583-588.

[12] Feng K, Yu J, Cheng Y,etal. The SOD gene family in tomato: identification, phylogenetic relationships, and expression patterns. Frontiers in Plant Science, 2016, 7(131): 1279.

[13] Hu G H, Yu S X, Fan S L,etal. Cloning and expression of the chloroplast copper/zinc-superoxide dismutase gene in upland cotton (GossypiumhirsutumL.). Journal of Plant Physiology and Molecular Biology, 2007, 33(33): 197-204.

[14] Li K, Pang C H, Ding F,etal. Overexpression ofSuaedasalsa, stroma ascorbate peroxidase inArabidopsis, chloroplasts enhances salt tolerance of plants. South African Journal of Botany, 2012, 78(1/2): 235-245.

[15] Yang Y L, Shi R X, Wei X L,etal. Effect of salinity on antioxidant enzymes in calli of the halophyteNitrariatangutorumBobr. Plant Cell, Tissue and Organ Culture (PCTOC), 2010, 102(3): 387-395.

[16] Zhao Y Z. Vascular plants of plateau ordos. Hohhot: Inner Mongolia University Press, 2006: 47.

趙一之. 鄂爾多斯高原維管植物. 呼和浩特: 內(nèi)蒙古大學(xué)出版社, 2006: 47.

[17] Ma Y Q. Inner Mongolia flora (Volume 3). Hohhot: Inner Mongolia People’s Publishing House, 1989: 519-522.

馬疏泉. 內(nèi)蒙古植物志(第三卷).呼和浩特: 內(nèi)蒙古人民出版社, 1989: 519-522.

[18] Yang C, Wang Y C, Liu Q,etal. Conservation biology ofTetraenamongolicaMaxim. Beijing: Science Press, 2002.

楊持, 王迎春, 劉強(qiáng), 等. 四合木保護(hù)生物學(xué). 北京: 科學(xué)出版社, 2002.

[19] Xue Y, Wang Y C, Wang T Z. Physiological and biochemical mechanisms of an endemic halophyteReaumuriatrigynaMaxim under salt stress.Acta Botanica Boreali-Occidentalia Sinica, 2012, 32(1): 136-142.

薛焱, 王迎春, 王同智. 瀕危植物長(zhǎng)葉紅砂適應(yīng)鹽脅迫的生理生化機(jī)制研究. 西北植物學(xué)報(bào), 2012, 32(1): 136-142.

[20] Xue Y, Wang Y C. Study on characters of ions secretion fromReaumuriatrigyna. Journal of Desert Research, 2008, 28(3): 437-442.

薛焱, 王迎春. 鹽生植物長(zhǎng)葉紅砂泌鹽特性的研究.中國(guó)沙漠, 2008, 28(3): 437-442.

[21] Xue Y, Wang Y C. Influence of light, temperature and salinity on seed germination ofReaumuriatrigynaMaxim. Plant Physiology Communications, 2007, 43(4): 708-710.

薛焱, 王迎春. 光照, 溫度和鹽分對(duì)長(zhǎng)葉紅沙種子萌發(fā)的影響. 植物生理學(xué)通訊, 2007, 43(4): 708-710.

[22] Dang Z H, Zheng L L, Feng Z,etal. Cloning and sequence analysis of the plasma membrane Na+/H+antiporter cDNA in recretohalophyteReaumuriatrigynaMaxim. Acta Agriculturae Boreali-Sinica, 2013, 28(3): 1-6.

黨振華, 鄭琳琳, 馮智, 等. 泌鹽植物長(zhǎng)葉紅砂質(zhì)膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因(RtSOS1)全長(zhǎng)cDNA 的克隆及序列分析. 華北農(nóng)學(xué)報(bào), 2013, 28(3): 1-6.

[23] Dang Z H, Zheng L L,Wang Y C,etal.Transcriptomic profiling of the salt-stress response in the wild recretohalophyteReaumuriatrigyna. BMC Genomics, 2013, 14(1): 29.

[24] Dang Z H, Qi Q, Zhang H R,etal. Identification of salt-stress-induced genes from the RNA-Seq data ofReaumuriatrigynausing differential-display reverse transcription PCR. International Journal of Genomics, 2014, 2014: 1-16.

[25] Wang J, Zheng L L, Gu T P,etal. Cloning and expression analysis of two WRKY transcription factors from the rare recretohalophyteReaumuriatrigyna. Acta Prataculturae Sinica, 2014, 23(4): 122-129.

王佳, 鄭琳琳, 顧天培, 等. 珍稀泌鹽植物長(zhǎng)葉紅砂兩個(gè)WRKY轉(zhuǎn)錄因子的克隆及表達(dá)分析. 草業(yè)學(xué)報(bào), 2014, 23(4): 122-129.

[26] Xue Y, Wang Y C, Wang T Z. Responses of antioxidant system of an endemic halophyteReaumuriatrigynato NaCl stress. Journal of Desert Research, 2012, 32(6): 1659-1673.

薛焱, 王迎春, 王同智. 鹽脅迫對(duì)瀕危植物長(zhǎng)葉紅砂抗氧化系統(tǒng)的影響. 中國(guó)沙漠, 2012, 32(6): 1659-1673.

[27] Dang Z H. Transcmptomic study of the salt-stress response in the revretohalophyteReaumuriatrigynanative to alxadesert. Huhhot: Inner Mongolia University, 2013.

黨振華. 阿拉善荒漠區(qū)珍稀泌鹽植物長(zhǎng)葉紅砂響應(yīng)鹽脅迫的轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究. 呼和浩特: 內(nèi)蒙古大學(xué), 2013.

[28] Zhang H R. Analysis the function of key genes in flavonoid biosynthetic pathway and the pathway in response to abiotic stresses inReaumuriatrigyna. Huhhot: Inner Mongolia University, 2016.

張慧榮. 長(zhǎng)葉紅砂黃酮類(lèi)化合物合成相關(guān)基因功能分析及其對(duì)逆境脅迫的響應(yīng). 呼和浩特: 內(nèi)蒙古大學(xué), 2016.

[29] Li A H, Na B K, Ahn S K,etal. Functional expression and characterization of a cytosolic copper/zinc-superoxide dismutase ofSpirometraerinacei. Parasitology Research, 2010, 106(3): 627-635.

[30] Morita S, Tsukamoto S, Sakamoto A. Differences in intron-mediated enhancement of gene expression by the first intron of cytosolic superoxide dismutase gene from rice in monocot and dicot plants. Plant Biotechnology, 2012, 29(1): 115-119.

[31] Abu S. Isolation and expression analysis of chloroplastic copper/zinc superoxide dismutase gene in barley. South African Journal of Botany, 2011, 77(2): 328-334.

[32] Gómez J M, Jiménez A, Olmos E,etal. Location and effects of long-term NaCl stress on superoxide dismutase and ascorbate peroxidase isoenzymes of pea (Pisumsativumcv.Puget) chloroplasts. Journal of Experimental Botany, 2004, 55: 119-130.

[33] Hernández-Nistal J, Dopico B, Labrador E. Cold and salt stress regulates the expression and activity of a chickpea cytosolic Cu/Zn superoxide dismutase. Plant Science, 2002, 163(3): 507-514.

[34] Guan L, Scandalios J G.Two strucrally similar maize cytosolic superoxide dismutase genes, SodA and Sod4A, respond differently to abscisic acid and high osmoticun.Plant Physiology, 1998, 117(1): 217-224.

[35] Youngpyo L, Ahmad R, Haengsoon L,etal. Improved tolerance of Cu/Zn superoxide dismutase and ascorbate peroxidase expressing transgenic tobacco seeds and seedlings against multiple abiotic stresses. International Journal of Agriculture & Biology, 2013, 15(4): 725-730.

[36] Negi N P, Shrivastava D C, Sharna V,etal. Overexpression of Cu/Zn SOD fromArachishypogaeaalleviates salinity and drought stress in tobacco.Plant Cell Reports, 2015, 34(7): 1109-1126.

[37] Du Y Y, Wang P C, Chen J,etal. Comprehensive functional analysis of the catalase gene family inArabidopsisthaliana. Acta Botanica Sinica, 2008, 50(10): 1318-1326.

[38] Tuteja N.Mechanisms of high salinity tolerance in plants.Methods in Enzymology, 2007, 428: 419.

[39] Feki K, Brini F, Amar S B,etal. Comparative functional analysis of two wheat Na+/H+, antiporter SOS1, promoters inArabidopsisthaliana, under various stress conditions. Journal of Applied Genetics, 2015, 56(1): 15-26.