miR-21:生成、表達(dá)調(diào)控及對其細(xì)胞凋亡的影響

彭 涵 齊仁立 黃金秀 陳 英 劉 炎 劉作華*

(1.西南大學(xué)榮昌校區(qū)，榮昌 402460;2.重慶市畜牧科學(xué)院，榮昌 402460)

microRNAs(miRNAs)是在真核生物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的一類長度約22個核苷酸的內(nèi)源性非編碼單鏈RNA，能與靶 mRNA 3’端非翻譯區(qū)(3’-UTR)的堿基序列結(jié)合。如果它們之間的堿基序列完全配對，則會引起靶mRNA的剪切;如果是不完全配對，則會抑制靶mRNA的翻譯，從而在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控靶基因的表達(dá)［1-5］。研究還發(fā)現(xiàn)，miRNAs除了與靶mRNA的3’-UTR結(jié)合外，還可結(jié)合氨基酸編碼區(qū)(amino acid coding regions，CDS)來調(diào)控mRNA的表達(dá)［6-7］。預(yù)測認(rèn)為，人體內(nèi)超過60%的基因受到miRNAs的調(diào)控，每個miRNA能夠調(diào)控多個靶mRNA，廣泛參與調(diào)節(jié)機(jī)體的生理學(xué)和病理學(xué)過程，如細(xì)胞凋亡、增殖、分化、代謝、病原體感染及復(fù)雜的信號傳導(dǎo)等［5，8-10］。也有研究表明，癌癥、心血管和代謝性等一些人類疾病的發(fā)生和形成與體內(nèi) miRNAs的異常表達(dá)密切關(guān)聯(lián)［1，11］。

miR-21是在哺乳動物上最早被發(fā)現(xiàn)和確認(rèn)的miRNAs分子中的一種，目前已在31個物種體內(nèi)的多種組織及細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)有miR-21存在，但還沒在植物上發(fā)現(xiàn)。大量試驗(yàn)表明，miR-21對多種腫瘤和心血管疾病的形成和發(fā)展都具有重要影響［12-14］。細(xì)胞凋亡是細(xì)胞為了適應(yīng)環(huán)境變化，由多基因調(diào)控的細(xì)胞自發(fā)性的程序性死亡，細(xì)胞凋亡的異常變化會導(dǎo)致一些疾病的發(fā)生，例如腫瘤的形成。動物試驗(yàn)結(jié)果表明細(xì)胞凋亡對于維持動物的正常生理狀態(tài)、健康的生長和高效的生產(chǎn)有重要的影響。本文將重點(diǎn)介紹miR-21的生成、表達(dá)調(diào)控及其對細(xì)胞凋亡的影響。

1 miR-21的生成

同其他miRNAs的生成一樣，miR-21由miR-21基因編碼，在細(xì)胞核內(nèi)通過RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生初始轉(zhuǎn)錄物pri-miR-21，再通過有序的2步修飾，形成成熟的miR-21。初始轉(zhuǎn)錄物pri-miR-21首先由RNA聚合酶Ⅲ家族的Drosha酶在Di-George綜合征關(guān)鍵區(qū)域基因8(DGCR8)輔酶配合下，剪切成約70個核苷酸的具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的前體miR-21(pre-miR-21);該前體通過轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Exportin-5的轉(zhuǎn)運(yùn)作用，從細(xì)胞核轉(zhuǎn)至細(xì)胞質(zhì);然后經(jīng)RNA聚合酶Ⅲ家族的Dicer酶修飾后得到雙鏈的miRNA:miRNA*。根據(jù)熱力學(xué)穩(wěn)定性，miRNA*穩(wěn)定性高，不易解螺旋，通常被降解，而miRNA由于穩(wěn)定性低，更容易解螺旋后與RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物(RISC)結(jié)合形成功能性的miRISC復(fù)合物，進(jìn)而與靶 mRNA 的 3’-UTR 結(jié)合，以調(diào)控 mRNA 的表達(dá)［13，15］(圖1)。

圖1 miR-21的生成Fig.1 Biogenesis of miR-21［1］

2 miR-21的表達(dá)調(diào)控

miR-21的基因定位具有種屬特異性。小鼠的miR-21基因定位在11號染色體上，豬的定位在12號染色體上，而人的定位在17號染色體q23.2區(qū)域，與跨膜蛋白49(TMEM49)編碼基因重疊，存在于TMEM49基因的第10個內(nèi)含子內(nèi)。盡管miR-21與 TMEM49基因有重疊部分，但與其他miRNAs不同，它擁有獨(dú)立的啟動子區(qū)域［16］。研究發(fā)現(xiàn)，miR-21可能擁有3個啟動子區(qū)域。Cai等［17］發(fā)現(xiàn)了位于miR-21上游-3 403位到-2 395位的啟動子，通過序列分析，轉(zhuǎn)錄控制元件是CCAAT盒，而不是典型的距轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)約25個堿基的 ATAT盒。L?ffler等［18］發(fā)現(xiàn)了另一個與Cai等［17］非常相似的啟動子，從上游-3 565位延伸到-2 415位，由白細(xì)胞介素-6/信號傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄活化因子 3(IL-6/STAT3)所誘導(dǎo)。Fujita等［19］運(yùn)用信息學(xué)算法確定了位于上游-3 770位到-3 337位區(qū)間、含有獨(dú)立且高度保守序列的啟動子。該啟動子含有多個保守的增強(qiáng)子元件結(jié)合位點(diǎn)，能與激活蛋白 1(activation protein 1，AP-1)、Ets/PU.1、CCAAT增強(qiáng)子結(jié)合蛋白 α(CCAAT/enhancer binding protein，C/EBPα)、核因子Ⅰ(nuclear factorⅠ，NFⅠ)、血清應(yīng)答因子(serum response factor，SRF)、p53及STAT3等轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合。

不同的轉(zhuǎn)錄因子對miR-21表達(dá)的調(diào)控信號通路存在差異。Fujita等［19］發(fā)現(xiàn)，在 293FT細(xì)胞中激活的AP-1在PU.1的協(xié)助下可激活miR-21的轉(zhuǎn)錄，而核轉(zhuǎn)錄因子I/B(NFIB)和C/EBPα相互作用則能抑制miR-21的表達(dá)，且miR-21與NFIB之間存在負(fù)反饋調(diào)節(jié)機(jī)制。L?ffler等［18］和Krichevsky等［20］在研究多發(fā)性骨髓瘤時發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)錄因子STAT3促進(jìn)miR-21上游增強(qiáng)子激活，IL-6可誘導(dǎo)miR-21的轉(zhuǎn)錄;當(dāng)敲除STAT3的骨髓瘤細(xì)胞在IL-6誘導(dǎo)下培養(yǎng)48 h時，pri-miR-21的表達(dá)水平降低，表明STAT3介導(dǎo)了IL-6-miR-21的自分泌反饋調(diào)節(jié)。Wickramasinghe等［21］在乳腺癌 MCF-7細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，雌激素受體(estrogen receptor，ER)可抑制miR-21的表達(dá)，同時miR-21的靶基因程序性細(xì)胞死亡4(programmed cell death 4，PDCD4)、磷酸酯酶與張力蛋白同源物(phosphatase and tensin homolog，PTEN)和 B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2(B-cell lymphoma 2，Bcl2)表達(dá)上調(diào)，其機(jī)制可能是雌激素同源受體ERα和ERβ通過與miR-21啟動子中具有雌激素效應(yīng)元件的配體結(jié)合來實(shí)現(xiàn)。另外在雄激素受體(androgen receptor，AR)活躍的前列腺癌細(xì)胞系C4-2和CWR22Rv1中，AR可直接與 miR-21啟動子相互作用，上調(diào) miR-21的表達(dá)［22］。

除上述提到的轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控外，miR-21的表達(dá)還受到轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控。Ribas等［23］發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)和骨形態(tài)發(fā)生蛋白4(bone morphogenetic protein 4，BMP4)通過促進(jìn)Drosha酶對pri-miR-21轉(zhuǎn)錄物的加工來上調(diào)miR-21的表達(dá)。另有研究發(fā)現(xiàn)miR-21在轉(zhuǎn)錄后水平的表達(dá)調(diào)控存在組織差異性。Chiosea等［24］和 Ambs等［25］發(fā)現(xiàn)在前列腺癌組織中Dicer、Drosha以及DGCR8酶的表達(dá)水平上調(diào)，并通過對pri-miR-21高效修飾，促進(jìn)miR-21的表達(dá)，而在其他組織未發(fā)現(xiàn)這種情況。目前運(yùn)用生物信息學(xué)軟件分析發(fā)現(xiàn)，還有Yin Yang-1(YY1)、轉(zhuǎn)錄因子NF-E2相關(guān)因子2(NFE2L2)、重組人活化轉(zhuǎn)錄因子-2(ATF2)、特化蛋白1(Sp1)、缺氧誘導(dǎo)因子1(HIF1)等轉(zhuǎn)錄因子可能也參與miR-21表達(dá)的轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄后調(diào)控過程［14］，但尚需進(jìn)一步試驗(yàn)加以證實(shí)。

3 miR-21對于細(xì)胞凋亡的影響

細(xì)胞凋亡是指細(xì)胞為維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)，由多基因調(diào)控的細(xì)胞自主有序的死亡。涉及的基因包括半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(cysteinyl aspartate specific proteinase，Caspase)家族、Bcl2、PDCD4及PTEN等。自miRNA被發(fā)現(xiàn)后，已確認(rèn)不少于30種miRNA小分子與細(xì)胞凋亡關(guān)系緊密。有些miRNA能促進(jìn)細(xì)胞凋亡，如Let-7家族、miR-29和miR-34等;而有些miRNA則抑制細(xì)胞凋亡，如 miR-21、miR-20a 等［26］。

腫瘤的發(fā)生往往伴隨著明顯的細(xì)胞凋亡，在現(xiàn)有對腫瘤的研究中，miR-21被認(rèn)為是一個原癌基因，并且表現(xiàn)出強(qiáng)烈的抑制細(xì)胞凋亡的作用。在人的膠質(zhì)瘤組織和細(xì)胞系中發(fā)現(xiàn)miR-21顯著高表達(dá)，利用化學(xué)修飾試劑2’甲氧基(2’OMe)-miR-21和鎖核酸(LNA)-miR-21能抑制 miR-21基因表達(dá)，將它們轉(zhuǎn)染進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系48 h后，細(xì)胞數(shù)量急劇下降，Caspase 3和7的活性提高3倍，而Caspase 3和7是已知細(xì)胞凋亡的執(zhí)行者，能顯著推進(jìn)細(xì)胞凋亡進(jìn)程，促進(jìn)細(xì)胞的凋亡。研究表明，miR-21在膠質(zhì)瘤中抑制細(xì)胞凋亡是通過抑制Caspase 3和7的表達(dá)來發(fā)揮作用［27］。類似結(jié)果在Corsten等［28］研究膠質(zhì)瘤細(xì)胞對細(xì)胞毒性腫瘤治療時得到驗(yàn)證。除依賴Caspase調(diào)控細(xì)胞凋亡外，Chen等［29］研究發(fā)現(xiàn) miR-21還能通過靶向調(diào)控抑癌基因PDCD4來影響神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的凋亡，他首先通過熒光素酶活性分析試驗(yàn)確定了PDCD4在miR-21的調(diào)控位點(diǎn)，再使用2’OMe-miR-21處理T98G細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)miR-21的下調(diào)伴隨著PDCD4蛋白質(zhì)水平的上調(diào)，提示高表達(dá)miR-21在翻譯水平上抑制了PDCD4的表達(dá)，從而抑制細(xì)胞的凋亡。建立過表達(dá)的PDCD4能顯著促進(jìn)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的凋亡，而在T98G細(xì)胞中過表達(dá)miR-21能補(bǔ)救由PDCD4過表達(dá)引起的細(xì)胞凋亡。研究表明，miR-21不僅通過直接抑制PDCD4的翻譯，而且還通過其他靶基因和通路來抑制細(xì)胞凋亡［29］。Papagiannakopoulos等［30］研究發(fā)現(xiàn) miR-21還可靶向負(fù)調(diào)控p53、TGF-β及線粒體凋亡通路基因電壓依賴性陰離子通道1(VDAC1)，這些基因?qū)?xì)胞凋亡的發(fā)生和發(fā)展都具有重要影響。另外，miR-21還可直接調(diào)控凋亡基因Bcl2來抑制細(xì)胞凋亡。Si等［31］對157例乳腺癌病人體內(nèi) miRNAs表達(dá)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)miR-21異常高表達(dá)，為了解miR-21在乳腺癌形成過程中的作用，他們通過體外轉(zhuǎn)染anti-miR-21到乳腺癌MCF-7細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)miR-21能抑制乳腺癌細(xì)胞的生長，已經(jīng)移植到小鼠身上的腫瘤，其生長也受到了抑制，并且對腫瘤生長的抑制明顯與細(xì)胞凋亡的增加有關(guān)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，miR-21下調(diào)了 Bcl2的表達(dá)，而Bcl2是一個細(xì)胞凋亡的抑制因子，通過抑制細(xì)胞色素C從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)來調(diào)控細(xì)胞凋亡。此外，miR-21在肝癌、膽管癌、腎癌等實(shí)體癌上都具有抑制細(xì)胞凋亡的作用。

除影響癌細(xì)胞的凋亡外，miR-21對心肌細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞等非癌細(xì)胞的凋亡也有抑制作用。抑制細(xì)胞凋亡可以防止或減輕心肌缺血再灌注損傷，Yin等［32］研究發(fā)現(xiàn)熱休克的小鼠會誘導(dǎo)心肌中miR-21的表達(dá)，且將從熱休克小鼠體內(nèi)分離的miRNAs用于處理正常小鼠，缺血再灌注導(dǎo)致的心肌梗死面積減少;采用化學(xué)合成的miR-21注射給小鼠出現(xiàn)類似的結(jié)果，而用2’OMe-miR-21配合處理后，對缺血再灌注導(dǎo)致的心肌梗死的保護(hù)作用消失。同時發(fā)現(xiàn)miR-21會引起促凋亡因子 Caspase 1、Caspase 2、Caspase 8、Bid、Bcl-10、大鼠凋亡相關(guān)因子配體(FASL)、Trp53的蛋白質(zhì)水平下降，而抑凋亡因子Bag3、Prdx2的蛋白質(zhì)水平增加，表明miR-21的抑凋亡作用是通過調(diào)控凋亡因子的表達(dá)發(fā)揮作用的。Cheng等［33］也發(fā)現(xiàn)miR-21有抑制心肌細(xì)胞凋亡的作用，利用LNA-miR-21抑制miR-21表達(dá)促進(jìn)了過氧化氫(H2O2)誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡，而用Pre-miR-21建立的miR-21過表達(dá)則減少了心肌細(xì)胞凋亡，而且miR-21可能通過PDCD4及其下游信號分子AP-1的作用來保護(hù)H2O2誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷。

PTEN作為迄今發(fā)現(xiàn)的第1個具有雙特異磷酸酶活性的抑癌基因，同樣受到miR-21的調(diào)控，且對細(xì)胞的凋亡具有重要的影響。Ji等［34］研究發(fā)現(xiàn)，在增生的血管平滑肌細(xì)胞中miR-21的表達(dá)水平明顯升高，但用不同劑量2’OMe-miR-21處理體外培養(yǎng)的鼠主動脈血管平滑肌細(xì)胞48 h后，細(xì)胞增殖減緩，而凋亡細(xì)胞的數(shù)量以劑量依賴的方式增加，揭示miR-21對血管平滑肌細(xì)胞有促進(jìn)增殖和抑制凋亡的作用。進(jìn)一步研究其作用機(jī)制發(fā)現(xiàn)，抑制miR-21基因表達(dá)會上調(diào)原癌基因PTEN的表達(dá)，而過表達(dá)的miR-21則會下調(diào)PTEN的表達(dá)。凋亡抑制因子Bcl2則出現(xiàn)與PTEN完全相反的變化。研究表明miR-21在抑制血管平滑肌細(xì)胞凋亡是通過PTEN和Bcl2發(fā)揮作用的。

細(xì)胞凋亡除了與人類健康和疾病形成具有密切的聯(lián)系外，對于動物的健康生長、發(fā)育、代謝和生產(chǎn)也有重要影響。動物機(jī)體能夠通過細(xì)胞凋亡的方式去除損傷細(xì)胞、維持代謝穩(wěn)定和保持機(jī)體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)。關(guān)于細(xì)胞凋亡的研究能夠促進(jìn)動物生長和生產(chǎn)，改善動物福利，保障動物的健康，具有重要的科學(xué)意義和經(jīng)濟(jì)價值。當(dāng)前已經(jīng)有許多研究關(guān)注動物體內(nèi)的細(xì)胞凋亡及其引起的表型和生理變化。例如絨山羊的產(chǎn)毛性能與皮膚毛囊細(xì)胞密切相關(guān)，其細(xì)胞凋亡的變化揭示了生絨機(jī)制［35］。兔乳腺上皮細(xì)胞的凋亡與泌乳量呈負(fù)相關(guān)的關(guān)系，可為維持泌乳的高產(chǎn)提供調(diào)控依據(jù)［36］。有研究表明，miRNAs可以抑制奶牛乳腺上皮細(xì)胞的生長，促進(jìn)細(xì)胞的凋亡，調(diào)控奶牛的泌乳產(chǎn)量［37］。骨骼肌的生長發(fā)育對動物的產(chǎn)肉性狀影響較大，豬骨骼肌細(xì)胞的凋亡能夠有效調(diào)控豬體內(nèi)的肌肉含量與分布［38］。此外動物的繁殖性能與卵泡中的顆粒細(xì)胞密切聯(lián)系，顆粒細(xì)胞凋亡的變化可指導(dǎo)多胎動物的繁殖性能［39］。綜上所述，細(xì)胞凋亡與動物體內(nèi)各個組織器官的各種機(jī)能都存在直接或者間接的聯(lián)系。作為細(xì)胞凋亡的一個重要調(diào)控因子，miR-21在不同動物體內(nèi)的多種細(xì)胞中均有表達(dá)，它可能通過調(diào)控不同細(xì)胞的凋亡影響到動物的胚胎發(fā)育，器官形成，代謝進(jìn)程和諸如產(chǎn)毛、泌乳、產(chǎn)肉等各種生產(chǎn)性能。但是當(dāng)前相關(guān)研究還較為缺乏，有待進(jìn)一步的通過試驗(yàn)加以確認(rèn)。

4 小 結(jié)

雖然已有大量試驗(yàn)闡述了miR-21的表達(dá)和作用，尤其是它在腫瘤形成和心血管疾病發(fā)生中的重要地位，但迄今為止仍有許多疑問亟待解決。例如，miR-21在不同類型的腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)模式和靶分子是否相同?miR-21對凋亡的影響是直接靶向凋亡基因還是經(jīng)由信號轉(zhuǎn)錄因子發(fā)揮間接作用?miR-21除在大多數(shù)細(xì)胞中表現(xiàn)出抑制凋亡作用外，在特殊情況下某些細(xì)胞中似乎也有一定的促凋亡作用，這只是個例還是一種新的作用機(jī)制?miR-21在不同動物體內(nèi)的表達(dá)模式及其對不同細(xì)胞凋亡的調(diào)控機(jī)制并引起怎樣的表型和生理變化?雖然當(dāng)前還有許多疑問，但是通過大量的基礎(chǔ)研究，我們有可能在不久的將來通過靶向調(diào)控類似于miR-21這樣的重要轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子來實(shí)現(xiàn)對于人和動物疾病診療和代謝控制的目標(biāo)。

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