外源寡糖對山羊瘤胃液酶活及粗飼料瘤胃降解率的影響

林英庭 祁 茹，2 王利華 朱風(fēng)華 趙發(fā)盛，3 胡 靜

(1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，青島 266109;2.內(nèi)蒙古圣牧高科牧業(yè)有限公司，呼和浩特 010100;3.龍口市畜牧獸醫(yī)工作站，龍口 265701)

寡糖又稱低聚糖(oligosaccharides)，是指由2～10個單糖分子通過糖苷鍵連接形成的直鏈或支鏈小聚合物的總稱，是20世紀(jì)90年代中后期開發(fā)的新型無公害添加劑，由于具有無污染、無殘留、功能奇特、與其他添加劑配伍性良好等獨(dú)特優(yōu)點(diǎn)，越來越受到人們的關(guān)注。我國已批準(zhǔn)使用寡木糖(xylooligosaccharide，XOS)、低聚殼聚糖、半乳甘露寡糖(galacto-mannanoligosaccharides，GMOS)、果寡糖(fructooligosaccharide，F(xiàn)OS)、甘露寡糖(mannanoligosaccharide，MOS)5種產(chǎn)品作為飼料添加劑使用［1］。國內(nèi)外以往有關(guān)寡糖的研究，多限于豬禽等單胃動物。但近年來研究發(fā)現(xiàn)，寡糖 對 反 芻 動 物 生 產(chǎn) 性 能［2－7］、瘤 胃 發(fā) 酵 功能［8－10］、瘤胃［11－12］及糞便微生物區(qū)系［13－14］、營養(yǎng)物質(zhì)消化吸收及代謝［4－5，8］、免疫功能［5，8，12，15－16］、血液生化指標(biāo)［4－5，8，17］等方面能產(chǎn)生作用。本試驗(yàn)探討了不同外源寡糖對嶗山奶山羊去勢公羊瘤胃液主要酶活及常用粗飼料瘤胃降解率的影響，旨在探討不同外源寡糖的作用效果，篩選適宜寡糖添加種類，為寡糖在山羊飼料中的合理應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)用 MOS(純度為50%)、GMOS(純度為80%)、XOS(純度為70%)，低聚異麥芽寡糖(iso-maltooligosaccharide，IMO，純度為 90%)、FOS(純度為90%)均為市售產(chǎn)品。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及試驗(yàn)動物

選用體況良好、裝有永久性瘤胃瘺管的嶗山奶山羊成年去勢公羊［(62.80±2.45)kg］6 只。采用6×4不完全拉丁方試驗(yàn)設(shè)計(jì)。對照組(CT)飼喂基礎(chǔ)飼糧，試驗(yàn)組在基礎(chǔ)飼糧中分別添加1%寡糖(以有效含量計(jì))。試驗(yàn)進(jìn)行4期(4個重復(fù))，每期35 d，其中預(yù)試期25 d，正試期10 d。

表1 試驗(yàn)羊分組Table 1 Grouping of experimental goats

1.3 基礎(chǔ)飼糧

試驗(yàn)用基礎(chǔ)飼糧參照《山羊飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)》(NY/T 816—2004)［18］配制，其組成及營養(yǎng)水平見表 2。

表2 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))Table 2 Composition and nutrient levels of the basal diet(air-dry basis) %

1.4 飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)?zāi)躺窖騿螜陲曫B(yǎng)，每日07:00和17:00分2次等量飼喂，精飼料425 g/d，粗料1 000 g/d(全株玉米青貯∶花生蔓為1∶2)，先飼喂精飼料后飼喂粗飼料。自由飲水，各組間飼養(yǎng)管理完全一致。

1.5 測定項(xiàng)目與方法

1.5.1 瘤胃液主要酶活測定

瘤胃液的收集分別于正試期第1天的07:00和13:00、第 5天的 09:00和 15:00、第 9天的11:00和17:00進(jìn)行，由瘤胃瘺管采集不同位點(diǎn)的瘤胃液，立刻用4層紗布過濾后置于－20℃冰箱保存?zhèn)溆?。采用雙位點(diǎn)夾心酶聯(lián)免疫吸附法測定羧甲基纖維素酶(carboxymethyl cellulose)、濾紙纖維素酶(filter paper cellulase)、β－葡萄糖苷酶(β-glucosidase)、木聚糖酶(xylanase)、中性蛋白酶(neutral protease)和 α－淀粉酶(α-amylase)活性，試劑盒均購自上海申科技術(shù)有限公司，按說明書操作。

1.5.2 常用粗飼料瘤胃降解率測定

正試期第6天開始，用瘤胃尼龍袋法測定全株青貯玉米、花生蔓、苜蓿、羊草中干物質(zhì)(DM)、中性洗滌纖維(NDF)和酸性洗滌纖維(ADF)的瘤胃 72 h 降解率［19］。

將孔徑40μm、內(nèi)徑5 cm×10 cm的尼龍袋洗凈，置65℃烘干至恒重，放入干燥器中冷卻備用。飼料原料粉碎通過2 mm標(biāo)準(zhǔn)篩，65℃烘箱中烘干至恒重。分別稱取飼料樣品4 g(精確至0.000 1 g)裝入尼龍袋中，晨飼前通過半軟塑料管放入瘤胃腹囊處，處理72 h后取出，用中等流速的自來水沖洗，然后放入水中浸泡55 min，再在中等流速的自來水下沖洗，沖洗過程中不能用手?jǐn)D壓袋內(nèi)樣品。另設(shè)2個空白對照(清水中浸泡72 h)校正試驗(yàn)誤差。水洗后的尼龍袋置于65℃烘箱中烘至恒重。用常規(guī)分析方法［20］分析飼料和瘤胃處理72 h后的DM、NDF及ADF含量，按下式計(jì)算瘤胃降解率。

某目標(biāo)成分72 h瘤胃降解率(%)=100×(a－b)/a。

式中:a為校正后飼料樣本中目標(biāo)成分含量(g);b為瘤胃處理72 h后的殘余物中目標(biāo)成分的含量(g)。

1.6 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)分析應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)分析軟件ANOVA過程進(jìn)行單因素方差分析，用LSD法進(jìn)行多重比較。試驗(yàn)數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 外源寡糖對瘤胃液主要酶活的影響

由表3、表4、表5、表6、表7和表8可以看出，與對照組相比，山羊飼糧中添加MOS后，可使瘤胃液中羧甲基纖維素酶活性平均值提高10.42%(P＜0.05);添加 GMOS、IMO 和 FOS 后，瘤胃液中濾紙纖維素酶活性平均值分別提高 6.83%、6.675%和8.25%(P＜0.05);添加 IMO 和 XOS，β－葡萄糖苷酶活性平均值可分別提高 11.23%和12.80%(P＜0.05)，而添加 GMOS 和 FOS，β－葡萄糖苷酶活性平均值可分別提高21.23%和13.55%(P＜0.01);添加 MOS、GMOS、XOS 和 IMO，木聚糖酶活性平均值分別提高 7.23%、6.99%、6.75%和7.05%(P＜0.05)，F(xiàn)OS 可提高木聚糖酶活性平均值 12.51%(P＜0.01);添加 XOS，中性蛋白酶活性平均值可提高和 8.93%(P＜0.05)，添加 MOS、GMOS、IMO和FOS中性蛋白酶活性平均值分別提高 9.59%、19.03%、14.33% 和 17.81%(P ＜0.01);添加 FOS，α－淀粉酶活性平均值提高7.77%(P＜0.05)。

試驗(yàn)期內(nèi)，瘤胃液中各種酶的活性隨飼喂后時(shí)間的變化基本呈現(xiàn)規(guī)律性變化。羧甲基纖維素酶活性飼喂后基本呈現(xiàn)下降趨勢，2～4 h降到最低，之后上升，約8～10 h升高至高峰，然后又呈下降趨勢(表3);濾紙纖維素酶和木聚糖酶活性飼喂后迅速升高，2或4 h出現(xiàn)高峰，之后先下降后升高，飼喂后8 h再次出現(xiàn)高峰，然后下降(表4和表6);β－葡萄糖苷酶和中性蛋白酶活性隨時(shí)間變化規(guī)律不一致(表5和表7);α－淀粉酶活性在飼喂后4 h出現(xiàn)高峰，小幅下降后又迅速升高，到飼喂后8 h升高至新的高峰，然后又迅速下降，10 h左右又下降至飼喂時(shí)的水平(表8)。

表3 不同外源寡糖對瘤胃液羧甲基纖維素酶活性的影響Table 3 Effects of different exogenous oligosaccharides on carboxymethyl cellulose activity of rumen fluid ng/mL

表4 不同外源寡糖對瘤胃液濾紙纖維素酶活性的影響Table 4 Effects of different exogenous oligosaccharides on filter paper cellulase activity of rumen fluid ng/mL

表5 不同外源寡糖對瘤胃液β－葡萄糖苷酶活性的影響Table 5 Effects of different exogenous oligosaccharides onβ-glucosidase activity of rumen fluid pg/mL

表6 不同外源寡糖對瘤胃液木聚糖活性的影響Table 6 Effects of different exogenous oligosaccharides on xylanase activity of rumen fluid ng/mL

2.2 外源寡糖對常用粗飼料瘤胃降解率的影響

由表9可以看出，與 CT組相比，飼糧添加GMOS、XOS、IMO后，全株玉米青貯的 DM 瘤胃降解率分別提高 14.74%(P＜0.05)、24.31%(P＜0.01)、16.29%(P＜0.05);添加 GMOS 后，花生蔓的 DM 瘤胃降解率提高 15.25%(P＜0.01);添加MOS、GMOS、IMO、FOS 后，羊草的 DM 瘤胃降解率分別提高 23.75%(P＜0.01)、22.49%(P＜0.01)、21.05%(P＜0.01)和 20.50%(P ＜0.01);添 加MOS、IMO、FOS后，苜蓿干草的 DM 瘤胃降解率分別提高 9.24%(P＜0.05)、13.51%(P＜0.01)、14.61%(P＜0.01)。

表7 不同外源寡糖對瘤胃液中性蛋白酶活性的影響Table 7 Effects of different exogenous oligosaccharides on rumen neutral protease activity of rumen fluid ng/L

表8 不同外源寡糖對瘤胃液α－淀粉酶活性的影響Table 8 Effects of different exogenous oligosaccharides on rumenα-amylase activity of rumen fluid U/L

飼糧中添加 MOS、GMOS、XOS、IMO、FOS，全株玉米青貯NDF瘤胃降解率分別提高5.72%(P＜0.05)、13.00%(P ＜ 0.01)、12.80%(P ＜ 0.05)、13.57%(P＜0.01)、5.29%(P＜0.05);添加 GMOS后，花生蔓 NDF瘤胃降解率提高 13.09%(P＜0.05);添加 MOS、GMOS、XOS、FOS 后，羊草 NDF瘤胃降解率分別提高 45.64%(P＜0.01)、26.02%(P＜0.05)、9.30%(P＜0.05)、29.44%(P＜0.01);添加MOS、GMOS、FOS后，苜蓿青干草NDF瘤胃降解率分別提高 23.71%(P＜0.01)、17.14%(P＜0.01)、15.35%(P＜0.01)。

飼糧中添加 MOS、GMOS、XOS、IMO、FOS，全株玉米青貯 ADF瘤胃降解率依次提高25.10%(P＜0.01)、21.34%(P＜0.01)、19.54%(P＜0.01)、10.56%(P＞0.05)、25.30%(P＜0.01);添加 MOS、GMOS、XOS及 FOS，花生蔓 ADF瘤胃降解率分別提高 15.13%(P＜0.01)、24.98%(P＜0.01)、26.35%(P＜0.01)、10.55%(P＜0.05);添加 MOS和IMO，可使羊草ADF瘤胃降解率分別提高19.26%(P ＜0.05)和 24.54%(P ＜ 0.01);添 加MOS、GMOS、XOS、IMO 和 FOS，分別使苜蓿 ADF瘤胃降解率提高 44.46%(P＜0.01)、54.56%(P＜0.01)、50.50%(P ＜ 0.01)、62.20%(P ＜ 0.01)、52.57(P＜0.01)。

3 討論

3.1 外源寡糖對瘤胃液主要酶活的影響

纖維素在瘤胃內(nèi)的降解主要通過纖維素分解菌分泌的多酶復(fù)合體實(shí)現(xiàn)［21］，多酶復(fù)合體是由各種纖維素酶通過非共價(jià)鍵形成有組織的復(fù)合物［22］。羧甲基纖維素酶的活性反映該酶降解水溶性纖維素衍生物的能力［23］;濾紙纖維素酶反映內(nèi)切、外切葡聚糖酶和葡萄糖苷酶協(xié)同作用的結(jié)果，代表纖維素酶解全程總效應(yīng)［23－24］，其活性代表瘤胃內(nèi)總的纖維素酶活性;β－葡萄糖苷酶能夠切開纖維二糖的β－1，4糖苷鍵，生成游離葡萄糖;木聚糖酶是一組能夠水解木聚糖的酶類，因?yàn)槟揪厶鞘亲钪饕闹参锇肜w維素成分，因此該酶的活性大小也反映了瘤胃內(nèi)植物組織中半纖維素的消失程度［24］。纖維類物質(zhì)的降解必須在各種酶的協(xié)同作用下才能完成，任何酶活性的改變都會影響其降解。瘤胃內(nèi)微生物所產(chǎn)生的酶，除與微生物菌群及數(shù)量有關(guān)外，其活性還會受到發(fā)酵底物的影響，這些發(fā)酵底物主要是由反芻動物飼糧中不同來源的碳水化合物和蛋白質(zhì)所決定的［25］。本試驗(yàn)結(jié)果表明，添加外源寡糖可以提高山羊瘤胃液纖維素酶活性，但不同外源寡糖對其影響的程度不同，其中尤以MOS和FOS效果較好。分析其原因，可能主要與瘤胃微生物纖維素分解菌及真菌的數(shù)量有關(guān)。王新峰等［26］報(bào)道，飼糧中添加FOS能夠使黃化瘤胃球菌和產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌的數(shù)量提高。張學(xué)峰［12］研究表明，外源寡糖可以提高纖維素分解菌的數(shù)量，提前纖維素分解菌到達(dá)峰值的時(shí)間。祁茹等［11］發(fā)現(xiàn)，GMOS和FOS可以顯著提高奶山羊瘤胃液纖維素分解菌數(shù)量，MOS和FOS可以顯著提高奶山羊瘤胃液真菌數(shù)量。另外，反芻動物飼糧中添加外源寡糖可以顯著增加瘤胃液中揮發(fā)性脂肪酸含量［9，27－28］，揮發(fā)性脂肪酸為纖維素分解菌的增殖提供能量，增加其在瘤胃菌群的數(shù)量和比例。

表9 外源寡糖對山羊常用粗飼料瘤胃降解率的影響Table 9 Effects of exogenous oligosaccharides on ruminal degradation rates of common roughages in goats %

瘤胃纖毛蟲和許多細(xì)菌都具有蛋白質(zhì)水解活性，瘤胃液中分離出來的細(xì)菌當(dāng)中，30%～50%具有降解胞外蛋白質(zhì)的活性，其中主要有嗜淀粉擬桿菌、反芻獸新月形單胞菌以及溶纖維丁酸弧菌等［29］。外源寡糖進(jìn)入瘤胃后，可作為瘤胃纖毛蟲和細(xì)菌的營養(yǎng)基質(zhì)被利用而迅速增殖;此外，外源寡糖可改善瘤胃發(fā)酵功能，使瘤胃內(nèi)環(huán)境更適宜于瘤胃纖毛蟲和細(xì)菌生長，因此，不同外源寡糖均可顯著提高中性蛋白酶的活性。

淀粉酶活性的高低直接決定飼料中可溶性碳水化合物的消失程度［30］，瘤胃內(nèi)最主要的淀粉利用菌有嗜淀粉瘤胃桿菌、牛鏈球菌、棲瘤胃普雷沃氏菌、反芻獸新月形單胞菌、溶淀粉琥珀酸單胞菌、溶纖維丁酸弧菌以及反芻獸真桿菌等。除此之外，瘤胃內(nèi)幾乎所有大型內(nèi)毛蟲以及瘤胃厭氧真菌都具有降解淀粉的能力。不同種淀粉降解菌它們所產(chǎn)生的a－淀粉酶的作用方式基本相同，它們均可將淀粉水解成麥芽糖，降解所得的麥芽糖為非淀粉降解菌提供碳源［29］。本試驗(yàn)中，添加FOS可明顯提高瘤胃液α－淀粉酶活性，其原因可能是由于FOS促進(jìn)了非結(jié)構(gòu)性碳水化合物(NSC)分解細(xì)菌的快速生長，進(jìn)而表現(xiàn)出較強(qiáng)的α－淀粉酶活性。

3.2 外源寡糖對常用粗飼料瘤胃降解率的影響

飼料DM瘤胃降解率是評定飼料營養(yǎng)價(jià)值的一個總體指標(biāo)，它反映了飼料在瘤胃中的利用程度。趙曉靜［5］報(bào)道，綿羊飼糧中添加牛蒡果寡糖可以提高DM 的表觀消化率。劉兵等［30］報(bào)道，瘤胃灌注大豆寡糖(SBOS)降低了DM、OM、ADF、NDF在十二指腸、回腸、直腸的流通量，提高了它們在胃區(qū)、大腸中以及整個消化道的消化率。

NDF和ADF瘤胃降解率是反映結(jié)構(gòu)性碳水化合物消化利用程度的重要指標(biāo)，主要受結(jié)構(gòu)性碳水化合物組成的影響［31］。木質(zhì)素和半纖維素形成的酯鍵將纖維素包裹在其中，影響到反芻動物瘤胃微生物對纖維素和半纖維素的消化利用，而木質(zhì)素又幾乎完全不能被微生物利用［32］，故其消化率主要取決于其中木質(zhì)素的含量。瞿明仁等［9］用體外法研究發(fā)現(xiàn)，飼糧添加 0.6%、0.8%、1.0%FOS可以顯著降低培養(yǎng)殘?jiān)械腘DF含量，添加IMO的各組，培養(yǎng)殘?jiān)械腘DF含量也比對照組降低。劉光斌等［28］報(bào)道，飼糧添加 0.8%和 2.0%的大豆寡糖可以顯著降低培養(yǎng)殘?jiān)蠳DF含量，提高NDF瘤胃降解率，且可降低瘤胃液pH、乙酸/丙酸，有利于瘤胃發(fā)酵的調(diào)控。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，添加外源寡糖可以提高粗飼料DM、NDF和ADF的瘤胃降解率，其中MOS、GMOS和FOS效果顯著，與前人研究結(jié)果基本相同，且粗飼料木質(zhì)化程度越高，瘤胃降解率的改善作用越明顯。一方面是可能由于外源寡糖可以明顯改善瘤胃發(fā)酵功能，穩(wěn)定和改善瘤胃內(nèi)環(huán)境，為瘤胃微生物的生長提供良好的條件，另一方面是由于外源寡糖可明顯促進(jìn)瘤胃內(nèi)纖維素分解菌、蛋白質(zhì)分解菌及淀粉利用菌的增殖，增加相應(yīng)酶的分泌，從而提高瘤胃液中有關(guān)酶的活性。

4 結(jié)論

①飼糧添加MOS可顯著提高羧甲基纖維素酶活性，添加GMOS、IMO和FOS可顯著提高濾紙纖維素酶活性;GMOS、IMO、XOS、FOS可顯著提高 β－葡萄糖苷酶活性;添加 MOS、GMOS、XOS、FOS可顯著提高木聚糖酶活性。

② 飼糧添加GMOS、IMO和FOS可顯著提高中性蛋白酶活性。

③ 飼糧添加 FOS可顯著提高 α－淀粉酶活性。

④ 飼糧添加 MOS、GMOS、IMO、XOS、FOS 可提高山羊常用粗飼料中DM、ADF及NDF的瘤胃降解率。

綜上所述，在1%添加水平下，GMOS和FOS在山羊飼糧中添加效果較好。

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