一種質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的定值數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及不確定度評(píng)定

許 麗，梁 文，李 妍，任淑貞，丁 敏，劉 剛

（上海市計(jì)量測(cè)試技術(shù)研究院，上海 201203）

0 引 言

質(zhì)粒分子標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)是一種含有外源目的基因片段的重組分子[1]，具有制備成本低，易于富集，穩(wěn)定性好的優(yōu)點(diǎn)。由于微生物檢測(cè)領(lǐng)域部分陽性樣品難以獲得，帶有特異性目標(biāo)檢測(cè)基因的質(zhì)粒分子標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，成為解決病原微生物分子生物學(xué)檢測(cè)量值溯源問題的途徑之一，廣泛應(yīng)用于各種PCR檢測(cè)領(lǐng)域[2]。本文研制的阪崎腸桿菌檢測(cè)質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在PCR定性定量檢測(cè)中可以作為陽性對(duì)照或者定量標(biāo)準(zhǔn)，解決了相關(guān)分子生物學(xué)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室陽性樣品缺乏的難題。本文主要報(bào)道了該標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在定值過程中的數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和不確定評(píng)定過程。

根據(jù)JJF 1343——2012《標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值的通用原則及統(tǒng)計(jì)學(xué)原理》[3]的要求，我們選擇第三類定值方案：使用一種或多種已經(jīng)證明準(zhǔn)確性的方法，由多個(gè)實(shí)驗(yàn)室合作定值。具體的定值方法分為兩種：

1）紫外分光光度法（UV）。核酸分子含有嘌呤環(huán)和嘧啶環(huán)的共軛雙鍵，其紫外可見吸收光譜在260nm附近有一強(qiáng)的吸收峰。針對(duì)雙鏈DNA，樣品濃度和吸光值之間有以下關(guān)系：雙鏈DNA樣品濃度（ng/μL）=OD260×核酸稀釋倍數(shù)×50，其中 OD260為核酸在260nm處的吸光值[4]。

2）高分辨電感耦合等離子體質(zhì)譜（HR-ICP-MS）。由于DNA分子結(jié)構(gòu)可知，對(duì)于序列已知的DNA分子，DNA分子中磷元素的含量和DNA分子的數(shù)量有固定線性關(guān)系。在DNA中，每個(gè)堿基對(duì)應(yīng)一個(gè)磷原子，分子中磷元素含量（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）可由下式計(jì)算：磷元素含量（P%）=堿基數(shù)×磷的原子量÷DNA分子量。因此可以通過測(cè)定DNA樣品中的磷元素的含量換算出DNA的濃度，DNA濃度可由下式計(jì)算：DNA濃度=實(shí)驗(yàn)測(cè)定的磷元素含量÷DNA分子含磷量（P%）[5]。

在質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研制過程中，一共有9家實(shí)驗(yàn)室參與了合作定值，本文報(bào)道了數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)過程，并對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響因素進(jìn)行了分析，對(duì)測(cè)量結(jié)果的不確定度進(jìn)行了評(píng)定。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要定值檢測(cè)儀器與試劑

微量核酸蛋白定量儀（nanodrop ND-2000）；紫外分光光度計(jì)（Lambda950）；電感耦合等離子體發(fā)射質(zhì)譜儀（Thermo Fisher Element2）。

重鉻酸鉀溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（GBW（E）081609，標(biāo)準(zhǔn)值0.099 9 mol/L，相對(duì)不確定度為0.2%）；磷標(biāo)準(zhǔn)溶液（NIST，SRM3139a，10.016±0.033mg/L）等。

1.2 定值過程

一共有8家實(shí)驗(yàn)室使用UV法對(duì)質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行定值，其中有1家實(shí)驗(yàn)室采用HR-ICPMS法。每家實(shí)驗(yàn)室分別對(duì)質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，平行測(cè)定8次，進(jìn)行定值分析。

1.2.1 UV測(cè)定質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)

實(shí)驗(yàn)步驟：1）用TE緩沖液作為空白溶液，使紫外分光光度計(jì)校正為零點(diǎn)；2）取適量DNA（根據(jù)儀器的需要）進(jìn)行檢測(cè)，記錄儀器讀數(shù)，濃度單位為ng/μL；3）每個(gè)樣品檢測(cè)8次，記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.2.2 HR-ICP-MS測(cè)定質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)

在采用元素分析法對(duì)DNA定量之前，首先要確定質(zhì)粒DNA具有足夠的純度，繼而需要根據(jù)質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的堿基組成和序列長度，計(jì)算其中磷元素的含量，這樣就能估算適合的稀釋倍數(shù)。在本實(shí)驗(yàn)中，我們最終將實(shí)驗(yàn)室研制的質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)稀釋2000倍，從而落在HR-ICP-MS最優(yōu)的P元素檢測(cè)范圍[6-7]。 以磷標(biāo)準(zhǔn)溶液（NIST，SRM3139a）制備1～5 ng/mL范圍標(biāo)準(zhǔn)曲線，對(duì)質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行定量檢測(cè)。經(jīng)過一系列的研究和優(yōu)化，最終確定HR-ICP-MS主要技術(shù)參數(shù)：冷卻氣流量16.86L/min，霧化氣流量為1.123L/min，輔助氣流量為0.99L/min，功率1350W。每個(gè)樣品檢測(cè)8次，并記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.3 定值數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

在得到測(cè)定結(jié)果后，根據(jù)統(tǒng)計(jì)方法要求[3，8]對(duì)測(cè)定結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。通過統(tǒng)計(jì)學(xué)評(píng)估的數(shù)據(jù)如表1所示。

表1 質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)pXL06定值結(jié)果1）

2 不確定度的評(píng)定

質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的定值過程帶來的不確定度uchar包括數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)引入的不確定度uchar1和通過對(duì)定值方法中測(cè)量影響因素進(jìn)行分析評(píng)定的不確定度uchar2。

2.1 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)引入的不確定度uchar1

質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)由數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)引入的不確定度即是使用兩種方法，由9家實(shí)驗(yàn)室合作定值數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)引入的不確定度。由于確認(rèn)的特性值恰好是各組平均值的平均值（即各組數(shù)據(jù)不存在平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差的不一致性），即如下式所示：

式中：——總平均值；

Yi——各組數(shù)據(jù)的平均值；

p——實(shí)驗(yàn)室數(shù)目。

那么，與平均值的平均值相關(guān)的合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度的基礎(chǔ)是標(biāo)準(zhǔn)偏差，可由下式獲得：

合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

相對(duì)不確定度為

2.2 定值方法中測(cè)量影響因素進(jìn)行分析評(píng)定的不確定度uchar2

2.2.1 UV方法測(cè)量影響因素引入的不確定度

用UV對(duì)質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行定值，檢測(cè)時(shí)儀器利用液體的表面張力特性控制樣品池中的樣品量，因此測(cè)量影響因素引入的不確定度即為儀器本身引入的不確定度。

本文用重鉻酸鉀溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（GBW（E）081609）考察了紫外分光光度計(jì)在257 nm處吸光值的準(zhǔn)確性，其中相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.02%，即該相對(duì)不確定度為 0.02%（見表 2）。

表2 吸光值準(zhǔn)確性考察

2.2.2 HR-ICP-MS方法測(cè)量影響因素引入的不確定度

1）數(shù)學(xué)模型的建立

充分考慮樣品檢測(cè)過程中的各種影響因素，建立不確定評(píng)估模型如下：

式中：c——質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)濃度；

cs——由標(biāo)準(zhǔn)曲線求得樣品液中P含量；

Vs——檢測(cè)時(shí)樣品最終體積；

V——吸取質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)原液體積；

9.6%——質(zhì)粒DNA分子中P元素含量（由堿基數(shù)×磷的原子量÷DNA分子量計(jì)算得出）。

其中質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)濃度標(biāo)準(zhǔn)不確定度用uc（c）表示，由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算的樣品液中P含量標(biāo)準(zhǔn)不確定度用uc（cs）表示，樣品溶液制備體積不確定度用uc（Vs）表示，吸取質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)原液時(shí)引入的不確定度用uc（V）表示。由此得到的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度傳播率為

2）cs不確定度的計(jì)算

cs的不確定度由兩部分組成：當(dāng)由5種P標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度（1，2，3，4，5 ng/mL）與 P 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)產(chǎn)生的信號(hào)強(qiáng)度擬合的直線求得cs時(shí)測(cè)量所產(chǎn)生的不確定度；由標(biāo)準(zhǔn)貯備液配制成5種質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液時(shí)所產(chǎn)生的對(duì)cs測(cè)量所產(chǎn)生的不確定度。

①由擬合曲線求得cs時(shí)所產(chǎn)生的不確定度uc，1（cs）

用HR-ICP-MS測(cè)定質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中的P含量，利用 P標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（NIST，SRM3139a）配制 5種標(biāo)準(zhǔn) 溶 液 ，P 質(zhì) 量 濃 度 分 別 為 1，2，3，4，5 ng/mL，用HR-ICP-MS對(duì)上述5種P標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見表3。

表3 各質(zhì)量濃度下P標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)質(zhì)譜信號(hào)豐度測(cè)量值

根據(jù)測(cè)定結(jié)果建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，經(jīng)過線性擬合得出：

式中：A——質(zhì)譜信號(hào)豐度；

cm——溶液中P元素的含量。

對(duì)cs進(jìn)行8次測(cè)量，通過曲線方程求得cs=3.57ng/mL，則cs的標(biāo)準(zhǔn)不確定度[9-10]為

式中B1=3514.8；

P=8（對(duì)cs進(jìn)行 8 次測(cè)量），n=5（共 5 次測(cè)量）；

將上述各值代入式（8）得到：

②配制P標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的不確定度uc（c5）

以5ng/mL標(biāo)準(zhǔn)工作溶液為例闡述不確定度的大小，其配制步驟為：用最大量程為1 mL的移液器移取 1mL P 標(biāo)準(zhǔn)溶液（10.016±0.33）mg/L，定容至10 mL，配成1 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液，稀釋因子為f1=10；用上述1mL的移液器移取1mg/L P標(biāo)準(zhǔn)溶液1mL，定容至10mL，配成0.1mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液，稀釋因子為f2=10；用上述1mL的移液器移取0.1mg/L P標(biāo)準(zhǔn)溶液1 mL，定容至10 mL，配成0.01 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液，稀釋因子f3=10；用最大量程為5mL移液器移取0.01mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液5mL，定容至10mL，配成5ng/mL標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，稀釋因子f4=2，則：

所以：

（B）1mL移液器移取1mL時(shí)引入的不確定度uc（V1）

（C）10mL 容量瓶引入的不確定度 uc（V10）

（D）最大量程為5 mL的移液器移取5 mL時(shí)引入的不確定度 uc（V5）

所以：

將上述值代入式（9），則：

則質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)cs的相對(duì)不確定度合成為

3）樣品溶液制備體積 Vs的不確定度 uc（Vs）

樣品溶液制備過程如下：取5μL質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)原液，定容至10mL，則稀釋倍數(shù)為2000倍。

①由10 μL移液器移取5 μL時(shí)產(chǎn)生的不確定度 uc（V0.005）

（B）移液器和溶液的溫度與校正時(shí)溫度不同引起的不確定度 uc，2（V1）：實(shí)驗(yàn)室溫度控制在（20±3）℃（置信水平為95%），水的體積膨脹系數(shù)為2.1×10-4/℃，因此產(chǎn)生的體積變化為±3×5×2.1×10-4=±0.0032μL，按照均勻分布轉(zhuǎn)化：

則：

②10mL容量瓶引入的不確定度uc（V10）

所以，樣品溶液體積Vs引入的相對(duì)不確定度合成為

4）吸取質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)原液時(shí)引入的不確定度uc（V）

吸取質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)原液時(shí)引入的不確定度：

因此將式（10）、式（11）、式（12）代入式（6），得到HR-ICP-MS檢測(cè)質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.2.3 兩種方法測(cè)量過程影響因素引入的合成相對(duì)不確定度

將紫外方法和HR-ICP-MS方法測(cè)量過程影響因素引入的相對(duì)不確定度進(jìn)行合成：

2.3 質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的定值過程引入的不確定度uchar總結(jié)

最終，將定值過程引入的相對(duì)不確定度合成：

合成不確定度 uchar=75.1×1.4%=1.05ng/μL。 取包含因子 k=2，則擴(kuò)展不確定度 U=2×1.05=2.1 ng/μL，相對(duì)擴(kuò)展不確定度為2.8%（k=2）。因此，測(cè)得的質(zhì)粒DNA 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的濃度表示為：（75.1±2.1）ng/μL（k=2）。

表4 各相對(duì)不確定度分量計(jì)算結(jié)果

3 結(jié)束語

本文應(yīng)用UV和HR-ICP-MS兩種方法，對(duì)質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行定值，為了得到更準(zhǔn)確的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，并且結(jié)果可以溯源至國際單位。本文以一種質(zhì)粒DNA為例，綜合考慮了實(shí)驗(yàn)過程中影響結(jié)果的各種因素，探討了此類定值方法過程中的不確定來源，最終對(duì)不確定度的評(píng)定方法和步驟進(jìn)行了分析。

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