基于16S rRNA基因克隆文庫技術(shù)分析廣西富鐘水牛瘤胃產(chǎn)甲烷菌組成及多樣性

楊承劍 梁 辛 韋升菊 李舒露 梁賢威鄒彩霞 楊炳壯 李麗莉

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院廣西水牛研究所，農(nóng)業(yè)部(廣西)水牛遺傳繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南寧 530001)

廣西富鐘水牛是我國地方水牛的特色品種之一，2006年被列入《國家級畜禽遺傳資源保護(hù)名錄》［1］。富鐘水牛體型較大，具有繁殖力高、成熟早、肉質(zhì)好、性情溫順、耐粗飼等優(yōu)良特性［2-3］，適合廣西壯族自治區(qū)東北丘陵地帶以低洼水田及黏性土壤旱地的耕作環(huán)境條件生長。然而，據(jù)2009年統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，富鐘水牛的存欄量僅12.1萬頭［2］。深入研究富鐘水牛的消化生理以及營養(yǎng)特性有助于其優(yōu)良種質(zhì)資源的保護(hù)。

反芻動物主要依賴瘤胃微生物將結(jié)構(gòu)性碳水化合物降解為揮發(fā)性脂肪酸為機(jī)體提供能量。不同種類反芻動物其瘤胃微生物結(jié)構(gòu)組成可能存在一定差異，有研究表明不同種類的山羊瘤胃微生物區(qū)系不同［4］。產(chǎn)甲烷菌，通常也稱為產(chǎn)甲烷古菌，廣泛存在于反芻動物胃腸道中［5］。在飼料消化利用過程中，產(chǎn)甲烷菌能夠利用各種不同底物，如氫、甲酸、乙酸、甲醇等，還原二氧化碳進(jìn)而生成甲烷［6］。反芻動物的甲烷生成意味著大量能量損失［7］。目前已有研究顯示，多種動物體內(nèi)均可分離出產(chǎn)甲烷菌［8-9］。部分研究也利用非培養(yǎng)的方式，如16S rRNA基因克隆文庫分析等方法研究了綿羊［10］、婆羅門雜交牛［11］、晉南牛［12］瘤胃內(nèi)產(chǎn)甲烷菌的組成及多樣性。更有研究表明，不同肥胖程度的人［13］或者不同品種的豬［14］腸道中的產(chǎn)甲烷菌結(jié)構(gòu)也存在差異。這些研究表明，胃腸道中產(chǎn)甲烷菌多樣性可能與物種特異性或與特定功能緊密相關(guān)。作為廣西壯族自治區(qū)特色遺傳資源品種之一，富鐘水牛瘤胃微生物可能具有其獨(dú)特的微生物區(qū)系，但目前尚未見關(guān)于富鐘水牛瘤胃微生物方面的研究。因此，本研究利用16S rRNA基因克隆文庫技術(shù)分析富鐘水牛瘤胃產(chǎn)甲烷菌組成及多樣性，為進(jìn)一步研究富鐘水牛瘤胃微生物生態(tài)系統(tǒng)功能以及品種資源保護(hù)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計

選取3頭體況基本一致的5歲左右的健康成年雌性富鐘泌乳水牛，飼養(yǎng)于廣西壯族自治區(qū)水牛研究所水牛場(國家級重點(diǎn)種畜場)。自由采食粗料，粗料為玉米青貯、木薯渣、啤酒渣、新鮮象草;補(bǔ)充適量［5.0 kg/(頭·d)］精料。泌乳水牛精料組成及營養(yǎng)水平見表1。每天08:00和16:00定時飼喂。自由飲水。

表1 泌乳水牛精料組成及營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))Table 1 Composition and nutrient levels of the concentrate for lactating buffalo(air-dry basis)%

試驗(yàn)期30 d，第30天晨飼前通過胃管式瘤胃液采樣器采集瘤胃內(nèi)容物250 mL，裝入干凈充滿二氧化碳厭氧瓶中，置于碎冰塊中冷藏迅速帶回實(shí)驗(yàn)室，保存于-80℃冰箱備用。

1.2 總 DNA 提取

從充分混勻后的250 mL瘤胃樣品中用寬口吸頭吸取1.5 mL包括瘤胃固、液2相的瘤胃內(nèi)容物用于總DNA的提取，12 000×g離心5 min，去除上清液，沉淀備用。采用文獻(xiàn)［15］所描述的機(jī)械破壁及總DNA提取試劑盒相結(jié)合的方法提取總DNA。

1.3 PCR擴(kuò)增及克隆文庫構(gòu)建

產(chǎn)甲烷菌特異性引物Met86F(5'-GCTCAGTAACACGTGG-3')/Met1340R(5'-CGGTGTGTGCAAGGAG-3')［10］擴(kuò)增 16S rRNA 基因序列。反應(yīng)體系50μL。反應(yīng)條件如下:94℃，3 min。94℃，30 s;58℃，30 s;72℃，90 s(40個循環(huán))。72℃，10 min。利用瓊脂糖凝膠純化回收試劑盒(美國Promega)純化PCR產(chǎn)物。將來自3頭動物的等體積PCR產(chǎn)物混合后，按照廠家說明書連接到載體 pMD19-T(日本TaKaRa)上進(jìn)行克隆，經(jīng)藍(lán)白斑篩選隨機(jī)挑取陽性克隆，用引物M13-47(5'-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3')和RV-M(5'-GAGCGGATAACAATTTCACACAGG-3')對陽性克隆進(jìn)行驗(yàn)證，確認(rèn)PCR片段連接到載體。然后將所有陽性克隆的送檢進(jìn)行測序(上海生工科技有限公司)。

1.4 16S r RNA基因序列分析

用DECIPHER軟件去除嵌合體序列［16］。使用Ribosomal Database Project(RDP)Release 11中的分類(classifier)程序?qū)λ行蛄羞M(jìn)行分類分析［17］。用 Mothur 軟 件 劃 分 分 類 操 作 單 元(OTU)，將相似性＞97%的序列視為同一個OTU［18］。選取每個 OTU代表序列，利用 Blast程序在GenBank中搜索相似性最高序列。用Clustal X Version 1.83軟件進(jìn)行多重比對，通過Molecular Evolutionary Genetics Analysis(MEGA)4.0 軟件計算出序列的系統(tǒng)進(jìn)化距離，采用Neighbor-Joining方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，1 000次隨機(jī)抽樣，計算自舉值(bootstrap)以評估系統(tǒng)發(fā)育樹的置信度。本研究所獲得的序列在DDBJ數(shù)據(jù)庫里的登錄號為:AB905820-AB905919。

2 結(jié) 果

2.1 16S r RNA基因克隆文庫分析

從建立的富鐘水牛瘤胃產(chǎn)甲烷菌16S rRNA基因克隆文庫中，隨機(jī)挑選100個陽性克隆進(jìn)行測序，其中5個可能為嵌合體序列。剩余的95個序列經(jīng)Mothur軟件分析，只有93個獨(dú)特序列可用于下一步分析。分類分析結(jié)果表明，93個序列均屬于古細(xì)菌域(Archaea)序列，可分為甲烷桿菌目(Methanobacteriales)、熱原體目(Thermoplasmatales)、除硫球菌目(Desulfurococcales)3個目，其中Methanobacteriales又可分為甲烷短桿菌屬(Methanobrevibacter)、甲烷桿菌屬(Methanobacterium)、甲烷球形菌屬(Methanosphaera)、未培養(yǎng)的甲烷桿菌(unclassified_Methanobacteriaceae)4個屬。以97%序列相似性為閾值，用Mothur軟件對剩余的93個序列進(jìn)行分析，93個序列可分為39個OTU(表2)。Mothur軟件計算表明克隆文庫庫容值為78.49%，滿足分析要求。

經(jīng)Blast與GenBank中序列比對，結(jié)果表明，93個序列中60個序列(15個OTU)與已培養(yǎng)細(xì)菌16S rRNA序列相似性≥97%，占總序列的64.5%。這些已培養(yǎng)細(xì)菌包括:Methanobrevibacter millerae(12 個 OTU，占總序列 55.9%)、Methanobrevibacter smithii(1 個 OTU，占總序列的 1.1%)、Methanobrevibacter ruminantium(1個 OTU，占總序列的5.4%)、Methanobrevibacter boviskoreani(1 個OTU，占總序列的 2.1%)。32 個序列(23個OTU)與已培養(yǎng)菌16S rRNA序列相似性處于90%～(＜97%)，包括 Methanobrevibacter millerae(5 個 OTU，占總序列的 8.6%)、Methanobrevibacter smithii(9 個 OTU，占總序列的 11.8%)、Methanobrevibacter ruminantium(2個OTU，占總序列的2.1%)、Methanobrevibacter gottschalkii(1 個 OTU，占總序列的 2.1%)、Methanobrevibacter olleyae(2個 OTU，占總序列的 3.2%)、Methanobrevibacter boviskoreani(1 個 OTU，占總序列的 1.1%)、Methanosphaera stadtmanae(2個 OTU，占總序列的4.3%)、Methanobacterium alcaliphilum(1 個 OTU，占總序列的 1.1%)。僅有 1個序列與 Methanomassiliicoccus luminyensis相似性＜90%(1個OTU，占總序列的 1.1%)。

表2 富鐘水牛瘤胃產(chǎn)甲烷菌16S r RNA基因序列分析Table 2 Sequence analysis of methanogens 16S rRNA gene from the rumen of Fuzhong buffaloes

續(xù)表2

2.2 16S r RNA基因系統(tǒng)進(jìn)化分析

以 Thermococcus aggregans(X99556.1)和 P.fumartus(X99555.1)作為外群(outgroup)，將 39個OTU代表序列與11個最相似已知序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖1)。進(jìn)化樹分析結(jié)果表明，與已知序列Methanomassiliicoccus luminyensis strain B10相似性為89%的代表序列D40在進(jìn)化樹中明顯區(qū)別于其他分支，屬于Thermoplasmatales，其余序列都屬于 Methanobacteriales。Methanobacteriales內(nèi)又分為2個大的分支，其中序列 29、D103、D86、D8、D91、D6、12、15-2、14、21、D35、5、A1、12-3、15、5-2、7共17個代表序列聚集在同一個分支上，在系統(tǒng)發(fā)育距離上與Methanobacteriales中任何已知相似序列都相隔較遠(yuǎn)，因此它們可能代表Methanobacteriales中新的屬或種。Methanobacteriales中的其余序列都處于一個分支上，以Methanobrevibacter序列為優(yōu)勢序列，Methanobrevibacter序列之間的遺傳距離較遠(yuǎn)，如代表序列11、D66、12-2、1、D39、D64、D101、D33、D38、9，這意味著它們可能是 Methanobrevibacter中新種;僅有代表序列D53在系統(tǒng)發(fā)育樹中與Methanosphaera stadtmanae在進(jìn)化樹中距離較近，屬于Methanosphaera。

圖1 富鐘水牛瘤胃產(chǎn)甲烷菌16S r RNA基因序列系統(tǒng)發(fā)育分析Fig.1 Phylogenetic analysis of 16S rRNA gene sequences of methanogens from the rumen of Fuzhong buffaloes

3 討 論

甲烷是反芻動物消化過程中所產(chǎn)生的副產(chǎn)物，它的釋放導(dǎo)致能量損失以及溫室氣體的增加。因而，深入了解水牛瘤胃產(chǎn)甲烷菌的菌群結(jié)構(gòu)及其多樣性有助于了解水牛瘤胃甲烷生成的微生物學(xué)機(jī)理，能夠?yàn)閷ふ液线m的水牛瘤胃甲烷調(diào)控措施提供理論依據(jù)。目前已有許多關(guān)于綿羊［19-20］、黃牛［11，21］以及水牛［22-24］瘤胃微生物菌群結(jié)構(gòu)組成的報道，其中水牛方面的研究以印度水牛為主。關(guān)于我國水牛瘤胃微生物菌群結(jié)構(gòu)組成，尤其是產(chǎn)甲烷菌多樣性方面的研究仍尚少。本研究利用16S rRNA基因克隆文庫技術(shù)分析富鐘水牛瘤胃中的產(chǎn)甲烷菌組成及多樣性，為進(jìn)一步研究富鐘水牛瘤胃微生物生態(tài)系統(tǒng)功能以及品種資源保護(hù)提供理論依據(jù)。

品種、飼糧以及地理位置之間的復(fù)雜互作對于水牛瘤胃微生物區(qū)系具有明顯作用。如印度的2項研究表明，摩拉水牛瘤胃內(nèi)的產(chǎn)甲烷菌94.4%～ 97.1% 都 屬 于 Methanomicrobium mobile［22，25］。而巴西有研究報道，不考慮飼糧的差異，地中海水牛瘤胃內(nèi) 91.5%的產(chǎn)甲烷菌屬于Methanobrevibacter［26］。本研究通過 16S rRNA 基因克隆文庫分析表明，富鐘水牛瘤胃內(nèi)產(chǎn)甲烷菌以Methanobacteriales中 Methanobrevibacter為主，這與國內(nèi)外許多在其他反芻動物上的研究結(jié)果相一致［19，27］。委內(nèi)瑞拉的綿羊以及澳大利亞袋鼠胃腸中98%以上的序列與Methanobrevibacter gottschalkii 相 似［19，28］。 在 牦 牛 中，與 Methanobrevibacter strain NT7高度相似的瘤胃內(nèi)的許多產(chǎn)甲烷菌目前仍難以人工分離［29］。本研究的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析結(jié)果也表明，富鐘水牛瘤胃內(nèi)存在許多未知的Methanobrevibacter。關(guān)于不同品種水牛瘤胃內(nèi)產(chǎn)甲烷菌區(qū)系存在顯著差異的機(jī)理還有待深入研究。Methanobrevibacter能夠利用二氧化碳和氫或者甲酸生成甲烷，但是不利用甲醇和甲胺生成甲烷［30］。研究表明，從黃牛瘤胃中分離到的Methanobrevibacter millerae能夠利用甲酸進(jìn)行生長繁殖［31］。Methanobrevibacter smithii PS 可利用二氧化碳和氫或者甲酸生成甲烷［32］。有研究表明，反芻動物體內(nèi)的Methanobrevibacter smithii可影響飼糧中的多糖成分的利用效率［11］。Facey 等［33］發(fā)現(xiàn)Methanosphaera stadtmanae(一種甲醇利用菌)是猩猩胃腸道中的優(yōu)勢產(chǎn)甲烷菌。本研究也發(fā)現(xiàn)，在富鐘水牛瘤胃內(nèi)存在序列與Methanosphaera stadtmanae高度相似的產(chǎn)甲烷菌，但是只占總序列數(shù)的4.3%。低濃度的Methanosphaera stadtmanae可能是由于Methanobrevibacter占優(yōu)勢或者由于飼料發(fā)酵過程中產(chǎn)生的少量甲醇的緣故，這需要進(jìn)一步研究。

St-Pierre 等［34］提議將與 Methanobrevibacter相似的產(chǎn)甲烷菌序列分為2大類:與Methanobrevibacter smithii(S)、Methanobrevibacter gottschalkii(G)、Methanobrevibacter millerae(M)和 Methanobrevibacter thaurei(T)聚集在一塊，統(tǒng)稱為SGMT簇;與 Methanobrevibacter ruminantium(R)及Methanobrevibacter olleyae(O)聚集在一起的稱為RO簇。已有研究表明，當(dāng)動物種類不同或飼糧條件不同時，SGMT和RO簇序列之間的分布規(guī)律存在差異［34］。研究表明，在飼喂同等飼糧條件下，荷斯坦奶牛瘤胃中的SGMT簇序列的比例要高于娟姍奶牛［21］。在本研究中，SGMT簇序列和RO簇序列所占總序列數(shù)比例分別為79.6%、10.8%，即在富鐘水牛瘤胃中SGMT簇序列占大多數(shù)。關(guān)于SGMT簇和RO簇序列在不同動物種類及飼養(yǎng)條件下的分布特點(diǎn)是否可以用于估測瘤胃甲烷生成，進(jìn)而應(yīng)用于調(diào)控瘤胃甲烷生成，還有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

富鐘水牛瘤胃產(chǎn)甲烷菌以Methanobacteriales為優(yōu)勢菌群，其中有許多未知的產(chǎn)甲烷菌需進(jìn)一步分離培養(yǎng)并對其功能進(jìn)行分析。

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