周期性變動飼糧蛋白質(zhì)水平對內(nèi)蒙古白絨山羊內(nèi)源尿素氮循環(huán)和微生物蛋白質(zhì)合成的影響

樊艷華 孫海洲 桑 丹 李勝利 張春華 珊 丹

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，呼和浩特 010018;2.內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院動物營養(yǎng)與飼料研究所，呼和浩特 010031)

反芻動物與單胃動物相比氮利用率較低，為20%～30%，其70%～80%的飼糧氮隨糞尿排出體外。所以，通過飼糧管理和周期性的改變飼糧的飼喂方式來提高反芻動物氮利用率是緩解環(huán)境污染的一個重要手段。Kiran 等［1］和 Cole等［2］在綿羊和牛上研究發(fā)現(xiàn)，飼喂變動蛋白質(zhì)水平的飼糧可調(diào)動反芻動物的尿素氮循環(huán)機制，降低糞氮、尿氮排出量，增加沉積氮/攝入氮，而且用于合成的微生物蛋白質(zhì)的氮增加，機體氮利用率提高。Muscher等［3］通過 Ussing Chamber(US)灌注取瘤胃上皮模擬尿素氮轉(zhuǎn)運來測定尿素氮在瘤胃的流通量，結(jié)果顯示與中氮飼糧組和變動高氮飼糧組相比，飼喂2 d變動低氮飼糧的羊屠宰后，尿素氮在基膜的流通量更大。

本試驗以充分利用尿素氮周轉(zhuǎn)規(guī)律為目標，研究周期性變動飼糧蛋白質(zhì)水平對絨山羊機體內(nèi)源尿素氮循環(huán)及微生物蛋白質(zhì)合成的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

本試驗選用9只體況良好，體重為(45.63±3.15)kg的裝有永久性瘤胃瘺管的內(nèi)蒙古白絨山羊半同胞羯羊。按體重隨機分為3組，每組3只。單籠飼養(yǎng)，常規(guī)光照、驅(qū)蟲與管理，自由飲水。

1.2 飼糧設(shè)計

基礎(chǔ)飼糧參照我國《肉羊飼養(yǎng)標準》NY/T 816—2004配制，共低蛋白質(zhì)飼糧(low protein diet，LPD)、中 蛋 白 質(zhì) 飼 糧 (medium protein diet，MPD)和高蛋白質(zhì)飼糧(high protein diet，HPD)3種，其組成及營養(yǎng)水平見表1。代謝能為1.4倍維持需要。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))Table 1 Composition and nutrient levels of basal diets(DM basis)

1.3 試驗設(shè)計

9只羊采用單因子隨機區(qū)組試驗設(shè)計分為3組，分別飼喂中蛋白質(zhì)飼糧、變動低蛋白質(zhì)飼糧(oscillating LPD，OSC-LPD)(2 d低蛋白質(zhì)飼糧—2 d高蛋白質(zhì)飼糧，循環(huán)飼喂)、變動高蛋白質(zhì)飼糧(oscillating HPD，OSC-HPD)(2 d高蛋白質(zhì)飼糧—2 d低蛋白質(zhì)飼糧，循環(huán)飼喂)。預(yù)試期16 d，正試期12 d。全期飼喂上述飼糧。

1.4 同位素灌注的方法

在正試期的第4天給試驗動物的頸靜脈安裝無菌塑料導(dǎo)管(來自于無菌麻醉包)。從第5天開始連續(xù)灌注4 d的［15N15N］-尿素(美國Sigma公司，豐度為98%)，根據(jù)飼糧蛋白質(zhì)水平，計算出飼喂低、中、高蛋白質(zhì)飼糧時對應(yīng)的同位素灌注量分別為 205.9、343.0 和 476.2 mg/d，同一個變動周期(4 d)內(nèi)，灌注總量相等，為 823.6 mg/d。

1.5 樣品采集

1.5.1 瘤胃液的采集

瘤胃液采集:正試期第5～8天的10:00采瘤胃液，將采集的瘤胃液直接測定pH后用4層紗布過濾，將濾液在3 052×g條件下離心15 min，取0.5 mL上清液用來測定氨氮(NH3-N)濃度，另取0.5 mL上清液加25%的偏磷酸后用于測定揮發(fā)性脂肪酸(VFA)濃度。

1.5.2 血樣采集

正試期第5～8天的08:30由試驗動物頸靜脈采血10 mL，緩慢注入涂有肝素(750 IU)的離心管(始終置于冰盒)中，在 30 min內(nèi)于 4℃2 000×g條件下離心15 min分離血漿樣本，制備樣品置于-20℃保存。

1.5.3 糞尿樣收集

尿樣采集:正試期第5～12天收集尿樣，用濃度為10%的H2SO4(100 mL/d)來調(diào)整尿液pH＜3。記錄每天總排尿量，過濾后留取10%，分為2份分別用于測定尿氮排出量和［15N15N］-尿素和［14N15N］-尿素含量，于-20℃保存。另外，取10 mL原尿液用蒸餾水稀釋到50 mL分裝為3份，于-20℃保存，以備測定嘌呤衍生物含量。在正試期的第1～4天以相同的處理方法收集尿液用于測定尿中原有的［15N15N］-尿素和［14N15N］-尿素含量，作為后期計算的對照數(shù)據(jù)。

糞樣采集:正試期第5～12天收集動物鮮糞樣，稱重后分為2份裝袋用于測定糞氮和15N含量，冷凍保存。在試驗期的第1～4天以相同的處理方法收集糞樣用于測定糞中原有的15N含量。

1.6 樣品的分析方法

1.6.1 常規(guī)營養(yǎng)成分

糞尿樣品的干物質(zhì)(dry matter，DM)、粗蛋白質(zhì)(crude protein，CP)、中性洗滌纖維(neutral detergent fiber，NDF)、酸性洗滌纖維(acid detergent fiber，ADF)、鈣(calcium，Ca)和磷(phosphorus，P)的測定依據(jù)《飼料分析及飼料質(zhì)量檢測技術(shù)》［6］測定。

1.6.2 尿素氮

血漿尿素氮(plasma urea nitrogen，PUN)、尿中尿素氮瘤胃液NH3-N濃度以及尿氮、糞氮排出量的測定參照杜建文［7］的方法。

1.6.3 內(nèi)源尿素氮循環(huán)

使用同位素質(zhì)譜儀(Flash 2000—MAT253聯(lián)用，美國Thermoelectric公司)測定15N含量，由中國科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所完成。

計算糞尿中15N/14N的比值，用于計算進入糞中尿素氮(urea-N loss to feces，UFE)、進入尿中尿素氮(urea-N loss to urine，UUE)含量。

參照 Sarrasecal［8］和 Lobley 等［9］的方法，計算肝臟合成的內(nèi)源尿素氮(urea-N endogenous produced in liver，UER)、進入胃腸道中的尿素氮(urea-N recycling to the gastrointestinal tract，GER)以及GER當中返回鳥氨酸循的尿素氮(urea-N returned to ornithine cycle，ROC)、用于再合成的尿素氮(urea-N re-used for anabolism，UUA)的含量，計算各部分所占的比例。公式如下:

式中:ED30為每天灌注的［15N15N］-尿素的豐度(%);EU30為尿中［15N15N］-尿素的豐度(%)，D30為［15N15N］-尿素的灌注量(mg/d);UUE30為穩(wěn)定期(正試期第5～12天)尿中［15N15N］-尿素的量(mg/d);u為進入尿中尿素氮/肝臟合成的內(nèi)源尿素氮;P為尿中同位素含量比值;UUE29為穩(wěn)定期尿中［14N15N］-尿素的量(mg/d);r為ROC/GER;f為 UFE/GER;a為 UUA/GER。

1.6.4 嘌呤衍生物

尿中嘌呤衍生物排出量的測定參照Chen等［10］的方法測定。

1.6.4.1 尿中嘌呤衍生物排出量

尿中嘌呤衍生物排出量(mmol/d)=尿囊素+尿酸+黃嘌呤+次黃嘌呤。

1.6.4.2 嘌呤衍生物攝取量

Y=0.76×X+(0.202×W0.75×e-0.25)［11］。

式中:X為山羊嘌呤衍生物的攝取量(mmol/d);Y為尿中嘌呤衍生物排出量(mmol/d);0.76代表尿中排出的嘌呤衍生物占總攝取嘌呤衍生物的比例，是個恒定值［8］;0.202 也是一個恒定值，代表內(nèi)源嘌呤供給量(mmol/kg W0.75)［12］。

1.6.5 微生物蛋白質(zhì)合成量

MN=X×70/(0.116×0.83×1 000)=0.727×X［13］。

式中:MN為微生物蛋白質(zhì)合成量(g/d，以氮含量計)，微生物嘌呤的消化吸收率為0.83，嘌呤中氮的含量是70 mg/mmol，嘌呤中的氮/瘤胃微生物總氮為 0.116。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)處理采用SAS 9.0軟件的ANOVA進行單因素方差分析。結(jié)果均以平均值±標準差表示，以P＜0.05作為差異顯著判斷標準，以 P＞0.05作為差異不顯著判斷標準。

2 結(jié)果

2.1 瘤胃發(fā)酵參數(shù)

從表2可見，中蛋白質(zhì)飼糧組與變動蛋白質(zhì)飼糧組比較，瘤胃液pH顯著降低(P＜0.05)，瘤胃液NH3-N 濃度顯著增加(P＜0.05)，乙酸、丙酸和總VFA的濃度顯著降低(P＜0.05)。變動低蛋白質(zhì)與變動高蛋白質(zhì)飼糧組比較，瘤胃液NH3-N濃度顯著降低(P＜0.05)，乙酸濃度顯著增加(P＜0.05)，丁酸濃度顯著降低(P＜0.05)，乙酸/丙酸顯著增加(P＜0.05)，總 VFA濃度無顯著變化(P＞0.05)。

表2 周期性變動飼糧蛋白質(zhì)水平對山羊瘤胃發(fā)酵參數(shù)的影響Table 2 Effects of oscillating dietary protein levels on ruminal fermentation parameters of goats

2.2 氮代謝

從表3可見，中蛋白質(zhì)飼糧與變動蛋白質(zhì)飼糧組比較，干物質(zhì)采食量、攝入氮的量、糞氮/總排出氮、尿氮/總排出氮和血漿尿素氮濃度無顯著差異(P＞0.05)，糞氮、尿氮排出量及總排出氮/攝入氮和尿中尿素氮含量顯著增加(P＜0.05)，沉積氮和沉積氮/攝入氮顯著降低(P＜0.05)。變動高蛋白質(zhì)飼糧組與變動低蛋白質(zhì)飼糧組比較，以上指標均無顯著差異(P＞0.05)。

2.3 內(nèi)源尿素氮循環(huán)

從圖1、圖2可見，飼喂中蛋白質(zhì)飼糧時，尿中［15N15N］-尿素的豐度在24～48 h內(nèi)達到平臺期，然而［14N15N］-尿素的豐度在48～72 h內(nèi)達到平臺期;飼喂變動高蛋白質(zhì)飼糧尿中［15N15N］-尿素和尿中［14N15N］-尿素在 0～26 h增長最快，在48～72 h增長減緩;飼喂變動低蛋白質(zhì)飼糧尿中［15N15N］-尿素和尿中［14N15N］-尿素都呈增長趨勢。從圖3可見，糞中15N的豐度在3種不同條件下，連續(xù)灌注4 d內(nèi)都呈逐漸增加趨勢，無平臺期。

表3 周期性變動飼糧蛋白質(zhì)水平對山羊氮代謝的影響Table 3 Effects of oscillating dietary protein levels on nitrogen metabolites of goats

圖1 尿中［14N15N］－尿素的豐度Fig.1 Abundance of［14N 15N］-urea in urine

圖2 尿中［15 N15 N］－尿素的豐度Fig.2 Abundance of［15 N 15 N］-urea in urine

圖3 糞中15 N的豐度Fig.3 Abundance of 15 N in feces

從表4可見，與中蛋白質(zhì)飼糧組相比，飼喂變動蛋白質(zhì)飼糧后，山羊 UER、GER、ROC和 UUE的含量顯著減少(P＜0.05)，UFE的含量無顯著變化(P＞0.05)，UUE/UER 和 ROC/GER 顯著減少(P＜0.05)，UFE/GER 和 UUA/GER 顯著增加(P＜0.05)。與中蛋白質(zhì)飼糧組相比，飼喂變動高蛋白質(zhì)飼糧，UUA的含量無顯著變化(P＞0.05)，飼喂變動低蛋白質(zhì)飼糧UUA的含量顯著減少(P＜0.05)，但飼喂2種變動蛋白質(zhì)飼糧均使 UUA/GER 顯著增加(P＜0.05)。

表4 周期性變動飼糧蛋白質(zhì)水平對山羊內(nèi)源尿素氮循環(huán)的影響Table 4 Effects of oscillating dietary protein levels on endogenous urea nitrogen recycling of goats

2.4 微生物蛋白質(zhì)合成量

從表5可見，中蛋白質(zhì)飼糧組與變動蛋白質(zhì)飼糧組比較，黃嘌呤+次黃嘌呤的排出量無顯著差異(P＞0.05)，尿酸排出量顯著增加(P＜0.05)，尿囊素、尿中嘌呤衍生物排出量和微生物蛋白質(zhì)合成量顯著降低(P＜0.05)。然而變動低蛋白質(zhì)飼糧組與變動高蛋白質(zhì)飼糧組比較，以上指標均無顯著差異(P＞0.05)。

3 討 論

3.1 飼喂變動蛋白質(zhì)水平飼糧對內(nèi)蒙古白絨山羊瘤胃發(fā)酵參數(shù)的影響

瘤胃液pH是綜合反映瘤胃微生物、代謝產(chǎn)物、有機酸產(chǎn)生、吸收、排除及中和狀況的一項綜合指標。研究發(fā)現(xiàn)，瘤胃液pH的變化范圍為5.0～7.5，變動的規(guī)律取決于飼糧性質(zhì)和飼喂后的時間［14］。本試驗中絨山羊瘤胃液pH變化范圍為6.13～6.33，符合反芻動物瘤胃液pH 的變化規(guī)律，而且變動蛋白質(zhì)飼糧組與中蛋白質(zhì)飼糧組相比，瘤胃液pH更高一些。

瘤胃液NH3-N濃度是微生物蛋白質(zhì)合成的一個關(guān)鍵因素。Satter等［15］通過體外試驗發(fā)現(xiàn)在最適的瘤胃液NH3-N濃度下，微生物蛋白質(zhì)的合成量達到最大，為5.0 mg/dL。已有研究顯示，在廣泛的飼糧下瘤胃液NH3-N濃度都大于5.0 mg/dL。需要指出的是，在動物采食4 h以后測定的瘤胃液NH3-N濃度最高，而且可能是1 d中最佳的值。但Firkins等［16］提出的瘤胃液NH3-N濃度與微生物蛋白質(zhì)合成量的最大值和最佳值是矛盾的。瘤胃液NH3-N濃度增加能促進微生物蛋白質(zhì)的合成，但是動物氮利用率會降低。所以，尋求一個最佳瘤胃液NH3-N濃度很重要。本試驗中飼喂變動蛋白質(zhì)水平飼糧后，絨山羊瘤胃液NH3-N濃度降低，微生物蛋白質(zhì)的合成量增加。

VFA是飼糧中碳水化合物瘤胃發(fā)酵的終產(chǎn)物，是反芻動物主要的能量來源，約為反芻動物吸收能量的70%～80%。本試驗中飼喂變動蛋白質(zhì)水平飼糧后，絨山羊瘤胃液乙酸濃度增加，說明纖維素分解菌活性增加，與Colmenero等［17］研究得到的結(jié)果相似。本試驗中，絨山羊瘤胃液丙酸和丁酸濃度增加，丙酸是葡萄糖的合成前體，90%的丙酸在肝臟中進行糖異生，其余則在腎臟中轉(zhuǎn)變成葡萄糖。而丁酸濃度增加可能是來自高氮濃度飼糧的真蛋白質(zhì)的氨基酸的氧化脫氨基作用和脫羧作用造成的，這與 Ipharraguerre等［18］在奶牛上得到的結(jié)果相似。

3.2 飼喂變動蛋白質(zhì)水平飼糧對內(nèi)蒙古白絨山羊機體氮代謝的影響

已有研究表明，影響反芻動物氮排出的主要因素是攝入氮的量［19-20］。Reynolds 等［21］研究發(fā)現(xiàn)降低攝入氮的量能夠降低氮排出，但同時也可能降低動物體重和產(chǎn)奶量。而相比之下許多的研究發(fā)現(xiàn)改變飼糧的飼喂方式能夠在保持反芻動物氮需求不變的基礎(chǔ)上減少氮排出。在圈養(yǎng)牛［2，22］和綿羊［1］上都得到相似的結(jié)論。

本試驗中飼喂變動蛋白質(zhì)水平飼糧與穩(wěn)定的飼糧蛋白質(zhì)水平比較，絨山羊氮攝入量無顯著差異，但糞氮、尿氮排出量降低，沉積氮增加，沉積氮/攝入氮提高。這與Cole等［2］得出的結(jié)果一致，特別是在飼喂中蛋白質(zhì)飼糧時尿中尿素氮排出量較高。從環(huán)境的角度看，尿中尿素氮是最大的污染物，50%～90%在空氣下迅速揮發(fā)。通過降低瘤胃液NH3-N濃度來降低尿中尿素氮含量，可提高牧場營養(yǎng)管理和環(huán)境管理［23-24］。

3.3 飼喂變動蛋白質(zhì)水平飼糧對內(nèi)蒙古白絨山羊內(nèi)源尿素氮循環(huán)的影響

研究表明，如果飼糧氮水平的變動與腸道內(nèi)消化物的存留時間是同步的，那么飼喂變動蛋白質(zhì)水平飼糧就能實現(xiàn)沉積氮的增加［22，25］。已有研究顯示，動物采食碎干草和壓碎的大麥消化物在腸道存留的平均時間為47 h，說明間隔48 h變動1次飼糧氮水平的這種飼喂方式與消化物在腸道的存留時間是同步的。在閹羊上運用動靜脈血插管技術(shù)測定門靜脈回流內(nèi)臟組織(portal drained discera，PDV)中流通的含氮化合物的量，發(fā)現(xiàn)當飼喂變動蛋白質(zhì)水平飼糧時攝入氮的量和尿素在PDV的攝取量更大［26］。因此，在飼喂變動蛋白質(zhì)水平飼糧時，不能決定性地把沉積氮的增加歸于尿素氮在胃腸道的轉(zhuǎn)運比例的增加。Kiran等［1］通過US灌注取瘤胃上皮模擬尿素轉(zhuǎn)運來測定尿素在瘤胃的流通量，結(jié)果顯示與變動高蛋白質(zhì)飼糧和中蛋白質(zhì)飼糧相比，飼喂2 d變動低蛋白質(zhì)飼糧的羊屠宰后所得到的尿素在瘤胃上皮的流通量更大。由此可以看出，在2 d的低蛋白質(zhì)飼糧期有大量的尿素氮回流到瘤胃，是變動蛋白質(zhì)飼糧提高氮利用率的部分原因。Cole等［24］也提出在變動飼糧的低蛋白質(zhì)期有較高的尿素氮從血液轉(zhuǎn)運回到瘤胃，用于微生物蛋白質(zhì)的合成。

Lapierre等［27］研究表明，綿羊和牛在采食靜態(tài)氮水平飼糧時，肝臟中合成的尿素氮循環(huán)回胃腸道的比例為40%～80%，用于合成代謝的尿素氮為35%～55%。在本試驗中，由于灌注量占絨山羊體內(nèi)總氮量的比例很小，對氮平衡無顯著的影響，可忽略不計。飼喂變動蛋白質(zhì)水平的飼糧后，絨山羊UER、GER、ROC和 UUE的含量都減少，而UFE的含量并無顯著變化，而GER/UER增加了2.91% ～3.49%，UUE/UER 和 ROC/GER 減 少，UUA/GER 增加了 3.55%～4.45%。

另外，當飼喂變動蛋白質(zhì)水平飼糧時，除了尿素氮循環(huán)的增加之外，整個機體氮代謝也有改變。已有對綿羊的研究發(fā)現(xiàn)，綿羊被從飼喂正常飼糧轉(zhuǎn)化為低蛋白質(zhì)飼糧1～2 d內(nèi)，給其胃內(nèi)灌注營養(yǎng)物質(zhì)，尿氮排出量、總機體蛋白質(zhì)流通量以及蛋白質(zhì)的合成量與降解量顯著降低。原因是隨著攝入氮的量改變，機體蛋白質(zhì)周轉(zhuǎn)會有激烈的反應(yīng)。這說明飼喂變動蛋白質(zhì)水平飼糧能夠改變整個機體蛋白質(zhì)代謝。

3.4 飼喂變動蛋白質(zhì)水平飼糧對內(nèi)蒙古白絨山羊微生物蛋白質(zhì)合成量的影響

本試驗研究結(jié)果顯示，飼喂變動蛋白質(zhì)水平飼糧同飼喂中蛋白質(zhì)飼糧相比，絨山羊尿酸排出量增加，尿囊素、尿中嘌呤衍生物排出量和微生物蛋白質(zhì)合成量顯著增加。Doranalli等［28］研究發(fā)現(xiàn)，在飼喂周期性變動蛋白質(zhì)飼糧后，綿羊尿中嘌呤衍生物排出量增加，微生物蛋白質(zhì)合成量也增加。并據(jù)此得出結(jié)論認為，在變動飼糧周期中，飼喂2 d低氮飼糧后，可能是飼糧中氮缺乏引起尿素氮循環(huán)增加，從而增加了用于合成微生物蛋白質(zhì)的尿素氮，最終導(dǎo)致尿中嘌呤衍生物排出量和微生物蛋白質(zhì)合成量的量增加。

4 結(jié)論

①在本試驗飼糧條件下，飼喂變動蛋白質(zhì)水平的飼糧可降低絨山羊瘤胃液NH3-N濃度和糞氮、尿氮的排出量，而增加沉積氮/攝入氮，絨山羊機體氮利用率提高。

②在本試驗飼糧條件下，飼喂變動蛋白質(zhì)水平的飼糧可增加絨山羊GER/UER、UUA/GER，絨山羊微生物蛋白質(zhì)合成量增加。

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