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    UPLC-MS/MS法測(cè)定奶粉中煙酸的含量

    2014-12-21 07:38:50俞蘊(yùn)莉顧炳仁
    中國(guó)乳業(yè) 2014年11期
    關(guān)鍵詞:煙酸奶粉質(zhì)譜

    文∕郝 剛 俞蘊(yùn)莉 顧炳仁

    (1江蘇省蘇州市食品藥品檢驗(yàn)所;2江蘇省蘇州大學(xué)附屬第二醫(yī)院)

    煙酸(Nicotinic Acid),又名尼克酸、維生素B3(或維生素PP),是人體必需的13 種維生素之一,具有促進(jìn)細(xì)胞新陳代謝和擴(kuò)張血管等功能,被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品等領(lǐng)域。目前,市售的眾多品牌奶粉中均將煙酸作為重要的營(yíng)養(yǎng)成分進(jìn)行添加。本試驗(yàn)基于超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)技術(shù),采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)方式(MRM),建立了快速測(cè)定奶粉中煙酸含量的檢測(cè)方法。

    1 材料與方法

    1.1 儀器

    ACQUITY UPLC Xevo TQ-S三重四級(jí)桿液質(zhì)聯(lián)用儀,美國(guó)Waters公司;電噴霧離子源(ESI+);Masslynx 4.1數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)(Waters);Thermo低溫離心機(jī);KQ-300DA型數(shù)控型超聲波清洗器;MILLIPORE純水儀;強(qiáng)陽(yáng)離子交換(SCX)固相萃取柱(北京明尼克分析儀器設(shè)備中心)。

    1.2 樣品與試劑

    煙酸對(duì)照品(批號(hào)201102,含量99.9%),購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院;乙酸銨,購(gòu)于Sigmaaldrich公司;甲醇,色譜純,購(gòu)于Merk公司;氫氧化鈉、鹽酸、氯化鈉等均為分析純,購(gòu)于國(guó)藥試劑有限公司。試驗(yàn)用水為超純水。試驗(yàn)所用樣品均為市售奶粉。

    1.3 UPLC 色譜條件

    色譜柱:BEH-C18色譜柱(2.1 mm×50 mm,1.7 μm);流動(dòng)相:A(含20 mmol/L乙酸銨的水溶液)∶B(甲醇)=20∶80(v/v);柱溫:30 ℃;進(jìn)樣盤溫度:4 ℃;流速0.3 mL/min;進(jìn)樣量:1 μL。

    1.4 質(zhì)譜條件

    電噴霧離子源;正離子掃描;毛細(xì)管電壓4.0 kV;脫溶劑氣溫度:350 ℃;脫溶劑氣體流量:800 L/h;錐孔氣流量:150 L/h;碰撞氣體為氬氣,碰撞能18 eV;多反應(yīng)檢測(cè)模式(MRM)下,測(cè)定煙酸的檢測(cè)離子對(duì)分別為:m/z 124→106和m/z 124→80。

    1.5 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

    精密稱取煙酸對(duì)照品約10 mg,置10 mL量瓶中,加甲醇溶解并稀釋至刻度,搖勻,精密量取1 mL置100 mL量瓶中,加甲醇稀釋至刻度,混勻,作為煙酸對(duì)照品儲(chǔ)備液(10 μg/mL),4 ℃避光保存。臨用前用甲醇稀釋成不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液。

    1.6 樣品前處理

    稱取1 g奶粉置于燒杯中,加入適量的45~50 ℃的溫水將其溶解,冷卻至室溫后,加水補(bǔ)足100 mL,充分溶解、混勻后,取10 mL樣品溶液于50 mL聚丙烯離心管中;加入10 mol/L的氫氧化鈉0.1 mL、5 g氯化鈉和40 mL水,渦旋振蕩3 min,8 000 r/m離心5 min。取上清液10 mL置于另一個(gè)50 mL聚丙烯離心管中,加入0.2 mol/L的鹽酸40 mL,渦旋振蕩3 min,8 000 r/m離心5 min,取上清液10 mL上樣至SCX小柱中。然后依次用3 mL水,1 mL 0.2 mol/L的鹽酸和3 mL甲醇淋洗,用4 mL氨水-甲醇(體積比1∶3)洗脫,洗脫液經(jīng)氮?dú)獯蹈珊笥昧鲃?dòng)相定容至10 mL,0.22 μm濾膜過(guò)濾,取1 μL濾液進(jìn)樣分析。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 質(zhì)譜條件的確定

    將煙酸對(duì)照品儲(chǔ)備液用甲醇稀釋成200 ng/mL的對(duì)照溶液,選用ESI+離子化模式,通過(guò)直接進(jìn)樣法進(jìn)行質(zhì)譜條件優(yōu)化。首先,采用一級(jí)質(zhì)譜掃描方式得到煙酸準(zhǔn)分子離子峰m/z:124[M+H]+,結(jié)果如圖1-(A)所示。在確定準(zhǔn)分子離子的基礎(chǔ)上,進(jìn)行錐孔電壓優(yōu)化,得到最佳錐孔電壓為30 V,錐孔氣流量為150 L/h。再通過(guò)Daughter Scan掃描模式,對(duì)煙酸的分子離子進(jìn)行二級(jí)碎片離子掃描,結(jié)果如圖1-(B)所示。煙酸二級(jí)掃描的特征離子對(duì)為:m/z 124→106和m/z 124→80,這2 個(gè)特征離子對(duì)作為煙酸定性判斷的依據(jù)。最后,基于煙酸的2 個(gè)特征離子對(duì)建立MRM方法,煙酸的MRM離子流色譜圖如1-(C)所示,并選擇其中響應(yīng)較強(qiáng)的離子對(duì)(m/z 124→80)作為定量離子對(duì)。

    圖1 質(zhì)譜條件優(yōu)化結(jié)果

    2.2 專屬性

    分別取空白奶粉(經(jīng)測(cè)定不含煙酸的奶粉樣品),空白奶粉添加至200 ng/mL水平的煙酸對(duì)照品,按“1.6 樣品前處理”方法經(jīng)提取、固相萃取后進(jìn)樣分析。同時(shí)用甲醇配制200 ng/mL的煙酸對(duì)照品溶液進(jìn)樣分析,考察所建立方法的專屬性,結(jié)果如圖2所示。煙酸對(duì)照品溶液的MRM離子流色譜圖保留時(shí)間為0.45 min,空白樣本在該保留時(shí)間處無(wú)干擾,空白樣品添加煙酸對(duì)照品溶液后,MRM離子流色譜圖保留時(shí)間不變,且峰形良好,所建液相及質(zhì)譜方法適合奶粉中煙酸的定性、定量檢測(cè)。

    圖2 專屬性試驗(yàn)結(jié)果

    2.3 線性范圍

    取煙酸對(duì)照品儲(chǔ)備液,分別配制成終濃度為1,2,5,20,50,100,200,500 ng/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液,按上述液相及質(zhì)譜方法,各取1 μL進(jìn)樣分析,采集MRM離子流色譜圖,以m/z 124→80為定量離子對(duì),以對(duì)照品濃度為橫坐標(biāo)(X),峰面積為縱坐標(biāo)(Y),進(jìn)行線性回歸,結(jié)果如圖3所示。從圖3可以看出,煙酸在1~500 ng/mL濃度范圍內(nèi)線性良好,線性方程為Y=9855X+93501,相關(guān)系數(shù):R=0.9995。

    圖3 煙酸線性范圍考察結(jié)果

    2.4 檢出限與定量限

    2.4.1 儀器檢出限與定量限

    空白奶粉溶液中分別添加至0.1 ng/mL和0.3 ng/mL濃度水平的煙酸對(duì)照品,經(jīng)提取、固相萃取后,進(jìn)樣分析,結(jié)果如圖4-(A)所示,0.1 ng/mL濃度的煙酸信噪比(S/N)為6.8,該濃度作為煙酸的儀器檢出限(S/N>3);0.3 ng/mL濃度的煙酸信噪比(S/N)為13.97(如圖4-(B)所示),該濃度作為煙酸的儀器定量限(S/N>10)。

    圖4 煙酸檢出限(A)、定量限(B)試驗(yàn)結(jié)果

    2.4.2 方法檢出限與定量限

    根據(jù)“1.6 樣品前處理”的方法,樣品實(shí)際稀釋倍數(shù)為2 500 倍,計(jì)算該方法下的方法檢出限為0.25 μg/g,方法定量限為0.75 μg/g。

    2.5 回收率和精密度

    取空白奶粉溶液,分別添加2 ng/mL,20 ng/mL,200 ng/mL共3 個(gè)濃度水平的煙酸對(duì)照品溶液,按本試驗(yàn)方法進(jìn)行處理,每份樣品重復(fù)測(cè)定6 次,試驗(yàn)結(jié)果如表1所示??疾鞜熕岬?、中、高3 個(gè)濃度下的方法回收率,在78.2%~90.4%范圍內(nèi),方法精密度(以相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD表示)小于7%。

    表1 空白樣品中煙酸的加標(biāo)回收率和精密度(n=6)

    2.6 實(shí)際樣品測(cè)定

    選取市售6 種不同批次標(biāo)示含有煙酸成分的奶粉,按所建方法進(jìn)行樣品處理并檢測(cè)煙酸含量,結(jié)果如表2所示。從表2可以看出,6 種批次奶粉中煙酸含量的實(shí)測(cè)值均在“80%標(biāo)示值~120%標(biāo)示值”范圍內(nèi),符合我國(guó)《食品營(yíng)養(yǎng)成分標(biāo)示準(zhǔn)則》的相關(guān)規(guī)定。

    表2 奶粉樣品分析結(jié)果

    3 討論

    目前,國(guó)內(nèi)外檢測(cè)煙酸含量的方法主要包括滴定法、微生物法、高效液相色譜法、電化學(xué)法、氣相-質(zhì)譜聯(lián)用法等。我國(guó)《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)》中規(guī)定了嬰幼兒食品和乳品中煙酸的測(cè)定方法為高效液相色譜法和微生物法(GB 5413.15-2010)。本試驗(yàn)基于超高效液相色譜的快速分離能力及三重四級(jí)桿質(zhì)譜的定性、定量?jī)?yōu)勢(shì),開發(fā)快速測(cè)定奶粉中煙酸含量的檢測(cè)方法。試驗(yàn)結(jié)果表明,不含煙酸的空白奶粉樣品經(jīng)提取、固相萃取后,在MRM監(jiān)測(cè)模式下對(duì)煙酸的基線分離無(wú)影響,方法專屬性強(qiáng),且煙酸保留時(shí)間僅為0.45 min,大大縮短了分析時(shí)間。進(jìn)一步分析目前市售各種品牌的奶粉營(yíng)養(yǎng)成分表發(fā)現(xiàn),多數(shù)品牌奶粉中煙酸的含量在1~10 mg/100 g范圍內(nèi),本試驗(yàn)中所建立的煙酸對(duì)照品溶液的線性范圍為1~500 ng/mL。結(jié)合所建方法的提取、固相萃取過(guò)程,根據(jù)樣品稀釋倍數(shù)和回收率的計(jì)算結(jié)果,該方法運(yùn)用在實(shí)際樣品的檢測(cè)中,線性范圍可達(dá)0.25~125 mg/100 g,基本滿足目前市售的不同品牌奶粉中煙酸的測(cè)定要求,且方法回收率在78.2%~90.4%范圍內(nèi),精密度小于7%。進(jìn)一步運(yùn)用所建方法對(duì)市售6 批奶粉中的煙酸含量進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果均符合規(guī)定。綜上所述,本試驗(yàn)所建立的奶粉中煙酸含量檢測(cè)方法具有專屬性強(qiáng)、靈敏度高、線性范圍廣、分析時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn),為奶粉中煙酸的檢測(cè)提供了新的選擇。

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    [18]GB 5413.15-2010 嬰幼兒食品和乳品中煙酸和煙酰胺的測(cè)定.

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