豬肝中克倫特羅的測(cè)定─反相高效液相色譜法

陳肇臻，劉小剛

（龍巖市產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)所，福建 龍巖 364000）

1 引言

鹽酸克倫特羅（Clenbuterol）俗稱“瘦肉精”,為人工合成的腎上腺素β-受體激動(dòng)劑,是一種同化激素。它的化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，能促進(jìn)體內(nèi)脂肪分解代謝、增加蛋白質(zhì)合成，促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)并顯著提高家畜瘦肉率，在動(dòng)物的肝、腎、肺組織中顯著蓄積。20世紀(jì)90年代它曾作為科研成果以飼料添加劑引入市場(chǎng)并加以推廣，但其強(qiáng)而持久的松弛支氣管平滑肌及對(duì)心臟有興奮的作用，能引起心率過速失常，骨骼肌肉震顫，代謝紊亂。人食用了飼喂克倫特羅作為添加劑的動(dòng)物所產(chǎn)生的畜產(chǎn)品后，殘留的克倫特羅可導(dǎo)致人體肌肉震顫、心悸、神經(jīng)過敏、頭痛、目眩、惡心、嘔吐、發(fā)燒、戰(zhàn)栗等癥狀，對(duì)心臟病、高血壓、甲亢、前列腺肥大、青光眼等患者危害更大，食用高殘留（大于0.1mg·kg-1）的內(nèi)臟組織或累計(jì)攝入量超過一定值（體重60kg，最大可攝入0.24μg）即可引發(fā)食物中毒。1997年我國(guó)明令禁止在畜牧行業(yè)生產(chǎn)、銷售和使用鹽酸克倫特羅，但國(guó)內(nèi)仍有一些畜牧養(yǎng)殖企業(yè)暗中地在非法使用克倫特羅來增加動(dòng)物的瘦肉率從而引發(fā)一連串的食物中毒事件。目前，鹽酸克倫特羅的檢測(cè)方法[1]有很多種,常用的有HPLC法[2-7]、GCMS法[8]、LC-MS法[9]及酶聯(lián)免疫法[10]，文中是在GB/T5009.192-2003[11]基礎(chǔ)上改進(jìn)色譜分離體系，實(shí)現(xiàn)高選擇性、無干擾、定性定量檢測(cè)鹽酸克倫特羅。

2 材料與方法

2.1 試劑

鹽酸克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（Dr.Ehrenstorfer GmbH，純度98.5%）；甲醇；乙腈：色譜級(jí)；乙酸乙酯：AR；氨化甲醇：5%；碳酸鈉溶液：10%；鹽酸溶液：磷酸二氫鉀：GR；

2.2 主要儀器

Waters e2695高效液相色譜儀（2998二極管陣列檢測(cè)器）；Shisedo SCX分析柱；梅特勒-托利多XS205分析天平、萊馳GM200搗磨機(jī)；Beforce BF25勻漿機(jī)；VORTEX-5旋渦混合器；湘儀TGL-20M高速冷凍離心機(jī)；HH6水浴鍋、Organomation氮吹濃縮儀；Supelco 固相萃取裝置（CNWBOND SCX 苯磺酸SPE柱，500mg/6ml）；SK5200H超聲波清器。

2.3 色譜條件

檢測(cè)器：二極管陣列檢測(cè)器，波長(zhǎng)210nm； 色 譜 柱：Shisedo Capcell PAK SCX UG80 150mm×4.6mm，柱溫35℃；流動(dòng)相：乙腈：磷酸二氫鉀（0.05mol·L-1，磷酸調(diào)pH=3.0）=30:70；流速：1.0ml/min；進(jìn)樣量：10μl。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

鹽酸克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液：精確稱取一定質(zhì)量的鹽酸克倫特羅于容量瓶中，甲醇定容。封口膜-18℃保存。

克倫特羅工作標(biāo)準(zhǔn)使用液系列：鹽酸克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液逐級(jí)用甲醇稀釋成含185.6ng·ml-1、464.0ng·ml-1、928.0ng·ml-1、1392ng·ml-1、1856ng·ml-1、2320ng·ml-1、4640ng·ml-1、9280ng·ml-1、23.2μg·ml-1和46.4μg·ml-1克倫特羅于容量瓶備用。

2.5 樣品的前處理方法

鮮豬肝剔除筋膜，搗磨機(jī)攪成糜狀樣品密封備用。稱取5g樣品于50ml離心管中，10ml10%碳酸鈉溶液，漩渦混合2min，80℃水浴60min，冷卻后加15ml乙酸乙酯，勻漿2min，8000rpm冷凍離心5min，上清液移至另一離心管中，用15ml乙酸乙酯重復(fù)提取殘?jiān)淮危喜⑻崛∫?。向乙酸乙酯提取液加?ml0.1mol·L-1鹽酸溶液漩渦混合2min，8000rpm冷凍離心3min，移取下層水相，用5ml0.1mol·L-1鹽酸溶液重復(fù)提取一次，合并水相混勻后pH調(diào)至5.0待凈化。

試樣加標(biāo)提?。悍Q取5g樣品于50ml離心管中，10ml10%碳酸鈉溶液，加克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)使用液，后同上處理；

活化：依次向強(qiáng)陽離子SPE柱（500mg/6ml）加入5ml甲醇，5ml水，5ml30mmol·L-1鹽酸溶液，每步驟見流出液關(guān)閉SPE活塞10min活化平衡SPE柱，SPE柱下篩板至SPE柱活塞間不得存在氣泡，棄去流出液。

上樣：SPE上篩板剩少許30mmol·L-1鹽酸溶液時(shí)將上述水相反萃取液上柱，流速控制在每4秒1滴，棄去流出液。

淋洗：依次用5ml水，5ml甲醇淋洗，棄去流出液并抽干SPE柱。

洗脫：用6ml氨化甲醇洗脫，流速控制在每4秒1滴并抽干SPE柱，收集洗脫液于2ml定量濃縮管中，45℃氮吹近干，自然揮干。

測(cè)試液：甲醇定容2ml，漩渦混合1min，超聲1min，過0.45μm尼龍針式濾器備用。

3 結(jié)果與討論

3.1 色譜條件的選擇

3.1.1 溶劑

鹽酸克倫特羅為堿性藥物（pKa≈9.6），在堿性條件下以分子形式存在，易溶于乙酸乙酯。該方法中用10ml10%碳酸鈉溶液堿化基質(zhì)，80℃水浴沉淀蛋白，再用乙酸乙酯將鹽酸克倫特羅萃取出來，用5ml0.1mol·L-1鹽酸溶液酸化乙酸乙酯提取液，鹽酸克倫特羅轉(zhuǎn)化為離子態(tài)，更易被反萃取至水相溶液中,水相pH值調(diào)至5.0。

3.1.2 SPE柱保留及洗脫速度

SPE柱上樣時(shí)：試樣中分子態(tài)克倫特羅結(jié)構(gòu)式中的NH經(jīng)鹽酸酸化鍵合成NH2呈帶正電荷的離子態(tài)與SCX苯磺酸吸附劑帶負(fù)電荷SO3之間是通過離子作用力在弱酸性、不存在高選擇性的反離子及低離子強(qiáng)度的溶劑體系中相互吸引實(shí)現(xiàn)保留，流速太快導(dǎo)致保留不住，流速控制在每4秒一滴。同樣，洗脫時(shí)流速太快將導(dǎo)致解析不完全，流速也控制在每4秒一滴。

3.1.3 緩沖液

理想的緩沖液的pH值和離子強(qiáng)度應(yīng)使克倫特羅與SCX陽離子分析柱快速結(jié)合，而雜質(zhì)不與交換柱結(jié)合，連續(xù)不斷的弱酸性陰離子洗脫液使克倫特羅從SCX分析柱上快速解離，該文選用磷酸二氫鉀作為陰離子緩沖液。

3.1.4 流動(dòng)相

乙腈-磷酸二氫鉀流動(dòng)相體系中，乙腈比率從30%提高到40%時(shí)，保留時(shí)間從24.03min縮短至15.10min（見圖4），峰高及半峰寬均好于后者，但峰面積響應(yīng)不變；緩沖鹽比率提高到80%時(shí)半峰寬、出峰時(shí)間明顯展寬、延后。緩沖鹽pH值為5時(shí)克倫特羅離子化正電荷速度較pH3.0時(shí)慢，與SCX苯磺酸吸附劑帶負(fù)電荷SO3相互吸引實(shí)現(xiàn)保留變慢，進(jìn)而陰離子緩沖鹽洗脫速度變慢，出峰延后，基線波動(dòng)大；緩沖鹽pH為3.0時(shí)可降低克倫特羅與陽離子交換樹脂的靜電引力，出峰較pH5.0時(shí)縮短約2min且基線波動(dòng)小，峰高及半峰寬均好于后者但兩者峰面積響應(yīng)不變。甲醇-磷酸二氫鉀流動(dòng)相體系，同等色譜條件下出峰延后25min，響應(yīng)降低，峰明顯展寬，失去定性定量作用。

3.1.5 色譜分離系統(tǒng)

按2.5提取的加標(biāo)試樣提取液SCX陽離子分離 體 系 較 GB/T5009.192的 4.6mm×250mm 5μm C18分離體系（流動(dòng)相：甲醇+水，流速1.0ml/min，柱溫35℃）保留時(shí)間長(zhǎng)，無溶劑峰及其他雜峰干擾，定性定量具有非常明顯優(yōu)勢(shì)，檢出限及定量限均優(yōu)于GB/T5009.192的C18分離體系?？藗愄亓_極性較弱，極易被洗脫，保留時(shí)間短，GB/T5009.192的C18分離體系無論如何優(yōu)化色譜條件，溶劑峰及其他雜峰干擾嚴(yán)重，基本失去定性定量意義。

3.1.6 檢測(cè)波長(zhǎng)

克倫特羅在210nm、244nm及298nm處有三個(gè)特征吸收峰（見圖5、圖6），210nm處峰高響應(yīng)為244nm的4倍，噪聲未見同步放大，該方法采用陽離子交換，干擾明顯低于C18分離系統(tǒng)，故采用210nm檢測(cè)波長(zhǎng)定量予獲得較高的響應(yīng)。

3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖1 克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)溶液的工作曲線圖

從圖2中可以看出，克倫特羅保留時(shí)間23.7min左右，基線得到很好的分離。圖1以濃度為Y軸，峰面積為X軸建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線 回 歸 方 程 ρ(μg·ml-1)=-0.02450+2.0046×10-6S,相關(guān)系數(shù)r=0.99995, 線性范圍185.6ng·ml-1 ～ 46.4μg·ml-1，儀器實(shí)際檢出限 0.15μg·ml-1，定量限2.0μg·kg-1（10倍噪聲計(jì)）。

圖2 克倫特羅標(biāo)樣重疊色譜圖

3.3 實(shí)際樣品測(cè)定及加標(biāo)回收率、重復(fù)性

在樣品中加入濃度為2320ng·ml-1標(biāo)準(zhǔn)溶液1.0ml、2.0ml、5.0ml按2.5提取的加標(biāo)試樣提取液，樣品加標(biāo)回收率92.4～95.2%。

圖3 鮮豬肝加標(biāo)色譜圖

圖4 克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖（乙腈:磷酸二氫鉀=40:60）

圖5 鮮豬肝加標(biāo)吸收光譜圖

圖6 克倫特羅標(biāo)樣吸收光譜圖

表1 回收試驗(yàn)

標(biāo)品按2.3色譜條件連續(xù)6次進(jìn)樣，保留時(shí)間RSD6為0.06%，峰面積RSD6為0.76%。

稱取樣品6個(gè)加標(biāo)按2.5提取，2.3色譜條件依次進(jìn)樣，保留時(shí)間RSD6為0.18%，加標(biāo)樣品中克倫特羅含量RSD6為0.22%，回收率可穩(wěn)定在92.4～ 95.2%。

4 結(jié)論

該方法的靈敏度、準(zhǔn)確性、精密度、重復(fù)性完全可滿足檢測(cè)要求且簡(jiǎn)便快速，避免了GCMS法衍生苛刻條件且衍生產(chǎn)物室溫下不穩(wěn)定，檢驗(yàn)成本低于GCMS、LCMSMS法。

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