溶劑體系下Lipozyme RM IM催化卵磷脂乙醇解及其他醇對乙醇解的影響*

馬嬌娜，楊國龍，楊若茜，畢艷蘭，孫尚德

(河南工業(yè)大學(xué) 糧油食品學(xué)院，河南 鄭 州，450001)

溶血磷脂與天然磷脂相比不僅保留了磷脂的親水和親油基團(tuán)，還能減少非極性基團(tuán)而明顯增加其親水性能、改善了磷脂因HLB值偏低而導(dǎo)致的應(yīng)用范圍受限的情況，更適合用作O/W型乳化劑，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、化妝品、飼料加工等領(lǐng)域［1-3］。

脂肪酶催化大豆卵磷脂改性制備溶血卵磷脂的方法包括水解法和醇解法。其中，脂肪酶水解卵磷脂會產(chǎn)生過多的脂肪酸，且不利于酶和產(chǎn)品的回收。國內(nèi)對脂肪酶醇解的應(yīng)用一般集中于油脂醇解制備生物柴油，而對催化磷脂醇解方面的報(bào)道較少，因此有必要對其做深入研究。另有報(bào)道表明，脂肪酶在不同醇中的反應(yīng)活性不同，且不同醇的組合會對酯交換反應(yīng)產(chǎn)生不同作用［4］。因此，本研究選用脂肪酶(Lipozyme RM IM)催化卵磷脂乙醇解，并研究其他醇對卵磷脂乙醇解反應(yīng)的影響。

1 材料與方法

1.1 主要材料與儀器

大豆卵磷脂(PC)，沈陽天峰生物工程技術(shù)有限公司;Lipozyme RM IM，諾維信公司贈送;十七酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)樣品，購自Sigma公司;三氯甲烷、甲醇及甲酯化用正己烷，色譜純;溶劑用正己烷、無水乙醇、正丁醇、叔丁醇、1，2-丙二醇、丙三醇等試劑均為分析純，使用前經(jīng)分子篩脫水處理。

MK-6S棒狀薄層色譜分析儀，日本三菱公司;Agilent 6890N型氣相色譜儀，美國 Agilent公司;BSA224S電子天平，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司(Max 220 g，d=0．1 mg);DF-101Z 集熱式恒溫加熱磁力攪拌器，鞏義市京華儀器有限責(zé)任公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1．2．1 卵磷脂的脂肪酸組成分析

卵磷脂的甲酯化方法采用三氟化硼甲酯化法［5］。氣相色譜檢測條件為:Agilent 6890N型氣相色譜儀;氫火焰離子化檢測器(FID);毛細(xì)管柱，BPX-70(30．0 m × 250 μm × 0．25 μm，澳大利亞 SGE 公司);進(jìn)樣口溫度，210℃;柱溫，180℃;檢測器溫度，300℃。

卵磷脂的相對分子質(zhì)量計(jì)算公式:

式中:MPC，卵磷脂的分子質(zhì)量;MFA，脂肪酸的平均分子質(zhì)量;M甘油，甘油的分子質(zhì)量;M磷酸，磷酸的分子質(zhì)量;M膽堿，膽堿的分子質(zhì)量;MH2O，水的分子質(zhì)量;Mi，脂肪酸的分子質(zhì)量;ni，脂肪酸的摩爾百分含量。

1．2．2 Lipozyme RM IM催化卵磷脂醇解制備溶血卵磷脂

稱取一定量卵磷脂溶于正己烷中，根據(jù)卵磷脂與醇中羥基的摩爾比加入一定量乙醇，再向體系中加入微量水，恒溫下攪拌20 min后，加入適量脂肪酶，醇解反應(yīng)開始，定時(shí)取樣進(jìn)行檢測分析?？疾旆磻?yīng)溫度、加酶量(以 PC質(zhì)量計(jì))、溶劑比(PC∶正己烷，g∶mL)、底物比(PC∶醇中羥基，mol∶mol)、加水量(PC∶水，g∶uL)對LPC轉(zhuǎn)化率的影響，確定PC乙醇解的適宜條件，進(jìn)一步研究X醇(正丁醇、叔丁醇、1，2-丙二醇和丙三醇)對乙醇解的影響。

1．2．3 原料卵磷脂及其醇解產(chǎn)物的組成分析

采用棒狀薄層色譜/氫火焰離子化檢測器(TLC/FID)分析原料卵磷脂及其醇解產(chǎn)物中卵磷脂(PC)、溶血卵磷脂(LPC)、甘油磷脂酰膽堿(GPC)及其他物質(zhì)的相對含量。將卵磷脂及其醇解產(chǎn)物溶解于三氯甲烷中，配制成濃度為10～20 mg/mL的溶液，取1 μL溶液點(diǎn)于薄層色譜棒上，在溶劑體系下展開后在90℃紅外烘箱中干燥5 min，然后進(jìn)行檢測分析。展開液:V(CHCl3)∶V(CH3OH)∶V(H2O)=42∶22∶2．5。檢測條件:氫氣流速，100 mL/min;空氣流速，1．5 L/min;掃描速度，30 s/棒。

2 結(jié)果與討論

2.1 原料大豆卵磷脂

利用TLC/FID對大豆卵磷脂PC含量進(jìn)行檢測，結(jié)果如圖1所示。圖1中卵磷脂峰面積明顯大于其他物質(zhì)的峰面積，原料中PC含量為97．2%，純度較高，符合實(shí)驗(yàn)要求。

圖1 大豆卵磷脂TLC/FID圖譜Fig．1 TLC/FID chromatograph of soy phosphatidylcholine

大豆卵磷脂經(jīng)三氟化硼甲酯化后，其脂肪酸組成利用氣相色譜進(jìn)行檢測，結(jié)果見表1。由公式1和公式2計(jì)算可知，大豆卵磷脂中脂肪酸的平均分子量為277．5，卵磷脂分子量為 794．0。

表1 大豆卵磷脂主要脂肪酸組成Table 1 Major fatty acid composition of soy phosphatidylcholine

2.2 溶劑體系中Lipozyme RM IM催化卵磷脂乙醇解

以有機(jī)溶劑為介質(zhì)進(jìn)行酶催化反應(yīng)具有如下優(yōu)點(diǎn):提高脂溶性底物的溶解度;易于酶的回收和再利用;易于產(chǎn)物的分離純化;酶在有機(jī)溶劑中的熱穩(wěn)定性比水中高［6］。有機(jī)溶劑中酶的穩(wěn)定性增強(qiáng)是因?yàn)榉撬w系中沒有充足的導(dǎo)致某些酶失活的水分子［7］。極性強(qiáng)的有機(jī)溶劑可能因奪取酶維持其構(gòu)象的必需水而對酶的催化活力不利［8］。本實(shí)驗(yàn)選擇非極性的正己烷作為溶劑，研究該體系下醇的相互作用對Lipozyme RM IM催化卵磷脂乙醇解的影響。

2．2．1 溫度對乙醇解反應(yīng)的影響

溫度是影響酶催化活性和反應(yīng)速率的重要因素(如圖2所示)。

圖2 溫度對反應(yīng)過程中LPC轉(zhuǎn)化率的影響Fig．2 Effect of temperature on LPC conversion during reaction

當(dāng)反應(yīng)溫度為40℃時(shí)，醇解反應(yīng)速率明顯高于30℃，LPC轉(zhuǎn)化率達(dá)到平衡時(shí)所用時(shí)間較短，反應(yīng)16 h后LPC轉(zhuǎn)化率即可達(dá)93%。這是由于反應(yīng)溫度較低時(shí)，酶活力較低，隨著反應(yīng)溫度的升高，酶活力逐漸增強(qiáng)直到最佳催化活力，同時(shí)反應(yīng)體系粘度降低，傳質(zhì)阻力減小，促進(jìn)了醇解反應(yīng)的進(jìn)行。但過高的反應(yīng)溫度則會使酶變性失活。此結(jié)果與Demirkol等［9］及Elizabeth［10］研究一致，Lipozyme RM IM 等脂肪酶在30～50℃活性較高。本反應(yīng)中溫度為50℃時(shí)，隨著反應(yīng)體系擴(kuò)散系數(shù)的提高，初期反應(yīng)速率較高，但反應(yīng)10 h后LPC轉(zhuǎn)化率驟降。結(jié)合圖3可知，溫度過高不僅會影響酶的催化活性，還會導(dǎo)致副產(chǎn)物的生成。隨著反應(yīng)的進(jìn)行，LPC發(fā)生醇解反應(yīng)，GPC含量急劇升高，最終導(dǎo)致LPC轉(zhuǎn)化率的顯著降低。從增大產(chǎn)物得率和縮短反應(yīng)時(shí)間考慮，以40℃為最佳反應(yīng)溫度。王渝鷺等［11］研究了無溶劑體系中Lipozyme RM IM催化卵磷脂制備溶血卵磷脂，確定了乙醇解的最適溫度為30℃，溶劑體系下最適溫度40℃與其相比有所升高，這是因?yàn)槊冈谟袡C(jī)溶劑中的熱穩(wěn)定性增強(qiáng)，且無溶劑體系中短碳鏈醇對酶的毒害作用較大［12］。

圖3 溫度對反應(yīng)過程中GPC含量的影響Fig．3 Effect of temperature on GPC content during reaction

2．2．2 加水量對乙醇解反應(yīng)的影響

有機(jī)溶劑中，微量水是維持酶活性所必需的因素［13］。圖4 為加水量(PC:水，g∶μL)對 PC 乙醇解的影響。

圖4 加水量對反應(yīng)過程中LPC轉(zhuǎn)化率的影響Fig．4 Effect of water amount on LPC conversion during reaction

加水量為1∶80 g∶μL時(shí)，醇解反應(yīng)速率和 LPC轉(zhuǎn)化率都高于1∶60 g∶μL，說明加水量過低時(shí)，酶無法有效發(fā)揮其催化活力。由于水分影響酶蛋白的結(jié)構(gòu)完整性、活性位點(diǎn)的極性與穩(wěn)定性，加入適量水可維持酶的三維構(gòu)象結(jié)構(gòu)使其處于最佳催化活性狀態(tài)［14］。但過量的水則會抑制酶的活性，甚至促進(jìn)副反應(yīng)的發(fā)生［15］。當(dāng)加水量為 1∶100(g∶μL)時(shí)，反應(yīng)速率和產(chǎn)品最終得率都明顯低于其他2個(gè)考察水平，是因?yàn)樗痔砑恿窟^大，水分子在酶活性位點(diǎn)之間形成水束，產(chǎn)生的介電屏蔽作用掩蓋了活性位點(diǎn)的極性，進(jìn)而降低了酶的催化活性［14］。Selmi等［16］發(fā)現(xiàn)當(dāng)酶中含水量足夠多時(shí)，加水后效果反而不好。

2．2．3 加酶量對乙醇解反應(yīng)的影響

如圖5所示，加酶量為10%時(shí)，反應(yīng)24 h尚未達(dá)到平衡且LPC轉(zhuǎn)化率僅為82%，而加酶量為15%和20%時(shí)，反應(yīng)皆于16 h達(dá)到平衡，LPC轉(zhuǎn)化率分別為92%、95%。酶促反應(yīng)主要是酶的活性基團(tuán)與底物作用的結(jié)果，隨著加酶量的增加，活性基團(tuán)增加，酶與底物的接觸機(jī)率增大，從而使得反應(yīng)速率得到提高。Bernardes等［17］研究Lipozyme RM IM催化大豆油醇解制生物柴油時(shí)發(fā)現(xiàn)當(dāng)加酶量為20%時(shí)酯產(chǎn)量明顯高于7%時(shí)的產(chǎn)量。本實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了Oliveira等［18］的報(bào)道，加酶對酯生產(chǎn)有積極作用。使用較多加酶量有助于避免酯交換量過低，因酶隨時(shí)間的延長而逐漸失活［19］。加酶量繼續(xù)增加，在一定面積的反應(yīng)界面上，酶濃度最終達(dá)到飽和，反應(yīng)趨于平衡［20］。加酶量15%和20%對催化醇解反應(yīng)的結(jié)果差別不大，從節(jié)約成本方面考慮，選擇15%為最適加酶量。

圖5 加酶量對反應(yīng)過程中LPC轉(zhuǎn)化率的影響Fig．5 Effect of enzyme load on LPC conversion during reaction

2．2．4 底物比對乙醇解反應(yīng)的影響

底物比影響醇解反應(yīng)速率并決定反應(yīng)的平衡點(diǎn)。當(dāng)?shù)孜锉葹?∶2(mol∶mol)時(shí)，反應(yīng)速率和LPC轉(zhuǎn)化率較1∶3(mol∶mol)時(shí)都明顯低(圖 6)，這是由于較低底物比條件下乙醇的濃度較低，與卵磷脂碰撞機(jī)率小，底物結(jié)合少導(dǎo)致反應(yīng)速率低。隨著底物比的增大，卵磷脂與乙醇的結(jié)合機(jī)率增大，促進(jìn)醇解反應(yīng)的進(jìn)行。當(dāng)?shù)孜锉葹?∶4(mol∶mol)時(shí)，反應(yīng)達(dá)到平衡的時(shí)間及產(chǎn)品得率較1∶3(mol∶mol)時(shí)無明顯差異，主要原因是底物摩爾比為1∶3(mol∶mol)時(shí)，底物達(dá)到飽和，酶分子都能有效的與底物相結(jié)合，進(jìn)一步增加底物比也很難提高產(chǎn)品中LPC的含量。另外，Ber-nardes等［17］研究大豆油醇解制生物柴油時(shí)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)醇/油摩爾比為10∶1時(shí)乙酯產(chǎn)量明顯比摩爾比為6∶1低，因?yàn)榈鞍踪|(zhì)在含有短碳鏈醇(如甲醇、乙醇)的反應(yīng)體系中不穩(wěn)定，溶劑體系下過量乙醇會促進(jìn)脂肪酶的抑制或失活。Hass等［21］研究脂肪酶催化大豆甘三脂和卵磷脂醇解合成脂肪酸乙酯時(shí)發(fā)現(xiàn)，對于兩種底物，酶活通常隨乙醇濃度的增加而降低。Oliveira等［22］也報(bào)道了過量乙醇對酶促反應(yīng)有抑制作用。

從縮短反應(yīng)時(shí)間和提高產(chǎn)品得率方面考慮，結(jié)合成本因素，1∶3(PC:醇中羥基，mol∶mol)為最適底物比。

圖6 底物比對反應(yīng)過程中LPC轉(zhuǎn)化率的影響Fig．6 Effect of substrate ratio on LPC conversion during reaction

2．2．5 溶劑比對乙醇解反應(yīng)的影響

溶劑比過低時(shí)，底物濃度較高，體系黏稠傳質(zhì)阻力增大，酶催化反應(yīng)受到底物抑制作用;溶劑比過高時(shí)，會降低底物與酶的碰撞機(jī)率，從而影響反應(yīng)速率。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)溶劑比對LPC轉(zhuǎn)化率的影響并不顯著，反應(yīng)趨勢基本一致(圖7)。

圖7 溶劑比對反應(yīng)過程中LPC轉(zhuǎn)化率的影響Fig．7 Effect of solvent ratio on LPC conversion during reaction

從節(jié)約生產(chǎn)成本考慮，溶劑比越低越好，但溶劑比過低會使溶液粘度過大，體系不會很好的混合，且妨礙取樣的準(zhǔn)確性［21］。綜上，選擇1∶2(PC∶正己烷，g∶mL)為最適溶劑比。與王渝鷺等［11］的研究結(jié)果相比，醇解反應(yīng)達(dá)到平衡所用的時(shí)間減少了一半，反應(yīng)速率大大提高，這與 Hass等［21］和 Shaw 等［23］報(bào)道一致，無溶劑體系中醇解反應(yīng)速率較正己烷中進(jìn)行較快。

2.3 其他醇對卵磷脂乙醇解的影響

通過單因素實(shí)驗(yàn)，確定了有機(jī)溶劑體系下脂肪酶Lipozyme RM IM催化大豆卵磷脂乙醇解制備溶血卵磷脂的適宜條件:溫度40℃，加酶量15%(以PC質(zhì)量計(jì))，溶劑比 1∶2(PC∶正己烷，g∶mL)，底物比 1∶3(PC∶醇中羥基，mol∶mol)，加水量 1∶80(PC∶水，g∶μL)。

在此基礎(chǔ)上，考察其他醇對卵磷脂乙醇解的影響。從醇的碳鏈長度、醇的級別出發(fā)，綜合考慮經(jīng)濟(jì)因素，選擇X醇為正丁醇、叔丁醇、1，2-丙二醇和丙三醇。乙醇與X醇的比例為X醇羥基占醇溶液總羥基摩爾數(shù)的百分比。

2．3．1 正丁醇對PC乙醇解反應(yīng)的影響

向乙醇溶液中添加羥基摩爾比為10%、20%和30%的正丁醇，發(fā)現(xiàn)其反應(yīng)速率和LPC轉(zhuǎn)化率隨反應(yīng)時(shí)間的變化與乙醇解基本一致(圖8)，正丁醇對卵磷脂乙醇解無明顯作用。

圖8 乙醇與正丁醇相互作用對LPC轉(zhuǎn)化率的影響Fig．8 Effect of interaction of ethanol and n-butanol on the PLC conversion

Rodrigues等［24］研究了無溶劑體系下幾種脂肪酶催化油脂在短碳鏈醇中的酯交換反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)Lipozyme RM IM在低分子質(zhì)量醇(甲醇、乙醇)中易失活，而在正丁醇中轉(zhuǎn)化率較高。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與其不一致可能是由于底物組成及底物比不同，且乙醇和正丁醇在溶劑體系下被稀釋以致各自對酶的影響被削弱，同時(shí)正丁醇的空間結(jié)構(gòu)與乙醇相近，雖然碳鏈長度較乙醇略有增長，但在最適乙醇解條件下其分子動能與傳質(zhì)能力并未受到影響。正丁醇對卵磷脂的乙醇解未表現(xiàn)出明顯的促進(jìn)或抑制作用。

2．3．2 叔丁醇對PC乙醇解反應(yīng)的影響

近年來，在酶促油脂酯交換制備生物柴油的研究中，叔丁醇的使用備受重視。甲醇等短碳鏈醇與油脂的溶解性不好且易使酶失活，加之醇解反應(yīng)產(chǎn)物甘油對酶有毒害作用，使得酯交換率較低［25］。叔丁醇因其對甲醇和甘油等溶解性較好，有助于酶的激活并使固定化脂肪酶穩(wěn)定性增強(qiáng)，而廣泛用作酶促酯交換反應(yīng)介質(zhì)［26-27］。本實(shí)驗(yàn)向乙醇溶液中添加不同羥基摩爾比的叔丁醇，發(fā)現(xiàn)其反應(yīng)速率和LPC轉(zhuǎn)化率隨反應(yīng)時(shí)間的變化與乙醇解基本一致，叔丁醇對卵磷脂乙醇解未表現(xiàn)出顯著地促進(jìn)或抑制作用(圖9)。

圖9 乙醇與叔丁醇相互作用對LPC轉(zhuǎn)化率的影響Fig．9 Effect of interaction of ethanol and t-butanol on the PLC conversion

卵磷脂醇解不同于甘三脂醇解中叔丁醇所表現(xiàn)出的積極作用，可能是因?yàn)榈孜锏牟煌?，卵磷脂比甘三脂極性大，對醇的溶解性好，且反應(yīng)過程中甘油產(chǎn)生量很小。另外，叔丁醇與乙醇相比，支鏈結(jié)構(gòu)使其分子中羥基受到的空間位阻較大，因此可能導(dǎo)致底物碰撞機(jī)率的減少。

2．3．3 1，2-丙二醇對 PC 乙醇解反應(yīng)的影響

反應(yīng)初期PC乙醇解速率受丙二醇的影響不大(圖10)，因反應(yīng)初始階段溶劑體系下底物與酶之間尚處飽和狀態(tài)，在傳質(zhì)能力較強(qiáng)的情況下底物間的差異還未表現(xiàn)出來。反應(yīng)一段時(shí)間后，隨著丙二醇添加比例的增大，反應(yīng)速率和LPC轉(zhuǎn)化率都隨之降低，主要原因是含相同摩爾量的羥基時(shí)，與乙醇相比丙二醇分子體積較大，在溶液中傳動能力差。且丙二醇極性較大，在非極性的正己烷中溶解性和分散性較差，不利于反應(yīng)底物的接觸。隨著添加比例繼續(xù)增大至20%、30%時(shí)，丙二醇對乙醇解的抑制作用不再增加，可能是由于丙二醇分子中羥基占分子體積的比例較大，有利于它與磷脂和酶的接觸。Nelson等［28］研究發(fā)現(xiàn)，在正己烷溶劑中，Lipozyme RM IM在直鏈醇中的催化活性比在支鏈醇中好。溶劑體系下丙二醇對卵磷脂的乙醇解反應(yīng)表現(xiàn)出一定的抑制作用。

圖10 乙醇與1，2丙二醇相互作用對LPC轉(zhuǎn)化率的影響Fig．10 Effect of interaction of ethanol and α-propelene glycol on the PLC conversion

2．3．4 丙三醇對PC乙醇解反應(yīng)的影響

同丙二醇相似，丙三醇對PC的乙醇解反應(yīng)也有一定的抑制作用(圖11)。

有報(bào)道說甘油可能會由于傳質(zhì)限制而降低固定化酶活性［29-30］。脂肪酶在正己烷中有較高活性，但丙三醇在其中溶解性不好，會被固定化酶吸附堵塞通道，抑制反應(yīng)。

3 結(jié)論

有機(jī)溶劑體系下，通過單因素實(shí)驗(yàn)確定了脂肪酶Lipozyme RM IM催化大豆卵磷脂乙醇解制備溶血卵磷脂的最適反應(yīng)條件:溫度40℃，加酶量15%(以PC 質(zhì)量計(jì))，溶劑比1∶2(PC∶正己烷，g∶mL)，底物比1∶3(PC∶醇中羥基，mol∶mol)，加水量 1∶80(PC∶水，g∶μL)。在此基礎(chǔ)上，考察醇的相互作用對卵磷脂乙醇解的影響，發(fā)現(xiàn)正丁醇和叔丁醇對PC乙醇解無明顯影響，1，2-丙二醇和丙三醇對PC乙醇解表現(xiàn)出抑制作用。

圖11 乙醇與丙三醇相互作用對LPC轉(zhuǎn)化率的影響Fig．11 Effect of interaction of ethanol and glycerol on the PLC conversion

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