陳香茶菌及枯草芽孢桿菌復(fù)合發(fā)酵豆粕的研究

姚勇芳 趙祥杰 廖延智 陳小鳳 李平凡*

(1.廣東輕工職業(yè)技術(shù)學(xué)院食品系，廣州 510300;2.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，廣州 510610;3.韶關(guān)市粵凰生態(tài)科技有限公司，韶關(guān) 512026)

蛋白質(zhì)原料是飼料工業(yè)發(fā)展的基礎(chǔ)，我國(guó)蛋白質(zhì)原料的緊缺和價(jià)格高漲已經(jīng)成為發(fā)展畜牧業(yè)和水產(chǎn)業(yè)的瓶頸之一。對(duì)飼料蛋白質(zhì)進(jìn)行體外消化，提供易消化、高吸收、高利用的蛋白質(zhì)原料是未來提高蛋白質(zhì)利用率和降低飼料成本的必然選擇。發(fā)酵豆粕作為植物蛋白質(zhì)源和微生物蛋白質(zhì)源的交叉部分，兼有2種蛋白質(zhì)源的優(yōu)勢(shì)，正成為關(guān)注的熱點(diǎn)，優(yōu)良的發(fā)酵豆粕具有以下優(yōu)點(diǎn)［1］:1)提高了豆粕蛋白質(zhì)的溶解度，利于消化;2)減小了豆粕蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量，其中的一部分已達(dá)到小肽水平甚至氨基酸水平，可以直接被動(dòng)物吸收;3)具有一定的芳香氣味和鮮味，適口性較好。菌種的優(yōu)良與否是成功生產(chǎn)生物蛋白質(zhì)飼料的關(guān)鍵。發(fā)酵豆粕常用的菌種有霉菌、酵母菌、枯草菌、乳酸菌等。單一菌種的作用效果不穩(wěn)定，目前市場(chǎng)主要是多種菌純培養(yǎng)物之間混合發(fā)酵，但存在兼容性不一定協(xié)調(diào)問題，因此，優(yōu)良的發(fā)酵菌種和適宜的發(fā)酵條件還有待進(jìn)一步研究和摸索。

陳香茶是指鮮葉經(jīng)殺青、揉捻、曬干(烘干)后經(jīng)長(zhǎng)時(shí)間自然發(fā)酵或毛茶經(jīng)渥堆而加工成的茶類。渥堆過程中，乳酸菌的數(shù)量不斷增加［2］。酵母菌類主要是產(chǎn)酒精和產(chǎn)酯等生香酵母，如魯氏酵母(Zygosaccharomyces rouxii)、釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、酒香酵母屬(Brettanomyces sp)、假絲酵母屬(Candida rkhout)等。陳香茶在后期發(fā)酵很復(fù)雜，由于茶中的蛋白質(zhì)含量少，使得有害菌很難生存，大多數(shù)是有益菌，同時(shí)，茶葉中的多酚類物質(zhì)會(huì)抑制有害菌的生長(zhǎng)，陳香茶的安全性很高?？莶菅挎邨U菌(Bacillus subtilis)是我國(guó)農(nóng)業(yè)部允許作為飼料添加劑的2種芽孢桿菌之一，具有很強(qiáng)的蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶等活性，能產(chǎn)生抗菌素，在動(dòng)物腸道內(nèi)具有較強(qiáng)生物奪氧能力，這些特性對(duì)促進(jìn)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)的消化吸收、提高動(dòng)物的飼料轉(zhuǎn)化率、防病及促進(jìn)生長(zhǎng)起到重要作用［3］。本試驗(yàn)通過陳香茶自然發(fā)酵成熟過程中形成良好補(bǔ)強(qiáng)性的曲種，在枯草芽孢桿菌協(xié)同下，進(jìn)行豆粕發(fā)酵研究，為陳香茶菌發(fā)酵飼料工業(yè)化生產(chǎn)起基礎(chǔ)研究作用。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與儀器

1.1.1 原料

陳香茶購(gòu)自廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物研究所;糖蜜、豆粕、麩皮自市場(chǎng)購(gòu)買;枯草芽孢桿菌由廣東高校特色調(diào)味品工程技術(shù)開發(fā)中心提供。

1.1.2 培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基:馬鈴薯削皮切片→稱100 g于500 mL燒杯中→加入500 g水→加熱煮沸30 min→8層紗布過濾→10 g葡萄糖→加水定容至500 mL，121℃滅菌15 min，備用。

液體培養(yǎng)基(用于枯草芽孢桿菌培養(yǎng)):1%蛋白胨，0.5%NaCl，0.5% 酵 母 粉，121 ℃ 滅 菌15 min，備用。

1.1.3 試劑

氫氧化鈉、鹽酸、pH計(jì)校正緩沖溶液、甲醛溶液、硼酸、葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液、氧化鎂、無水硫酸銅、硫酸鉀、濃硫酸、三氯乙酸，以上試劑均為分析純。

1.1.4 儀器

YX系列手提式壓力蒸汽滅菌鍋，上海涵今儀器儀表公司;電子天平，上海涵今儀器儀表公司;PHB－3便攜式pH計(jì)，安徽賽科環(huán)?？萍加邢薰?超凈工作臺(tái)，蘇州蘇潔凈設(shè)備公司;HPX－9162MBE數(shù)顯電熱培養(yǎng)箱，上海楚柏實(shí)驗(yàn)室設(shè)備有限公司;恒溫?fù)u床，常州冠軍儀器制造有限公司;離心機(jī)，上海化工機(jī)械廠;電熱恒溫水浴鍋，天津市泰斯特儀器有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試驗(yàn)流程

陳香茶粉→馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基→培養(yǎng)條件研究→陳香茶菌培養(yǎng)液+枯草芽孢桿菌發(fā)酵液→豆粕固態(tài)發(fā)酵條件研究。

1.2.2 陳香茶培養(yǎng)條件對(duì)固態(tài)發(fā)酵的影響研究

1.2.2.1 轉(zhuǎn)速對(duì)陳香茶菌培養(yǎng)的影響

稱取0.2 g陳香茶粉分別接入5瓶裝有100 mL馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基三角瓶中，膠塞封口。搖床轉(zhuǎn)速分別為 0、50、100、150、200 r/min，37 ℃培養(yǎng)24 h。

分別取10%培養(yǎng)液+2%糖蜜+23%水+65%豆粕，28℃固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)3 d。以酸溶性蛋白含量為指標(biāo)，選取最優(yōu)轉(zhuǎn)速。

1.2.2.2 溫度對(duì)陳香茶菌培養(yǎng)的影響

稱取0.2 g陳香茶粉分別接入4瓶裝有100 mL馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基三角瓶中，膠塞封口。溫度分別為 24、28、32、37 ℃。靜置培養(yǎng) 24 h。

固態(tài)發(fā)酵同 1.2.2.1，以酸溶性蛋白含量為指標(biāo)，選取最適培養(yǎng)溫度。

1.2.2.3 添加量對(duì)陳香茶菌培養(yǎng)的影響

分別稱取 0.2、0.5、0.8、1.1 g 陳香茶粉接入 4瓶裝有100 mL馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基三角瓶中，膠塞封口。28℃靜置培養(yǎng)24 h。

固態(tài)發(fā)酵同 1.2.2.1，以酸溶性蛋白含量為指標(biāo)，選取最適陳香茶粉添加量。

1.2.2.4 時(shí)間對(duì)陳香茶菌培養(yǎng)的影響

稱取0.5 g陳香茶粉分別接入5瓶裝有100 mL馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基三角瓶中，膠塞封口。分別 28 ℃靜置培養(yǎng) 16、20、24、28、32 h。

固態(tài)發(fā)酵同 1.2.2.1，以酸溶性蛋白含量為指標(biāo)，選取最適時(shí)間。

1.2.3 豆粕固態(tài)發(fā)酵條件研究

1.2.3.1 固態(tài)發(fā)酵條件關(guān)鍵因素的確定

1.2.3.1.1 糖蜜與麩皮對(duì)陳香茶菌豆粕發(fā)酵效果的對(duì)比研究 稱取0.5 g陳香茶粉分別接入5瓶裝有100 mL馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基三角瓶中，膠塞封口。37℃靜置培養(yǎng)24 h。

1)取10%培養(yǎng)液+4%糖蜜+21%水+65%豆粕;2)取10%培養(yǎng)液+4%麩皮+31%水+65%豆粕。28℃固態(tài)發(fā)酵分別培養(yǎng)3 d。測(cè)定酸溶性蛋白、氨基酸態(tài)氮含量及pH。

1.2.3.1.2 枯草芽孢桿菌添加對(duì)陳香茶菌豆粕發(fā)酵影響的研究 稱取0.5 g陳香茶粉分別接入5瓶裝有100 mL馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基三角瓶中，膠塞封口。28℃靜置培養(yǎng)24 h。

1)取10%陳香茶菌培養(yǎng)液+10%枯草芽孢桿菌發(fā)酵液(取新制枯草芽孢桿菌斜面2環(huán)于100 mL液體培養(yǎng)基中，37℃，24 h)+6%糖蜜+9%水+65%豆粕;2)取10%陳香茶菌培養(yǎng)液+6%糖蜜+19%水+65%豆粕，28℃固態(tài)發(fā)酵分別培養(yǎng)3 d。測(cè)定酸溶性蛋白、氨基酸態(tài)氮含量及pH。

1.2.3.2 固態(tài)發(fā)酵正交試驗(yàn)研究

按照陳香茶菌培養(yǎng)液量、枯草芽孢桿菌發(fā)酵液量、糖蜜量、培養(yǎng)溫度，設(shè)計(jì)4因素3水平試驗(yàn)(表 1)，豆粕含量為 55%，添加水分，總量為100%，進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵3 d，測(cè)定酸溶性蛋白含量， 確定最適發(fā)酵因素條件。

表1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 1 The orthogonal experimental design

1.2.3.3 豆粕最適固態(tài)發(fā)酵時(shí)間研究

稱取0.5 g陳香茶粉分別接入5瓶裝有100 mL馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基三角瓶中，膠塞封口。28℃靜置培養(yǎng)24 h。

利用 1.2.3.2 優(yōu)化固態(tài)發(fā)酵條件，分別培養(yǎng) 3、4、5、6 d。以酸溶性蛋白、氨基酸態(tài)氮含量及 pH為指標(biāo)，選取最適發(fā)酵天數(shù)。

1.2.4 指標(biāo)測(cè)定

1.2.4.1 酸溶性蛋白含量的測(cè)定

稱取 1.5 g樣品(精確至 0.000 1 g)至離心管中，加入15 mL 15%三氯乙酸溶液，混合均勻，再加入5 mL 15%三氯乙酸溶液，靜置沉降5 min(靜置前先進(jìn)行離心平衡)后轉(zhuǎn)到離心管中，在4 000 r/min下離心10 min，取上清液并轉(zhuǎn)到50 mL比色管中定容。取10 mL該溶液進(jìn)行消化，按凱氏定氮法測(cè)定酸溶性蛋白含量［4］。

1.2.4.2 氨基酸態(tài)氮含量的測(cè)定

精確稱量5 g左右的樣品，加入45 mL水溶解后在磁力攪拌器上攪拌20 min，過濾后取5 mL濾液于250 mL燒杯中，加入 150 mL蒸餾水與10 mL甲醛，在磁力攪拌器的攪拌下，用0.05 mol/L氫氧化鈉溶液滴定至 pH 9.2。按魏炳棟等［5］方法計(jì)算氨基酸態(tài)氮含量。

1.2.4.3 pH 測(cè)定

精確稱量5 g左右的樣品，加入45 mL水溶解后在磁力攪拌器上攪拌20 min，過濾后用酸度計(jì)直接測(cè)定溶液的pH。

2 結(jié)果

2.1 陳香茶菌培養(yǎng)條件對(duì)豆粕發(fā)酵影響的研究

2.1.1 陳香茶菌培養(yǎng)轉(zhuǎn)速對(duì)豆粕發(fā)酵影響

由圖1可知，在搖床0～200 r/min內(nèi)，酸溶性蛋白含量隨著轉(zhuǎn)速的增加而降低，當(dāng)轉(zhuǎn)速為0 r/min，即靜置培養(yǎng)時(shí)，酸溶性蛋白含量達(dá)到最高，為 5.37%。

圖1 陳香茶菌培養(yǎng)轉(zhuǎn)速對(duì)豆粕發(fā)酵影響Fig.1 Effects of culture speed of the complex flora from crusted tea on fermentation of soybean meal

2.1.2 陳香茶菌培養(yǎng)溫度對(duì)豆粕發(fā)酵影響

由圖2可知，陳香茶菌在28℃下培養(yǎng)效果最好，酸溶性蛋白含量達(dá)到5.91%。

圖2 陳香茶菌培養(yǎng)溫度對(duì)豆粕發(fā)酵影響Fig.2 Effects of culture temperature of the complex flora from crusted tea on fermentation of soybean meal

2.1.3 陳香茶菌培養(yǎng)添加量對(duì)豆粕發(fā)酵影響

由圖3可知，添加0.5 g陳香茶菌于葡萄糖馬鈴薯培養(yǎng)基中培養(yǎng)，得到的陳香茶菌培養(yǎng)液與枯草芽孢桿菌發(fā)酵液聯(lián)合發(fā)酵豆粕，酸溶性蛋白含量最高達(dá)到6.27%。

圖3 陳香茶菌培養(yǎng)添加量對(duì)豆粕發(fā)酵影響Fig.3 Effects of culture adding quantity of the complex flora from crusted tea on fermentation of soybean meal

2.1.4 陳香茶菌培養(yǎng)時(shí)間對(duì)豆粕發(fā)酵影響

由圖4可知，陳香茶菌在24 h培養(yǎng)后進(jìn)行豆粕固態(tài)發(fā)酵，酸溶性蛋白含量為 6.29%，效果最好。

圖4 陳香茶菌培養(yǎng)時(shí)間對(duì)豆粕發(fā)酵影響Fig.4 Effects of culture time of the complex flora from crusted tea on fermentation of soybean meal

2.2 豆粕固態(tài)發(fā)酵條件研究

2.2.1 固態(tài)發(fā)酵條件關(guān)鍵因素的確定

2.2.1.1 糖蜜與麩皮對(duì)豆粕發(fā)酵效果的對(duì)比

由圖5可知，陳香茶菌培養(yǎng)液分別接種糖蜜固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基與麩皮發(fā)酵培養(yǎng)基固態(tài)發(fā)酵，培養(yǎng)3 d，含糖蜜培養(yǎng)基發(fā)酵酸溶性蛋白含量為7.28%，氨基酸態(tài)氮含量為 1.43%，pH 為 5.09，發(fā)酵效果優(yōu)于含麩皮固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基。

2.2.1.2 枯草芽孢桿菌添加對(duì)陳香茶菌豆粕發(fā)酵效果影響研究

由圖6可知，固態(tài)發(fā)酵階段，添加枯草芽孢桿菌液組(10%)較對(duì)照組(0)理想，酸溶性蛋白含量達(dá)到7.54%，提高了1.36%;氨基酸態(tài)氮含量達(dá)到2.76%，pH 為 4.06，說明產(chǎn)生酸性物質(zhì)較對(duì)照多。

圖5 糖蜜與麩皮對(duì)豆粕發(fā)酵效果的對(duì)比Fig.5 Comparison of fermentation effects of molasses and bran on soybean meal

圖6 枯草芽孢桿菌對(duì)陳香茶菌豆粕發(fā)酵效果的影響Fig.6 Effects of Bacillus subtilis on soybean meal fermented by the complex flora from crusted tea

2.2.2 固態(tài)發(fā)酵正交試驗(yàn)研究

由表2和圖7可知，影響因素的主次為:C(糖蜜)＞D(溫度)＞B(陳香茶菌培養(yǎng)液)＞A(枯草芽孢桿菌發(fā)酵液);對(duì)表2的結(jié)果進(jìn)行分析，得到優(yōu)化組合為:A2B1C3D3，即枯草芽孢桿菌發(fā)酵液10%，陳香茶菌發(fā)酵液 10%，糖蜜 10%，溫度37℃，即豆粕固態(tài)發(fā)酵為:枯草芽孢桿菌發(fā)酵液10%+陳香茶菌培養(yǎng)液10%+糖蜜10%+水10%+豆粕55%，在37℃無氧條件下培養(yǎng)3 d。

2.2.3 豆粕最適固態(tài)發(fā)酵時(shí)間研究

由圖8可知，隨著發(fā)酵天數(shù)的延長(zhǎng)，發(fā)酵豆粕的酸溶性蛋白含量逐漸增加，由發(fā)酵第3天的7.82%到第6天的8.85%，酸溶性蛋白含量提升了1.03%;氨基酸態(tài)氮含量和pH隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)有明顯的變化，pH降低1.11，氨基酸態(tài)氮含量提高 0.87%。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 The result of orthogonal experiment

圖7 因素與指標(biāo)間的關(guān)系示意圖Fig.7 Schematic diagram of the relationship between factors and index

3 討論

3.1 陳香茶菌培養(yǎng)條件對(duì)豆粕發(fā)酵影響

目前市場(chǎng)發(fā)酵飼料以固態(tài)厭氧發(fā)酵的方式進(jìn)行，相對(duì)于好氧發(fā)酵，厭氧發(fā)酵的能耗低，微生物代謝產(chǎn)生的熱量小，生產(chǎn)過程不需要翻拌散熱。另外，發(fā)酵產(chǎn)品只要密封得當(dāng)，即使長(zhǎng)期存放也不會(huì)腐敗變質(zhì)。生產(chǎn)菌種常以乳酸菌、芽孢桿菌和酵母菌為主。普遍認(rèn)為，發(fā)酵豆粕菌種使用，單菌不如多菌，純培養(yǎng)(多菌種的純培養(yǎng)物之間的相容性不一定協(xié)調(diào))不如曲種(曲種中的微生物是天然組合的，相互之間互補(bǔ)性強(qiáng))［6］。陳香茶中陳香菌群主要包括霉菌類(黑曲霉、灰綠曲霉等)、酵母類、細(xì)菌類(乳酸菌等)，其中酵母菌為兼性厭氧菌，乳酸菌為需氧和兼性厭氧菌，其他為耗氧菌。通過陳香茶菌不同培養(yǎng)方式，改變菌項(xiàng)關(guān)系，再通過密閉式生料豆粕固態(tài)發(fā)酵，培養(yǎng)基內(nèi)氧氣被需氧菌逐漸消耗完后，酵母菌及乳酸菌轉(zhuǎn)為優(yōu)勢(shì)菌［7］。

酸溶性蛋白是較低分子質(zhì)量的蛋白質(zhì)水解物，包括小肽和游離氨基酸，因可以溶于酸性溶液而得名。以酸溶性蛋白為檢測(cè)指標(biāo)，能夠很真實(shí)地反映豆粕經(jīng)微生物降解的情況，具有實(shí)際意義。Agar等［8］研究表明，腸道能完整地吸收轉(zhuǎn)運(yùn)雙甘肽。Chung等［9］證實(shí)了肽可以被完整轉(zhuǎn)運(yùn)吸收的觀點(diǎn)。Fei等［10］克隆了小肽載體，證明了寡肽尤其是小肽可不被消化成游離氨基酸，而是直接以肽的形式由載體轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入體循環(huán)。Hara等［11］試驗(yàn)結(jié)果表明，蛋白質(zhì)在消化道中的消化終產(chǎn)物往往大部分是小肽而不是游離氨基酸。當(dāng)轉(zhuǎn)速為0 r/min，即靜置培養(yǎng)時(shí)，培養(yǎng)液溶氧量最少，不適于陳香茶需氧菌生長(zhǎng)，通過培養(yǎng)液固態(tài)發(fā)酵豆粕，酸溶性蛋白含量達(dá)到5.37%。

圖8 豆粕最適固態(tài)發(fā)酵時(shí)間Fig.8 The optimal time of solid state fermentation of soybean meal

陳香茶菌群培養(yǎng)溫度28℃左右時(shí)，適合陳香茶真菌(霉菌、酵母菌)生長(zhǎng)，霉菌需氧生長(zhǎng)，繁殖速度較慢，有利于酵母菌增殖。陳香茶培養(yǎng)液固態(tài)發(fā)酵豆粕過程中，酵母菌進(jìn)行糖酵解，產(chǎn)生一些代謝活性物質(zhì)，促進(jìn)乳酸菌在后期的繁殖［12］。發(fā)酵過程中pH的變化會(huì)影響到微生物多樣性的變化，通過影響微生物群落結(jié)構(gòu)的變化最終影響發(fā)酵產(chǎn)物的分布，進(jìn)而影響到發(fā)酵品質(zhì)。因此發(fā)酵豆粕有機(jī)酸含量和pH能夠直觀地反映發(fā)酵飼料的品質(zhì)，其中乳酸含量越高，乙酸、丙酸和丁酸含量越低，發(fā)酵品質(zhì)越好。pH一方面可反映發(fā)酵的進(jìn)程，并對(duì)發(fā)酵過程產(chǎn)生重要的影響;另一方面使用pH低的飼料配制飼糧也可促進(jìn)飼糧酸化，飼糧酸化可改善飼糧品質(zhì)，可提高飼糧適口性和消化率，飼糧中的酸能直接刺激口腔內(nèi)的味蕾細(xì)胞，使唾液分泌增多而增進(jìn)食欲，而且有機(jī)酸具有獨(dú)特的芳香，可掩蓋飼料中的不適氣味。這一點(diǎn)對(duì)斷奶仔豬尤為重要［13］。利用28℃培養(yǎng)陳香茶培養(yǎng)液進(jìn)行豆粕固態(tài)發(fā)酵，酸溶性蛋白含量較高，產(chǎn)生的發(fā)酵豆粕帶有酸香味。陳香茶菌培養(yǎng)過程中，在有限氧氣和營(yíng)養(yǎng)條件下，低于0.5 g茶粉添加量，其菌體增殖整體數(shù)量較少;高于0.5 g茶粉添加量，因菌群中微生物對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的利用能力不同，菌體數(shù)量過多造成營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)無規(guī)律消耗，固態(tài)發(fā)酵酸溶性蛋白含量反而出現(xiàn)降低。陳香茶菌群16～24 h培養(yǎng)過程中，隨著氧氣逐漸消耗，需氧菌生長(zhǎng)受限，酵母菌及乳酸菌成為優(yōu)勢(shì)菌，協(xié)同增殖。24～32 h培養(yǎng)過程中，養(yǎng)料逐漸消耗，pH逐漸上升，酵母菌出現(xiàn)自溶，乳酸菌抑制生長(zhǎng)，導(dǎo)致培養(yǎng)液進(jìn)行豆粕固態(tài)發(fā)酵，酸溶性蛋白含量降低。

3.2 固態(tài)發(fā)酵條件關(guān)鍵因素的確定

麩皮主要是由粗纖維和淀粉類等大分子物質(zhì)組成，難被酵母和乳酸菌直接利用;糖蜜含有大量可溶性糖(主要是蔗糖)，是制糖業(yè)的副產(chǎn)品之一，含有眾多微量元素和維生素，成本低廉，為理想的發(fā)酵輔料［14］。酵母菌在有氧條件下消耗氧氣，在厭氧條件下進(jìn)行糖酵解，產(chǎn)生酒精和有機(jī)酸。主要利用飼料中的單糖和雙糖，基本不能利用淀粉和纖維素類多糖。乳酸菌基本上是厭氧菌，單糖和雙糖是其能量來源，可以把六碳糖轉(zhuǎn)化成乳酸和乙酸等有機(jī)酸。

枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)能力較強(qiáng)，可產(chǎn)淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、纖維素酶等活性較高的酶;在飼料干燥過程中產(chǎn)生芽孢，存活率較高;同時(shí)能產(chǎn)生抗菌素，在動(dòng)物腸道內(nèi)具有較強(qiáng)生物奪氧能力。這些特性對(duì)促進(jìn)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)的消化吸收、提高動(dòng)物的飼料轉(zhuǎn)化率、防病及促進(jìn)生長(zhǎng)起到重要作用［15－16］。在發(fā)酵過程中，芽孢桿菌消耗氧氣為乳酸菌創(chuàng)造厭氧環(huán)境，發(fā)酵環(huán)境很快處于厭氧狀態(tài)，霉菌及耗氧細(xì)菌無法生長(zhǎng)，而此時(shí)酵母菌、乳酸菌代謝能力加強(qiáng)。但是當(dāng)發(fā)酵體系中氧氣過多時(shí)會(huì)引起發(fā)酵產(chǎn)品產(chǎn)生很重的氨味，從而影響飼料適口性和可消耗化性能，同時(shí)也浪費(fèi)蛋白質(zhì)資源，因此，在發(fā)酵過程中，控制密閉環(huán)境的間隙度十分重要。

3.3 豆粕固態(tài)發(fā)酵條件研究

固態(tài)發(fā)酵階段需氧菌利用有限氧氣生長(zhǎng)，枯草芽孢桿菌奪氧強(qiáng)，密閉條件下，加快處于厭氧狀態(tài)，霉菌及耗氧細(xì)菌無法生長(zhǎng)，而此時(shí)酵母菌、乳酸菌代謝加強(qiáng)。在酶參與下，厭氧菌代謝降低抗?fàn)I養(yǎng)因子含量，提高有機(jī)酸及酸溶性蛋白含量，形成優(yōu)質(zhì)發(fā)酵豆粕。

陳香茶菌培養(yǎng)液接種量在10%左右時(shí)，發(fā)酵產(chǎn)品中酸溶性蛋白含量最高。接種量太小，菌體需要較長(zhǎng)時(shí)間才能大量生長(zhǎng);接種量太大，造成基質(zhì)中含水量增加，影響豆粕顆粒之間存在的合適疏松度，不利于有限氧的溶入和CO2的排出，抑制微生物菌體生長(zhǎng)，從而使發(fā)酵產(chǎn)品中酸溶性蛋白含量降低。

糖蜜含量為10%時(shí)，酸溶性蛋白含量最高，有較淡的醇香味。過多或過少糖蜜含量可能會(huì)改變碳氮比(C/N)，影響發(fā)酵品質(zhì)。微生物生長(zhǎng)要經(jīng)過停滯期、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、穩(wěn)定期和衰退期4個(gè)階段。不同的微生物對(duì)原料的利用情況和分解速度不同，對(duì)于較容易利用的原料，微生物可以很快經(jīng)過停滯期而進(jìn)入生長(zhǎng)繁殖期，即停滯期較短;而對(duì)于一些較難分解利用的原料(如纖維素等結(jié)構(gòu)復(fù)雜的碳水化合物)，微生物的停滯期會(huì)相應(yīng)延長(zhǎng)。發(fā)酵原料中含有較大比例糖蜜等含糖量高的農(nóng)副產(chǎn)品時(shí)，乳酸菌就能順利完成發(fā)酵，產(chǎn)生大量有機(jī)酸［17］。

豆粕發(fā)酵3～6 d能夠都能滿足市場(chǎng)要求［18］。正交試驗(yàn)涉及菌種主要有乳酸菌、芽孢桿菌和酵母菌。3種菌對(duì)溫度的敏感性和最適生長(zhǎng)溫度有所不同，其中乳酸菌主要對(duì)碳水化合物進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)生乳酸，對(duì)發(fā)酵品質(zhì)有重要的影響，在20～43℃均可生長(zhǎng)，但大多數(shù)乳酸菌發(fā)酵的適宜溫度是30～40℃。酵母菌和芽孢桿菌屬于需氧菌，可通過其繁殖為乳酸菌的發(fā)酵創(chuàng)造有利條件。

4 結(jié) 論

①陳香茶菌適宜培養(yǎng)條件為:稱取0.5 g陳香茶粉接入裝有100 mL馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基三角瓶中，28℃靜置培養(yǎng)24 h。

②豆粕固態(tài)發(fā)酵最佳工藝為:10%枯草芽孢桿菌培養(yǎng)液+10%陳香茶菌培養(yǎng)液+10%糖蜜+10%水+55%豆粕，在37℃密閉條件下培養(yǎng)3～6 d。

［1］ 馬文強(qiáng)，馮杰，劉欣.微生物發(fā)酵豆粕營(yíng)養(yǎng)特性研究［J］.中國(guó)糧油時(shí)報(bào)，2008，23(1):121－124.

［2］ 雷曉燕.普洱茶中主要微生物的研究［J］.沈陽(yáng)化工學(xué)院學(xué)報(bào)，2009，23(2):134－137.

［3］ 陸熹，李霞，仲小蘭，等.微生物發(fā)酵在我國(guó)飼料工業(yè)中的應(yīng)用及發(fā)展探討［J］.現(xiàn)代科技農(nóng)業(yè)，2008，42(1):156－160.

［4］ 吳勝華，李呂木，張邦輝，等.多菌種固態(tài)發(fā)酵豆粕生產(chǎn)小肽飼料［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2008，34(10):113－115.

［5］ 魏炳棟，陳群，劉海燕，等.乳酸菌固態(tài)發(fā)酵對(duì)豆粕蛋白質(zhì)含量、體外消化率及游離氨基酸含量的影響［J］.飼料博覽:技術(shù)版，2010，42(3):3－5.

［6］ HU J K，LU W Q，WANG C L，et al.Characteristics of solid-state fermented feed and its effects on performance and nutrient digestibility in growing-finishing pigs［J］.Asian-Australasian Journal of Animal Sciences，2008，21(11):1635－1641.

［7］ 周靜，肖嫩群.酵母菌與乳酸菌混合培養(yǎng)條件研究［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，39(15):8824－8825.

［8］ AGAR W T，HIRD F JR，SIDHU G S.The active absorption of amino acids by the intestine［J］.The Journal of Physiology，1953，121(2):255－263.

［9］ CHUNG SY，SWAISGOOD H E，CATIGNANI G L.Effects of alkali treatment and treatment in the prence of fructose on digestibility of food proteins asdetermined by and immobilized digestive enzyme assay(IDEA)［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，1986，34(3):579－584.

［10］ FEI Y J，KANAI Y，NUSSBERGER S，et al.Expression cloning of a mammalian proton-coupled oligopeptide transporter［J］.Nature，1994，368(6471):563 －566.

［11］ HARA H，F(xiàn)UNABIKI R，IWATA M，et al.Portal absorption of small peptides in rats under unrestrained conditions［J］.The Journal of Nutrition，1984，114(6):1122－1129.

［12］ 賀月林，郭照輝，譚周進(jìn)，等.酵母菌與乳酸菌混合培養(yǎng)中試研究［J］.現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2010，20(2):29－31.

［13］ GABERT V M，SAUER W C，SCHMITZ M，et al.The effect of formic acid and buffering capacity on the ileal digestibilities of amino acids and bacterial populations and metabolites in the small intestine of weanling pigs fed semipurified fish meal diets［J］.Canadian Journal of Animal Science，1995，75(4):615－623.

［14］ BRODERICK G A，RADLOFF W J.Effect of molasses supplementation on the production of lactating dairy cows fed diets based on alfalfa and corn silage［J］.Journal of Dairy Science，2004，87(9):2997－3009.

［15］ 周伏忠，賈藴麗，陳國(guó)參，等.豆粕發(fā)酵適宜菌株篩選及其發(fā)酵技術(shù)研究［J］.河南科學(xué)，2007，25(3):409－412.

［16］ 莫重文，黃崗.固態(tài)發(fā)酵法生產(chǎn)發(fā)酵豆粕的研究［J］.中國(guó)油脂，2007，32(7):38－40.

［17］ 陸文清.發(fā)酵飼料生產(chǎn)與應(yīng)用技術(shù)［M］.北京:中國(guó)輕工業(yè)出版社，2011:99－100.

［18］ 王金斌，馬海樂，段玉清，等.混菌固態(tài)發(fā)酵豆粕生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)高蛋白飼料研究［J］.中國(guó)糧油學(xué)報(bào)，2011，24(2):120－124.