豬源多殺性巴氏桿菌分離鑒定及藥敏試驗(yàn)

文│王翠霞 車小平（甘肅省臨夏市畜牧技術(shù)推廣站）

豬源多殺性巴氏桿菌病引起慢性豬巴氏桿菌性肺炎和豬肺疫，又稱“鎖喉風(fēng)”急性感染以敗血癥和出血性炎癥為主要特征，其慢性感染以關(guān)節(jié)、皮下結(jié)締組織及臟器化膿為主要特征。本病由被感染病豬分泌物排泄物散毒后經(jīng)消化道進(jìn)行傳播，在季節(jié)交替、氣候多變的時(shí)候多發(fā)，一般呈地方流行性。本菌分型復(fù)雜，地區(qū)差異性較大，在動(dòng)物防疫工作帶來極大的困難。本研究從某地區(qū)疑似巴氏桿菌感染的病、死豬肺臟組織中分離出4株由生化鑒定為巴氏桿菌，對(duì)細(xì)菌作藥物敏感試驗(yàn)以了解本地區(qū)豬巴氏桿菌的耐藥情況，為今后防治本病提供依據(jù)。

一、材料和方法

1.病料來源。從某地發(fā)生呼吸道疾病，經(jīng)臨床初診為豬肺疫的規(guī)?；i場(chǎng)采集12只病、死豬的肺臟組織、淋巴結(jié)等病料組織進(jìn)行試驗(yàn)。

2.主要試劑。營(yíng)養(yǎng)瓊脂、LB肉湯、大豆酪蛋白瓊脂、血瓊脂平板；細(xì)菌微量生化鑒定管（氧化酶、甘露醇、吲哚、葡萄糖、果糖、蔗糖、脲酶等生化鑒定管購自杭州天和微生物試劑有限公司）；藥敏紙片，及其他分析醇試劑。

3.實(shí)驗(yàn)方法。

（1）病料鏡檢：將病變嚴(yán)重的部位涂片后進(jìn)行革蘭氏染色和瑞氏染色，油鏡下觀察細(xì)菌形態(tài)。

（2）細(xì)菌分離：無菌采集疑似病死豬的新鮮病料后取病變典型部位，進(jìn)行組織勻漿后接種于LB肉湯中37℃震蕩培養(yǎng)24小時(shí)后涂布大豆酪蛋白瓊脂（TSA）培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24小時(shí)，觀察菌落生長(zhǎng)情況，挑取可疑菌落進(jìn)行染色鏡檢、分離純化。

（3）生化鑒定：將分離純化后的細(xì)菌液體培養(yǎng)后接種于各種碳水化合物、尿素酶、糖苷等微型生化鑒定管中，37℃培養(yǎng)24～48小時(shí)觀察結(jié)果，同時(shí)做氧化酶和接觸酶實(shí)驗(yàn)。

（4）藥敏試驗(yàn)：吸取細(xì)菌液體物200微升反復(fù)均勻涂布于TSA培養(yǎng)基上，待干燥后將慶大霉素、卡那霉素、阿米卡星等20種常規(guī)藥敏紙片貼放在培養(yǎng)基表面置于37℃培養(yǎng)24～48小時(shí)，觀察抑菌圈的大小記錄結(jié)果。判斷標(biāo)準(zhǔn)為藥物敏感試驗(yàn)抑菌環(huán)直徑判斷標(biāo)準(zhǔn)（WS/T125-1999）。

二、結(jié)果

1.細(xì)菌分離鑒定。病料組織涂片鏡檢和疑似菌分離純化后，單個(gè)菌落抹片后鏡檢，瑞氏染色可見典型的兩極深染的短桿狀細(xì)菌；革蘭氏染色發(fā)現(xiàn)有散在的革蘭氏陰性球桿狀或短桿狀細(xì)菌，偶見成對(duì)存在。

細(xì)菌在TSA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好，形成圓形、不透明、表面光滑、濕潤(rùn)的露滴樣菌落；血瓊脂平板上生長(zhǎng)良好，但是不溶血；營(yíng)養(yǎng)瓊脂上不生長(zhǎng)。

2.生化試驗(yàn)鑒定結(jié)果（表1）。將分離純化后的4株疑似菌落編號(hào)為①、②、③、④，接種于微量生化管進(jìn)行生化試驗(yàn)鑒定，結(jié)果和第八版《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》中描述一致，初步判定為多殺性巴氏桿菌。

3.藥敏試驗(yàn)。對(duì)分離純化后的4株經(jīng)生化鑒定為巴氏桿菌的菌株分別進(jìn)行藥物敏感試驗(yàn)，測(cè)得各分離株對(duì)藥敏紙片的抑菌圈大小并取平均值進(jìn)行判定，4個(gè)菌株均對(duì)β-內(nèi)酰胺類和大環(huán)內(nèi)酯類抗生素很敏感，對(duì)磺胺類、氨基糖苷類、喹諾酮類、林可胺類和氯霉素類抗菌藥物具有一定的耐藥性；對(duì)四環(huán)素類和硝基呋喃類抗菌藥物高度耐藥，詳見表2。

三、討論

本研究經(jīng)過試驗(yàn)從疑似病料組織中分出了4株多殺性巴氏桿菌，經(jīng)革蘭氏染色鏡檢為革蘭氏陰性球桿菌或短桿菌，以散在分布為主，偶見成對(duì)；經(jīng)瑞氏染色鏡檢可見兩極著色深，中間染色淺的小短桿菌。細(xì)菌在TSA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好，在鮮血瓊脂上生長(zhǎng)良好無溶血現(xiàn)象，在營(yíng)養(yǎng)瓊脂上幾乎不生長(zhǎng)。經(jīng)生化試驗(yàn)鑒定該菌能夠發(fā)酵果糖、蔗糖、葡萄糖、半乳糖、甘露糖、甘露醇、D-山梨醇、D-甘露醇產(chǎn)酸。

近年來，由于抗生素濫用和殘留等因素導(dǎo)致細(xì)菌普遍存在復(fù)雜的耐藥性現(xiàn)象，不同地區(qū)感染相同的病原菌其藥物敏感性卻各不相同，這一結(jié)果與當(dāng)?shù)嘏R床上的用藥習(xí)慣有關(guān)，因此遇到傳染病發(fā)生時(shí)不能盲目使用抗生素類藥物，通過藥敏實(shí)驗(yàn)篩選效果較好，對(duì)病原微生物敏感的抗菌藥物有針對(duì)性地進(jìn)行治療才能達(dá)到控制病情的目的。根據(jù)藥物敏感試驗(yàn)證實(shí)本次分離純化的4株豬源多殺性巴氏桿菌對(duì)β-內(nèi)酰胺類和大環(huán)內(nèi)酯類抗生素很敏感，對(duì)磺胺類、氨基糖苷類、喹諾酮類、林可胺類和氯霉素類抗菌藥物具有一定的耐藥性；對(duì)四環(huán)素類和硝基呋喃類抗菌藥物高度耐藥；為發(fā)病豬場(chǎng)多殺性巴氏桿菌病的治療和預(yù)防提供依據(jù)，可以采用氨芐青霉素、棒酸、阿奇霉素、先鋒霉素、螺旋霉素等藥物。

表1 分離純化后細(xì)菌生化試驗(yàn)結(jié)果

表2 藥物敏感試驗(yàn)結(jié)果

目前對(duì)于臨床上流行的豬巴氏桿菌病最有效的控制措施仍為抗菌藥物，但是由于菌體普遍存在抗生素耐藥的結(jié)局，因此我們?cè)谠摰貐^(qū)防控巴氏桿菌病時(shí)主要從傳染病傳播的三要素進(jìn)行，一為控制傳染源，對(duì)本地區(qū)巴氏桿菌流行的養(yǎng)殖場(chǎng)進(jìn)行徹底的消毒滅源，使用2%來蘇爾、3%福爾馬林、3%石炭酸等巴氏桿菌敏感的消毒藥物對(duì)病豬污染的圈舍、飼草料、用具、車輛等進(jìn)行徹底的消毒；二為保護(hù)易感動(dòng)物，一旦發(fā)現(xiàn)畜群中有發(fā)病的情況，對(duì)接觸過病豬的疑似豬和健康豬進(jìn)行徹底的隔離。

多殺性巴氏桿菌的血清分型根據(jù)莢膜K抗原分為A，B，D，E和F 5個(gè)血清型，根據(jù)O抗原的差異分為12個(gè)血清型，根據(jù)耐熱抗原差異分為16個(gè)菌體型。對(duì)于巴氏桿菌病來說最好的預(yù)防措施為注射疫苗，但是由于其血清型較多，各血清型之間交叉免疫保護(hù)作用較弱，市場(chǎng)上購買的疫苗往往起不到預(yù)防作用。因此筆者建議將分離出的巴氏桿菌擴(kuò)大培養(yǎng)后制作滅活自家苗，可以有效地預(yù)防巴氏桿菌病在本地區(qū)的流行。