高棉籽粕飼料中補充賴氨酸和鐵對青魚幼魚生長、免疫力及組織中游離棉酚含量的影響

胡 毅 張俊智 黃 云 肖調(diào)義 鐘 蕾* 米海峰 彭慧珍

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學動物科學技術(shù)學院，長沙 410128;2.通威股份有限公司，成都 610041)

豆粕因蛋白質(zhì)含量高、氨基酸組成相對平衡，被廣泛用作水產(chǎn)飼料中的優(yōu)質(zhì)植物蛋白質(zhì)源，然而，近幾年豆粕價格持續(xù)高漲，使飼料的成本大幅提高。與豆粕相比，棉籽粕具有明顯的價格優(yōu)勢，其價格不到豆粕的2/3，并且具有產(chǎn)量大、蛋白質(zhì)含量高、氨基酸組成較平衡等優(yōu)點。國際上棉籽粕產(chǎn)量僅次于豆粕，我國棉籽粕年產(chǎn)量達到650萬t，是僅次于豆粕、菜籽粕的第三大植物蛋白質(zhì)源。因此，利用相對廉價的棉籽粕部分或全部替代飼料中的豆粕具有較大的市場開發(fā)和應用前景。目前，關(guān)于棉籽粕部分或全部替代飼料中的豆粕已在虹鱒(Oncorhynchus mykiss)［1－2］和鱸魚(Lateolabrax japonicus)［3］等魚類上有相關(guān)研究。然而，由于棉籽粕中游離棉酚的存在，影響了棉籽粕在水產(chǎn)飼料中的應用和推廣。棉籽粕中游離棉酚能同賴氨酸結(jié)合導致賴氨酸利用率降低，對動物生長產(chǎn)生不利影響［4］，此外，游離棉酚能降低飼料中鐵的吸收，引起動物紅細胞數(shù)量下降［5］，并且游離棉酚被吸收入體內(nèi)存積于肝臟、腎臟和肌肉組織中，引起累積性中毒［6－7］，以上不利因素均影響了其在水產(chǎn)飼料中的添加量。本實驗室前期研究表明，高棉籽粕飼料會降低青魚幼魚的生長和免疫力，降低青魚血液中紅細胞(RBC)和白細胞(WBC)的數(shù)量，造成肝臟中游離棉酚累積，使肝功能受損［8］。鑒于此，本試驗擬通過在高棉籽粕飼料中補充補充鐵和賴氨酸，探討在高棉籽粕飼料中補充鐵和賴氨酸能否改善青魚幼魚的生長，降低游離棉酚的毒性，改善肝功能，降低肝臟和肌肉中游離棉酚含量，為提高飼料中棉籽粕的利用提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗飼料

以商品飼料配方為基礎，配制一種以魚粉、豆粕(粗蛋白質(zhì)含量為43%)為蛋白質(zhì)源的實用飼料作為豆粕對照飼料，在上述飼料的基礎上以棉籽粕(粗蛋白質(zhì)含量為42%)等蛋白質(zhì)替代100%的豆粕作為高棉籽粕飼料，并在高棉籽粕飼料中分別用 0.342%的晶體賴氨酸(有效含量 79%)、0.115%的七水硫酸亞鐵以及0.342%的晶體賴氨酸+0.115%的七水硫酸亞鐵等量替代面粉，分別作為高棉籽粕補充賴氨酸飼料、高棉籽粕補充鐵飼料、高棉籽粕補充鐵和賴氨酸飼料。試驗所配制的5種試驗飼料等氮等能，其中賴氨酸補充量以豆粕對照組為標準，鐵補充量參照Barros等［9］的試驗(游離棉酚與亞鐵離子比例為1∶1)，試驗飼料組成及營養(yǎng)水平見表1。飼料原料經(jīng)粉碎過40目篩，微量成分采取逐級擴大法混合均勻，采用雙螺旋壓條機擠壓出2.0 mm粒徑飼料顆粒，于陰涼處風干后置于－20℃冰柜中保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 試驗飼料組成及營養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎)Table 1 Composition and nutrient levels of experimental diets(DM basis) %

續(xù)表1

1.2 飼養(yǎng)管理

試驗用青魚由湖南省水產(chǎn)科學研究所魚類原種場提供，為同批次人工孵化魚苗，試驗前在室外水泥池中投喂商品飼料暫養(yǎng)20 d后，挑選個體大小均勻、體格健壯青魚于室內(nèi)水族箱(容積300 L)中投喂豆粕對照飼料馴化1周，饑餓24 h后，挑選規(guī)格一致、初始平均體重為(7.01±0.05)g 的青魚進行養(yǎng)殖試驗。試驗魚隨機分成6組，每組3個重復，每個重復30尾，以重復為單位放養(yǎng)于水族箱內(nèi)。日投餌量為體重的3%～5%，分 3次投喂(08:00、12:00、16:00)，每日換水 1 次，換水量占總體積的1/3并清除箱內(nèi)糞便，每日充氣12 h，保證溶氧濃度在5.0 mg/L以上，水溫(28±3)℃，pH 7.32±0.42，養(yǎng)殖時間持續(xù) 8 周。

1.3 樣品收集與指標測定

1.3.1 生長指標

試驗開始和結(jié)束時分別對各水族箱中青魚進行記數(shù)、稱重，計算存活率和特定生長率。每個水族箱隨機取5尾青魚供內(nèi)臟指數(shù)、肝胰指數(shù)和肥滿度測定。各指標計算公式如下:

式中:N0為初始魚數(shù)(尾);Nt為終末魚數(shù)(尾);Wf為平均終末體重(g);Wi為平均初始體重(g);t為飼養(yǎng)時間(d);Wh為肝胰臟重(g);Wv為內(nèi)臟重(g);Wq為魚體重(g);Lt為魚體長(cm)。

1.3.2 血液生理生化指標測定

試驗結(jié)束后停食24 h，用1 mL無菌注射器尾靜脈采血，用移液槍吸取部分血液，用RBC稀釋液稀釋200倍，Neubauer計數(shù)板計RBC數(shù)量，其余血液置于無菌離心管中，4℃靜置12 h，3 500 r/min離心15 min，取上層血清置于－80℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

血清谷草轉(zhuǎn)氨酶(glutamic oxaloacetic transaminase，GOT)、谷 丙 轉(zhuǎn) 氨 酶 (glutamic pyruvic transaminase，GPT)、溶菌酶(lysozyme，LZM)、總超氧化物歧化酶(total superoxide dismutase，T-SOD)活力采用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的試劑盒測定;血清補體4(complement 4，C4)含量采用浙江伊利康生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的試劑盒測定。

1.3.3 飼料和魚體中常規(guī)營養(yǎng)成分測定

試驗結(jié)束后，每個水族箱隨機取5尾青魚，－20℃冰凍保存作為全魚樣品。飼料和魚體樣品中常規(guī)營養(yǎng)成分測定參照 AOAC(1995)［10］的方法。其中，水分含量的測定采用105℃烘箱干燥恒重法，粗蛋白質(zhì)含量的測定采用凱氏定氮法，粗脂肪含量的測定采用索氏抽提法，粗灰分含量的測定采用550℃灼燒法，總能水平的測定采用氧彈式熱量計法。

1.3.4 組織中游離棉酚含量測定

組織游離棉酚含量參照GB/T 17334—1998所述方法測定。取青魚肌肉和肝臟組織，稱鮮重，冷凍干燥后稱干重，記算水分含量，磨碎。稱取0.200 0 g左右干樣，加入 5 mL無水乙醇，振蕩2 min，靜置分層，取上清，離心并過濾(0.45 μm 濾膜)，得到試樣。取試樣10μL，用高效液相色譜儀測定游離棉酚含量。標準曲線制備:準確吸取1.00、2.00、5.00、8.00 mL 的 50 μg/mL 棉酚標準液于10.0 mL容量瓶中，用無水乙醇稀釋至刻度，取10μL液相色譜測定，繪制標準曲線。組織中游離棉酚含量查標準曲線既得。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

試驗結(jié)果以平均值±標準差表示，用 SPSS 17.0軟件進行單因素方差分析，當差異顯著(P＜0.05)時，則采用Duncan氏法進行多重比較。

2 結(jié)果

2.1 高棉籽粕飼料補充賴氨酸和鐵對青魚幼魚生長的影響

由表2可知，各組間青魚的存活率無顯著差異(P＞0.05)。與豆粕對照組相比，高棉籽粕組青魚的特定生長率顯著降低(P＜0.05);在高棉籽粕飼料中單一補充賴氨酸、鐵及同時補充賴氨酸和鐵均能一定程度提高青魚的特定生長率，其中同時補充賴氨酸和鐵組(高棉籽粕+賴氨酸+鐵組)與高棉籽粕組差異顯著(P＜0.05)，與豆粕對照組差異不顯著(P＞0.05)。各組間青魚的內(nèi)臟指數(shù)和肝胰指數(shù)無顯著差異(P＞0.05)。與豆粕對照組比，高棉籽粕組青魚的肥滿度顯著降低(P＜0.05)，在高棉籽粕飼料中單一補充賴氨酸、鐵及同時補充賴氨酸和鐵均能一定程度提高青魚的肥滿度，但仍顯著低于豆粕對照組(P＜0.05)。

表2 高棉籽粕飼料中補充賴氨酸和鐵對青魚幼魚生長的影響Table 2 Effects of high cottonseed meal diet supplemented with lysine and iron on growth of juvenile black carp

2.2 高棉籽粕飼料中補充賴氨酸和鐵對青魚幼魚血液生理生化指標的影響

由表3可知，與豆粕對照組相比，高棉籽粕飼料顯著降低了血液RBC數(shù)量(P＜0.05)，在高棉籽粕飼料中補充鐵能一定程度提高血液RBC數(shù)量，且高棉籽粕+賴氨酸+鐵組血液RBC數(shù)量與豆粕對照組無顯著差異(P＞0.05)。棉籽粕替代豆粕顯著降低了青魚血清 C4含量(P＜0.05)，而在高棉籽粕飼料中補充鐵能顯著提高血清C4含量(P＜0.05)，且單一補充鐵組(高棉籽粕+鐵組)血清C4含量與豆粕對照組無顯著差異(P＞0.05)。與豆粕對照組相比，高棉籽粕飼料顯著降低了青魚血清T-SOD活力(P＜0.05)，高棉籽粕飼料中補充賴氨酸后其活力顯著高于高棉籽粕組(P＜0.05)，且與豆粕對照組無顯著差異(P＞0.05)。棉籽粕替代豆粕顯著降低了青魚血清LZM 活力(P＜0.05)，與高棉籽粕組相比，高棉籽粕飼料中單一補充賴氨酸、鐵及同時補充賴氨酸和鐵均顯著提高了血清LZM活力(P＜0.05)，但仍都顯著低于豆粕對照組(P＜0.05)。棉籽粕替代豆粕顯著提高了青魚血清GOT和GPT活力(P＜0.05)，與高棉籽粕飼料組相比，高棉籽粕飼料中補充鐵和賴氨酸后顯著降低了血清GOT和GPT活力(P＜0.05)，且單一補充鐵組血清GOT、GPT活力與豆粕對照組無顯著差異(P＞0.05)。

表3 高棉籽粕飼料中補充賴氨酸和鐵對青魚幼魚血液生理生化指標的影響Table 3 Effects of high cottonseed meal diet supplemented with lysine and iron on blood physiological-biochemical indexes of juvenile black carp

2.3 高棉籽粕飼料中補充賴氨酸和鐵對青魚幼魚體成分及組織中游離棉酚含量的影響

由表4可知，各組間魚體水分和粗灰分含量差異不顯著(P＞0.05)，而棉籽粕替代豆粕影響了魚體粗蛋白質(zhì)和粗脂肪含量，使魚體粗脂肪含量顯著提高(P＜0.05)，粗蛋白質(zhì)含量顯著降低(P＜0.05);與高棉籽粕飼料組相比，高棉籽粕飼料中單一補充鐵和賴氨酸對魚體粗脂肪和粗蛋白質(zhì)含量無顯著影響(P＞0.05)，但同時補充鐵與賴氨酸能顯著降低魚體粗脂肪含量(P＜0.05)，顯著提高魚體粗蛋白質(zhì)含量(P＜0.05)，且與豆粕對照組無顯著差異(P＞0.05)。與高棉籽粕飼料組相比，高棉籽粕飼料中補充鐵顯著降低了肌肉和肝臟中游離棉酚含量(P＜0.05)，而單一補充賴氨酸對肝臟中游離棉酚含量無顯著影響(P＞0.05)。

表4 高棉籽粕飼料中補充賴氨酸和鐵對青魚體成分及組織中游離棉酚含量的影響Table 4 Effects of high cottonseed meal diet supplemented with lysine and iron on body composition and tissue free gossypol content of juvenile black carp

3 討論

3.1 高棉籽粕飼料中補充賴氨酸和鐵對青魚幼魚生長的影響

本研究結(jié)果表明，棉籽粕替代豆粕顯著降低了青魚特定生長率，與本實驗室前期研究結(jié)果一致［11］。高棉籽粕飼料降低青魚的生長性能與棉籽粕中游離棉酚相關(guān)，研究表明，飼料中高含量的游離棉酚能降低尼羅羅非魚(Oreochromis niloticus)［12］和鸚鵡魚(Amphilophus)［13］的生長和飼料利用率。游離棉酚主要通過以下2個方面來影響魚類的生長和飼料利用率:1)游離棉酚在腸道能與鐵結(jié)合降低飼料中鐵的利用率［14］;2)游離棉酚能結(jié)合飼料中的賴氨酸，降低飼料中賴氨酸的利用率［15］。本試驗結(jié)果表明，在高棉籽粕飼料中同時補充鐵和賴氨酸能顯著提高青魚的特定生長率，與 Barros 等［9］和 Robinson［16］在 斑 點 叉 尾(Ictalurus punctatus)、Ei-Saidy 等［12］在尼羅羅非魚上的研究結(jié)果相似，其原因一方面可能與添加的外源晶體賴氨酸與棉籽粕中游離棉酚結(jié)合，減少了游離棉酚與內(nèi)源賴氨酸的結(jié)合，從而提高了飼料中賴氨酸的利用率有關(guān)［16］，另一方面可能與添加的外源鐵與游離棉酚在腸道內(nèi)結(jié)合減少了游離棉酚的吸收，降低了游離棉酚對機體的毒性有關(guān)［17－18］。高棉籽粕飼料顯著降低青魚的肥滿度，補充鐵和賴氨酸后能一定程度提高肥滿度，可能是因為游離棉酚與賴氨酸結(jié)合后抑制了與蛋白質(zhì)及脂肪代謝相關(guān)酶的合成，補充外源鐵和賴氨酸緩解了游離棉酚與賴氨酸的結(jié)合，促進了與蛋白質(zhì)代謝和脂肪代謝相關(guān)酶的合成。

3.2 高棉籽粕飼料中補充賴氨酸和鐵對青魚幼魚免疫力的影響

魚類血液指標能反映魚類機體健康和生理狀態(tài)，RBC具有識別、黏附和殺傷抗原、清除免疫復合物和參與機體免疫調(diào)控的作用，是機體免疫系統(tǒng)的重要組成部分。鐵是RBC的重要組成成分，鐵的缺乏會引起機體RBC數(shù)量的下降，吞噬細胞活性受損，使免疫力下降等癥狀［19］。本試驗結(jié)果顯示，高棉籽粕飼料能使青魚血液RBC數(shù)量顯著下降，與 Blom 等［6］等對虹鱒和 Yildirim 等［20］對斑點叉尾 的研究結(jié)果相似，但在高棉籽粕飼料中補充鐵后青魚血液中RBC數(shù)量有所增加，與Rojas 等［21］、Wedegaertner［22］、Jones［23］和 Martin［24］的研究結(jié)果相同，高棉籽粕飼料降低血液RBC數(shù)量可能與棉籽粕中游離棉酚在腸道內(nèi)與鐵結(jié)合，降低鐵的吸收利用有關(guān)，補充鐵后可緩解由于游離棉酚結(jié)合鐵而引起RBC數(shù)量降低癥狀［25］。

C4和LZM是重要的非特異性免疫指標，棉籽粕替代豆粕后使青魚血清LZM活力和C4含量顯著下降，與本實驗室前期研究結(jié)果一致［11］，而在高棉籽粕飼料中同時補充賴氨酸和鐵可顯著提高血清LZM活力和C4含量，可能與補充的鐵和賴氨酸與游離棉酚結(jié)合形成無毒的結(jié)合棉酚，降低了游離棉酚對機體的毒性作用有關(guān)。

GOT和GPT是反映肝功能的重要指標，當組織中毒、發(fā)生病變或者受損傷后，大量的GOT和GPT從細胞進入血液中，使血清中這2種酶的活力升高。本試驗結(jié)果表明，棉籽粕替代豆粕后使青魚血清GOT和GPT活力顯著升高，可能與高棉籽粕飼料中游離棉酚使肝功能受損有關(guān)，與本實驗前期研究結(jié)果一致［11］。同時，與高棉籽粕飼料組相比，高棉籽粕飼料中補充賴氨酸和鐵后顯著降低了青魚血清GOT和GPT活力，說明高棉籽粕飼料中補充賴氨酸和鐵可以有效降低棉籽粕中游離棉酚的毒性，改善肝功能，與Braham等［25］等在小鼠(Mus musculus)上的研究結(jié)果相同。

3.3 高棉籽粕飼料中補充賴氨酸和鐵對青魚幼魚組織中游離棉酚含量的影響

肝臟是游離棉酚累積的主要器官［14，26］。本研究結(jié)果表明，高棉籽粕飼料中補充鐵可使肌肉和肝臟中游離棉酚的含量顯著降低，與在尼羅羅非魚［9］、斑點叉尾［13］上得出的結(jié)果相似，可能與高棉籽粕飼料中補充的鐵和游離棉酚結(jié)合有關(guān)［15－16］。

此外，本試驗結(jié)果還表明，棉籽粕替代豆粕后使魚體粗脂肪含量升高，粗蛋白質(zhì)含量下降，而補充鐵和賴氨酸后魚體粗脂肪含量下降，粗蛋白質(zhì)含量升高，這可能與高棉籽粕飼料中的游離棉酚降低飼料中鐵和賴氨酸的利用，從而影響了機體的脂肪代謝和蛋白質(zhì)代謝有關(guān)。

4 結(jié)論

高棉籽粕飼料中同時補充賴氨酸和鐵能促進青魚生長，提高機體免疫力，降低肌肉和肝臟中游離棉酚含量，降低對肝臟的損傷，可有效提高飼料中棉籽粕的使用量。

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