傳染性支氣管炎病毒分子生物學(xué)的研究進(jìn)展

文│宋會臻（山東省濰坊市臨朐縣畜牧局）

傳染性支氣管炎（IB）是由傳染性支氣管炎病毒（IBV）引起的雞的一種急性、高度接觸性傳染病，以氣管啰音、咳嗽、呼吸困難等呼吸道癥狀和腎臟腫大蒼白、腎小管和輸尿管尿酸鹽沉積等泌尿生殖道病變?yōu)橹饕卣?。另外該病還可以使蛋雞產(chǎn)蛋量和產(chǎn)蛋品質(zhì)下降，給養(yǎng)雞業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。

1930年在美國首先發(fā)現(xiàn)了IB，1931年Schalk和Hawn正式報道了該病，1936年Beach和Schalm確定了該病的病原，1937年Beaudette和Hudson首次利用雞胚成功培養(yǎng)了IBV，1956年Jungherr等證明了IB病原不止一個血清型，1962年Winterfield和Hitchner發(fā)現(xiàn)了腎病變型IB，1972年中國鄺榮祿首次發(fā)現(xiàn)了該病，1988年中國分離出了腎型IBV。迄今，世界各地仍不斷出現(xiàn)關(guān)于IBV血清型毒株的報道。IBV傳播速度快，潛伏期短，加上雞場集約化養(yǎng)雞的密集和腎型、腺胃型、嗜腸型新變異株的出現(xiàn)，給我國養(yǎng)雞業(yè)帶來了新的威脅?，F(xiàn)就病毒的生物學(xué)特性、基因組結(jié)構(gòu)、病毒變異、分子生物學(xué)診斷等方面作一綜述。

一、病原學(xué)及生物學(xué)特性

傳染性支氣管炎病毒（IBV）為有囊膜的單股正鏈RNA病毒，多數(shù)呈圓形或橢圓形，直徑約120納米，表面有長約20納米的桿狀纖突。IBV對熱和0.2%去氧膽酸鈉、0.01%高錳酸鉀溶液高度敏感，其在-30℃以下可以存活24年，在56℃15分鐘或45℃90分鐘即可滅活，在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.01% 高錳酸鉀、1%的來蘇爾、1%福爾馬林、2%氫氧化鈉溶液中3分鐘即可被滅活。IBV對乙醚、氯仿等有機(jī)溶劑敏感。病毒在PH＝7.8時穩(wěn)定性較好。多數(shù)IBV表面沒有凝集原，本身不能直接凝集紅細(xì)胞，但經(jīng)過磷脂酶等處理后可具有凝集紅細(xì)胞的活性，這一活性能被特異性抗血清所抑制。目前，人們可利用IBV的血凝活性鑒定毒株和檢測抗體。雞IBV能干擾新城疫病毒（NDV）在雛雞、雞胚和雞腎細(xì)胞內(nèi)的增值，利用IBV的這一生物學(xué)特性，可將NDV干擾試驗作為鑒定IBV的方法之一。

二、基因組結(jié)構(gòu)

IBV屬冠狀病毒科冠狀病毒屬，是長約27千堿基對（Kb）的單股正鏈RNA病毒。在病毒基因中至少有10個明顯的開放閱讀框（ORF），編碼分子量為6.7～440道爾頓（KD）的蛋白，即結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白。IBV被分為6個區(qū)域，由小到大分別被命名為mRNA A～F。IBV有3種主要結(jié)構(gòu)蛋白：纖突蛋白（S）、膜蛋白（M，又叫基質(zhì)蛋白）、核衣殼蛋白（N）。這三種蛋白分別是由mRNA E、C、A編碼，其蛋白的摩爾比分別是1∶6∶15。另外，還有極少量的與病毒囊膜有關(guān)的小膜（E）蛋白。且不同蛋白的功能有所不同。

1.纖突蛋白（S）。S蛋白是決定IBV抗原性的主要結(jié)構(gòu)蛋白。該蛋白是病毒桿狀纖突的主要組成部分，也是病毒最重要的保護(hù)性抗原。S蛋白有S1和S2兩種糖多肽，S1糖蛋白的分子量約為90KD，由520～538個AA組成；S2糖蛋白的分子量約為84KD，由625個AA組成。在所知的IBV基因序列中，S蛋白的裂解位點(diǎn)都是保守的，它是由S1的N端和S2的C端通過二硫鍵連接而成。兩種糖蛋白中S1糖蛋白是形成S蛋白的主要部分，也是IBV基因組發(fā)生變異的主要部位。當(dāng)基因發(fā)生突變和重組時，S1蛋白表面的抗原決定簇的構(gòu)象就會發(fā)生變化，隨之IBV就會出現(xiàn)新的變異株。S蛋白有多種生物學(xué)功能：可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生IBV特異性中和抗體（VN）、血凝抑制抗體（HI）；S蛋白與宿主細(xì)胞膜上糖蛋白受體的結(jié)合，使IBV吸附在宿主細(xì)胞上，只有S蛋白被宿主細(xì)胞的蛋白酶切割為S1和S2兩條多肽時，病毒囊膜才有融細(xì)胞的活性；S1蛋白氨基N端可決定病毒毒株的組織嗜性和毒力情況；S1蛋白還可決定IBV的血清型；S2蛋白可誘發(fā)較弱的中和抗體，其在大多數(shù)IBV毒株中是保守的，可作為IBV疫苗。

2.膜蛋白（M）。M蛋白的分子量約為30KD，由225個氨基酸（AA）組成。該蛋白占病毒總蛋白的40%左右，大部分M蛋白AA鑲嵌在病毒囊膜上或內(nèi)膜的表面，只有10%左右的AA裸露在膜的外表面。它可以控制并介導(dǎo)病毒粒子在粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或高爾基體膜上的出芽，病毒裝配時與核衣殼的相互作用，核衣殼結(jié)合囊膜的作用。M蛋白在3種主要結(jié)構(gòu)蛋白中的免疫原性相對較低，然而在補(bǔ)體存在的前提下，抗M蛋白抗體可以中和病毒抗原?？傊琈蛋白在病毒免疫學(xué)方面的功能還需要進(jìn)一步的探索。

3.核衣殼蛋白（N）。N蛋白是病毒核衣殼的組成蛋白，分子量約為46KD，由409個AA組成。N蛋白是IBV相對穩(wěn)定和較保守的基因，研究表明，N蛋白在IBV的檢測、RNA的合成、血清學(xué)分類、免疫的識別、細(xì)胞免疫與體液免疫中有重要的作用，特別是對核酸疫苗的研制具有重要意義。N蛋白在IBV三種主要結(jié)構(gòu)蛋白中含量甚多，具有很強(qiáng)的抗原性，因而該蛋白在IB的預(yù)防和控制中起關(guān)鍵作用。

4.小囊膜蛋白（E）。E蛋白分子量約為12.4KD，其與M蛋白協(xié)同作用，形成病毒樣顆粒（VLP），后者在IBV的黏膜免疫中發(fā)揮功能。在病毒的復(fù)制過程中，E蛋白參與VLP形成和病毒出芽，近來又發(fā)現(xiàn)E蛋白在IBV感染后期的細(xì)胞中非常豐富，推測該蛋白與細(xì)胞凋亡有關(guān)。

三、基因變異

IBV的變異有基因的點(diǎn)突變、基因的缺失、基因的替代、基因的插入和基因的重組，其中基因的突變和重組是IBV不斷出現(xiàn)新的血清型和變異株的主要原因。IBV的遺傳物質(zhì)RNA不穩(wěn)定較易降解；IB RNA病毒的復(fù)制缺乏像DNA病毒復(fù)制過程中DNA聚合酶那樣的校對功能；IBV基因組較長，每個復(fù)制循環(huán)大約可以產(chǎn)生3個突變，突變的隨機(jī)性使IBV分子不能維持均一性，這些使IBV具有高變異的特點(diǎn)。IBV的抗原變異部位主要在S蛋白上。有研究表明，S蛋白在50～170位AA和250～310位A A 處易發(fā)生堿基的替代，在120～170AA處易發(fā)生堿基的插入或缺失。Gavanagh研究表明，S1蛋白易在37～140位AA和269～365位AA處發(fā)生變異。Sapals研究表明，S蛋白易在59～313位AA處發(fā)生堿基的變異。簡而言之，大部分IBV血清型抗原決定簇在S1 N端的前300個AA殘基內(nèi)。

IBV不斷產(chǎn)生新的變異株的原因除了S1基因的突變外，還有野毒株之間、疫苗之間、野毒株和疫苗之間的基因重組。Kusler研究表明，日本KB8523分離株是由M41和D1466重組獲得，英國6/82分離株是由D207和D1466重組獲得。

四、分子生物學(xué)診斷技術(shù)的研究

用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RTP C R）和限制性片段長度多態(tài)性（RFLP）方法鑒別診斷IBV毒株的方法已有報道，該方法是用PCR擴(kuò)增編碼IBV抗原決定簇的基因，用限制性內(nèi)切酶消化產(chǎn)物、電泳，最后根據(jù)酶切圖對病毒進(jìn)行分型。該分類方法新穎、重復(fù)性好，且對病毒從分子水平上進(jìn)行了分析，但電泳圖較復(fù)雜，難以分析，實際應(yīng)用局限性較大。Kwon研究提取了S1基因，RT-PCR和RFLP的結(jié)果與中和試驗的結(jié)果基本一致。

單克隆抗體檢測技術(shù)（McAb）是IBV研究的一樣新的技術(shù)。它檢測表面抗原決定簇。該方法具有針對單個抗原決定簇的高效特異性、敏感性，通過與基因定序、基因重組等技術(shù)的結(jié)合，可將保護(hù)性抗原定位到基因的水平。

核酸探針技術(shù)是利用特異性核酸探針與PCR擴(kuò)增的待檢病毒樣本片段雜交。如果兩者結(jié)合，X底片就會顯影；反之不顯影。該方法敏感、特異、快速。Kwon應(yīng)用PCR和生物素標(biāo)記的DNA探針檢測了接種IBV的無特定病原（SPF）雞氣管中的IBV基因組，證實此法比電鏡（EM）觀察病毒法要靈敏。Jackwood用該技術(shù)檢出了最小IBV cDNA量為125納克。地高辛標(biāo)記IBV pol基因的保守片段制成核酸探針的實驗結(jié)果表明，用此法檢測到的RT-PCR產(chǎn)物，特異性和敏感性強(qiáng)，可重復(fù)，能克服RT-PCR非特異性反應(yīng)和探針Northen 雜交的不穩(wěn)定性。Brown用P32標(biāo)記IBV cDNA檢測病毒的RNA，結(jié)合斑點(diǎn)雜交和放射性自顯影檢測到了血清中和抗體試驗所不能檢測到的病毒抗原。利用核酸探針的特異性，用IBV蛋白基因設(shè)計引物，檢測結(jié)果穩(wěn)定性好，重復(fù)性好，且不需要特殊的設(shè)備。核酸探針技術(shù)適宜基層對IBV的診斷和流行病學(xué)的調(diào)查。

寡聚核苷酸序列圖譜分析主要用于IBV流行病學(xué)的調(diào)查。Kusters等人從純化的IBV中提取核酸，T1酶消化后用P32標(biāo)記進(jìn)行雙向電泳，自顯影后根據(jù)圖譜上相應(yīng)斑點(diǎn)的有無進(jìn)行分析。該方法重復(fù)性和敏感性好，但要求基因序列的同源率大于95%。實際應(yīng)用中，一般把寡聚核苷酸序列圖譜分析方法和其他方法相結(jié)合進(jìn)行IBV的診斷。

五、小結(jié)

文章從雞傳染性支氣管炎病毒病原學(xué)、基因組結(jié)構(gòu)、基因變異、分子生物學(xué)診斷等方面進(jìn)行了對比分析，以文獻(xiàn)綜述的形式介紹了近年來雞傳染性支氣管炎病毒分子生物學(xué)研究狀況。IBV的分子生物學(xué)研究雖然取得了很大的進(jìn)展，但對該病毒蛋白的結(jié)構(gòu)與功能、病毒基因變異與重組機(jī)理、疫苗的研制等方面尚不十分清楚，有待人們進(jìn)一步研究。相信隨著IBV分子生物學(xué)的深入研究和基因工程疫苗的不斷改進(jìn)，這些問題將被一一解答。