聚纈氨酸修飾電極伏安法測(cè)定曲酸*

馬心英，陳美鳳，李方珍

(菏澤學(xué)院化學(xué)化工系，山東菏澤，274015)

曲酸(kojic acid，麴酸)是大多數(shù)曲霉屬和青霉屬真菌產(chǎn)生的一種常見的弱酸性代謝產(chǎn)物，化學(xué)名稱為 5-羥基-2-羥甲基-γ-吡喃酮［1-2］，存在于醬油、豆瓣醬、酒類等釀造產(chǎn)物中，有抗菌和多酚氧化酶抑制作用，近年來由于曲酸在食品、化妝品及藥物中的廣泛應(yīng)用，其安全性成為人們關(guān)注的焦點(diǎn)。2005年，日本突然指出曲酸具有致癌性，并宣布禁止將曲酸作為食品添加劑使用［3］。盡管少量的曲酸不會(huì)對(duì)人體構(gòu)成威脅［4］，但研究表明連續(xù)過度使用曲酸會(huì)致癌［5-7］，因此建立簡(jiǎn)單快速的曲酸測(cè)定方法非常有必要。目前，對(duì)曲酸的分析方法不多，已經(jīng)報(bào)道的主要有分光光度法［8-9］、高效液相色譜法［3］、毛細(xì)管電泳法［10］。這幾種方法的操作步驟復(fù)雜，檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)，檢測(cè)費(fèi)用高，對(duì)儀器要求高。采用電化學(xué)法檢測(cè)曲酸［11-13］具有操作簡(jiǎn)單快速，選擇性好，靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，目前國(guó)內(nèi)用電化學(xué)方法檢測(cè)曲酸報(bào)道較少［14-15］，特別是化學(xué)修飾電極法。電極表面經(jīng)過修飾后，具有某些新功能，有利于提高電極的靈敏度和選擇性、改善電極的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性［16-19］。氨基酸由于其分子結(jié)構(gòu)含有羧基和氨基，作為化學(xué)修飾電極材料具有很多獨(dú)特的性質(zhì)，我們?cè)?jīng)用聚纈氨酸修飾電極成功測(cè)定去甲腎上腺素［20］。

本實(shí)驗(yàn)用聚纈氨酸修飾電極測(cè)定曲酸，研究了曲酸在修飾電極上的電化學(xué)行為，并用于食品中曲酸含量的測(cè)定。本修飾電極制備簡(jiǎn)單，選擇性好，響應(yīng)快，穩(wěn)定性好，有較高的靈敏度，有較好的應(yīng)用前景。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑

CHI660C電化學(xué)工作站，上海辰華儀器公司;PHS-3B型酸度計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司;KQ-100型超聲波清洗器，昆山市超聲波儀器廠;電化學(xué)實(shí)驗(yàn)用三電極系統(tǒng)，聚纈氨酸修飾電極為工作電極，鉑絲電極為對(duì)電極，Ag/AgCl電極為參比電極。

曲酸標(biāo)準(zhǔn)品(中國(guó)藥品生物制品檢定所)，用水配制成8.00×10-4mol/L溶液，避光保存;

纈氨酸(天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所)，配制成2.50×10-3mol/L溶液;

Na2HPO4-C6H8O7·H2O，配制成 PBS緩沖溶液;HAc-NaAc配制成ABS緩沖溶液。所用試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水均為二次石英重蒸水。

1.2 聚纈氨酸修飾電極的制備

將玻碳電極(Φ=3.8 mm)在濕潤(rùn)的金相砂紙(粒度為2000)上磨光，然后在濕潤(rùn)的 Al2O3(0.05 μm)上拋光成鏡面，依次用 HNO3(1∶1，V/V)、無水乙醇、二次石英亞沸蒸餾水超聲清洗(1 min/次)。在5.00×10-4mol/L纈氨酸pH 8.0 PBS中，以玻碳電極為工作電極，Ag/AgCl電極為參比電極，鉑絲電極為對(duì)電極，在-1.4～2.6 V電位范圍內(nèi)，以140 mV/s掃描速率循環(huán)掃描9周，取出用二次蒸餾水淋洗電極表面，即制得聚纈氨酸修飾電極。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

在pH5.4 ABS中，加入一定量曲酸，以聚纈氨酸修飾電極為工作電極，Ag/AgCl電極為參比電極，鉑絲電極為對(duì)電極，在0.5～1.4 V電位范圍內(nèi)，以120 mV/s掃描速率進(jìn)行循環(huán)掃描，記錄峰電位和峰電流。每次掃描結(jié)束后，將電極置于空白底液中循環(huán)掃描至峰消失，用二次蒸餾水沖洗，濾紙吸干后，即可進(jìn)行下一次測(cè)定。

2 結(jié)果與討論

2.1 聚纈氨酸修飾電極電化學(xué)聚合條件

電化學(xué)聚合條件影響修飾電極的性能，測(cè)定不同的底物，聚纈氨酸修飾電極的聚合條件不同。對(duì)于曲酸的測(cè)定，討論了制備聚纈氨酸修飾電極的聚合底液的pH、聚合高低電位、聚合周數(shù)及掃描速率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在5.00×10-4mol/L纈氨酸pH8.0 PBS中，在-1.4～2.6 V電位范圍內(nèi)，以140 mV/s掃描速率循環(huán)掃描9周，所制備的修飾電極對(duì)曲酸的測(cè)定具有最大的電流響應(yīng)，對(duì)曲酸的電化學(xué)氧化催化效果最好。圖1為纈氨酸在最佳聚合條件聚合過程的循環(huán)伏安圖。由圖可見，在掃描2周之后，隨掃描周數(shù)的增加，氧化峰電位正移，還原峰電位負(fù)移，而峰電流增加，但增加幅度減小，最后氧化峰和還原峰都達(dá)到了穩(wěn)定。聚合完成后，可觀察到玻碳電極表面有深藍(lán)色膜存在，圖2為聚纈氨酸修飾膜掃描電子顯微鏡圖，表明纈氨酸在電極表面形成了多分子層修飾膜。

圖1 纈氨酸在玻碳電極表面聚合過程的循環(huán)伏安曲線Fig.1 Cyclic voltammograms for electropolymerization of valine on a GCE surface

2.2 曲酸在聚纈氨酸修飾電極上的電化學(xué)特性

圖3為曲酸分別在玻碳電極(1)、聚纈氨酸修飾電極(2)上的循環(huán)伏安曲線，由圖3可見:曲酸在裸玻碳電極上的氧化峰電流為:ipa1=4.45 μA，而在聚纈氨酸修飾電極上氧化峰電流為:ipa2=9.45 μA，與裸玻碳電極相比，曲酸在聚纈氨酸修飾電極上的氧化峰電流明顯增大1倍多，說明聚纈氨酸修飾膜對(duì)曲酸電化學(xué)氧化具有良好的催化作用，有利于曲酸在電極上的電化學(xué)氧化。從循環(huán)伏安曲線上未觀察到還原峰，說明曲酸在修飾電極上的電極反應(yīng)不可逆。

圖2 聚纈氨酸修飾膜的掃描電子顯微鏡圖Fig.2 SEM image of the surface of the poly(valine)modified electrode

圖3 曲酸在玻碳電極(1)和聚纈氨酸修飾電極(2)上的循環(huán)伏安曲線Fig.3 Cyclic voltammograms of kojic acid(1.00×10-4mol/L)at(1)the bare electrode and(2)the a poly(valine)modified electrode in pH 5.0 HAc-NaAc

2.3 測(cè)定曲酸的最佳條件

2.3.1 測(cè)定底液pH的影響

研究了曲酸在 H2SO4、HNO3、NH3·H2O-NH4Cl、KH2PO-Na2HPO4，HAc-NaAc等介質(zhì)中的伏安行為，結(jié)果表明，在HAc-NaAc緩沖介質(zhì)中曲酸在修飾電極上的氧化峰電流最大，因此選擇HAc-NaAc緩沖溶液作為測(cè)定底液。由于氧化過程涉及到質(zhì)子的參與，因此測(cè)定底液pH對(duì)電極反應(yīng)的影響較大。固定其他實(shí)驗(yàn)條件不變，只改變測(cè)定底液的pH進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明pH在3.8～5.4的范圍內(nèi)隨底液pH的升高，曲酸在修飾電極上氧化峰電流逐漸增大，當(dāng)pH等于5.4時(shí)，曲酸氧化峰電流達(dá)到最大值，隨后降低(圖4)，故本實(shí)驗(yàn)選pH為5.4的ABS為測(cè)定底液。實(shí)驗(yàn)結(jié)果還表明，曲酸氧化峰電位隨著pH值的升高發(fā)生負(fù)移，在pH3.8～5.8之間，其線性回歸方程為Epa=1.27-0.066pH，相關(guān)系數(shù) r=0.992 5，斜率為0.066，接近0.059，說明曲酸在氧化過程中涉及質(zhì)子的參與，且質(zhì)子轉(zhuǎn)移數(shù)等于電子轉(zhuǎn)移數(shù)，其可能的電極反應(yīng)式為［19］:

圖4 2.00×10-4mol/L曲酸在聚纈氨酸修飾電極上的隨pH變化的CV曲線Fig.4 Cyclic voltammograms of 2.00×10-4mol/L kojic acid at a poly(valine)modified electrode in HAc-NaAc of various pH

2.4.2 測(cè)定電位的影響

測(cè)定電位范圍對(duì)曲酸在修飾電極上的氧化峰電流大小有一定影響。固定測(cè)定低電位為0.5 V及其他條件不變，只改變高電位進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，當(dāng)高電位為1.4 V時(shí)，曲酸在修飾電極上的響應(yīng)電流最大;固定測(cè)定高電位為1.4 V及其他條件不變，當(dāng)?shù)碗娢粸?.5 V時(shí)，曲酸在修飾電極上的響應(yīng)電流最大，故本實(shí)驗(yàn)選擇的測(cè)定電位范圍為0.5～1.4 V。

2.4.3 掃描速度的影響

改變掃描速度進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，氧化峰電流與掃描速度的大小呈線性關(guān)系(圖5)，其線性回歸方程為:ipa=9.66×10-8v+6.34×10-6，相關(guān)系數(shù)為:r=0.999 1;說明曲酸在修飾電極上的電極過程為吸附過程。隨掃描速度的增加，峰電流增加(圖5)在掃描速度為120 mV/s時(shí)，峰形最好，故本實(shí)驗(yàn)選用掃描速度為120 mV/s。

2.5 工作曲線和重現(xiàn)性

由于曲酸易于與一些金屬離子配位，而且EDTA和Na2SO3溶液的加入對(duì)曲酸的電化學(xué)響應(yīng)影響很小，因此在測(cè)定底液中加入0.3 mol/L EDTA作為金屬離子的掩蔽劑，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的Na2SO3作為抗氧化劑，以防止Fe3+的干擾，并且實(shí)驗(yàn)采用加入EDTA和Na2SO3后的體系做工作曲線。在最佳實(shí)驗(yàn)條件下，用循環(huán)伏安法對(duì)不同濃度的曲酸標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測(cè)定(循環(huán)伏安曲線如圖6)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，曲酸標(biāo)準(zhǔn)溶液在濃度范圍7.00×10-6～6.50×10-4mol/L內(nèi)與氧化峰電流有良好的線性關(guān)系，其線性回歸方程為ipa=3.89×10-6+0.048c，相關(guān)系數(shù)為 r=0.998 3，檢出限為8.50×10-7mol/L。

圖5 不同掃速下2.00×10-4mol/L的曲酸在聚纈氨酸修飾電極上的循環(huán)伏安圖Fig.5 Cyclic voltammograms of 2.00×10-4mol/L kojic acid at a poly(valine)modified electrode

用聚纈氨酸修飾電極對(duì)2.00×10-5mol/L曲酸標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測(cè)定5次，測(cè)得結(jié)果的RSD為1.4%，表明該電極對(duì)曲酸的測(cè)定有較好的重現(xiàn)性。

圖6 不同濃度的曲酸在聚纈氨酸修飾電極上的循環(huán)伏安曲線Fig.6 Cyclic voltammograms of kojic acid at various concentrations at a poly(valine)modified electrode in pH 5.4 HAc-NaAc.Scan rate:120 mV/s

2.6 干擾實(shí)驗(yàn)

在上述實(shí)驗(yàn)條件下，以1.20×10-5mol/L的曲酸作干擾離子實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在允許相對(duì)誤差在±5%范圍內(nèi)，100倍于曲酸量的K+、Ca2+、Mg2+、、檸檬酸根、蔗糖，10倍的抗壞血酸不干擾測(cè)定。

2.7 樣品及回收率的測(cè)定

稱取黃豆醬10.20 g，粉碎至糊狀，加水30.00 mL稀釋，攪勻，用真空抽濾泵進(jìn)行抽濾得抽濾液，所得殘?jiān)礈?次，收集濾液轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶，加入5 mL 0.3 mol/L EDTA溶液，掩蔽金屬離子，加入5 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.00%Na2SO3溶液，防止Fe3+干擾，用二次蒸餾水定容。取一定量配制好的黃豆醬稀釋液，加入一定量pH5.4ABS緩沖溶液于電解池中，對(duì)其進(jìn)行測(cè)定，并進(jìn)行回收率實(shí)驗(yàn)，所得結(jié)果為電解池中曲酸濃度，見表1。計(jì)算得該黃豆醬中所含曲酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.11%。

取25.00黃酒樣品分別于100.00 mL容量瓶中，分別加入2.00 mL 0.03 mol/L EDTA溶液，2.00 mL 1.00%Na2SO3溶液，再用pH 5.4ABS緩沖溶液稀釋至刻度，取一定量在最佳實(shí)驗(yàn)條件下測(cè)定并進(jìn)行回收率實(shí)驗(yàn)，所得結(jié)果為電解池中曲酸濃度。計(jì)算得該黃酒中所含曲酸的含量為37.63 mg/kg，結(jié)果見表1。

表1 樣品中曲酸的測(cè)定結(jié)果Table 1 Determination results of kojic acid in samples(n=6)

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)論

利用電化學(xué)方法制備了聚纈氨酸修飾電極，聚合條件影響修飾電極的催化效果。在pH=5.4醋酸鹽緩沖溶液中，聚纈氨酸修飾電極對(duì)曲酸電化學(xué)氧化具有良好催化作用，利用該修飾電極可準(zhǔn)確地測(cè)定曲酸的含量。其線性范圍為7.00×10-6～6.50×10-4mol/L，相關(guān)系數(shù)為r=0.998 3，檢出限為8.50×10-7mol/L，回收率為96.0% ～99.0%之間，可用于黃豆醬及黃酒中曲酸含量的測(cè)定。

［1］ 陶文沂，孫微，徐正宏，等.曲酸在食品中的應(yīng)用［J］.中國(guó)食品添加劑，2000，2:26-31.

［2］ 李學(xué)如，王艷，孟濤.食品中曲酸安全性評(píng)價(jià)研究進(jìn)展［J］. 食品與發(fā)酵工業(yè)，2005，31(12):79-83.

［3］ 黃娟，劉艷，丁濤，等.高效液相色譜一串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定食品中曲酸［J］. 色譜，2012，30(6):578-583.

［4］ Burdock G A，Soni M G，Carabin I G.Evaluation of health aspects of kojic acid in food ［J］.Regulatory Toxicology and Pharmacology，2001，33(1):80-101.

［5］ Chusiri Y，Wongpoomchai R，Kakehashi A，et al.Nongenotoxic mode of action and possible threshold for hepatocarcinogenicity of Kojic acid in F344 rats ［J］.Food and Chemical Toxicology，2011，49(2):471-476.

［6］ Fujimoto N，Watanabe H，Nakatani T，et al.Induction of thyroid tumours in(C57BL/6N x C3H/N)F1 mice by oral administration of kojic acid［J］.Food and Chemical Toxicology，1998，36(8):697-703.

［7］ Wei C I，Huang T S，F(xiàn)ernando S Y，et al.Chung Mutagenicity studies of kojic acid［J］.Toxicology Letters，1991，59(1-3):213-220.

［8］ Piantavini M S，Stremel D P，Trindade A C L B et al.Validation of a spectrophotometric method in the visible region for the quantification of kojic acid in raw materials and products［J］.Latin American Journal of Pharmacy，2010，29(8):1 468-1 472.

［9］ Januario Correr C，Cordeiro G，Gasparetto J，et al.Determinacde?cido kójico em produtos farmacêuticos por espectroscopia UV-vis e processo de calibrac?o multivariada［J］.Acta Farm.Bonaerense，2005，24(3):416-420.

［10］ Lin Y H，Yang Y H，Wu S M.Experimental design and capillary electrophoresis for simultaneous analysis of arbutin，kojic acid and hydroquinone in cosmetics［J］.Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis，2007，44(1):279-282.

［11］ Liu J，Zhou D，Liu X，et al.Determination of kojic acid based on the interface enhancement effects of carbon nanotube/alizarin red S modified electrode ［J］.Colloids and Surfaces B，2009，70(1):20-24.

［12］ Wang Y，Zhang D，Wu J.Electrocatalytic oxidation of kojic acid at a reduced graphene sheet modified glassy carbon electrode［J］.Journal of Electroanalytical Chemistry，2012，664(1):111-116.

［13］ Yang Z，Yin Z，Chen F.A novel kojic acid amperometric sensor based on hollow CuO/Fe2O3hybrid microspheres immobilized in chitosan matrix ［J］.Electrochimica Acta 2011，56(3):1 089-1 093.

［14］ 周君，狄俊偉.曲酸的電化學(xué)行為及其應(yīng)用［J］.南通職業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2005，19(4):8-9.

［15］ 周君，狄俊偉，屠一鋒.基于硅溶膠一凝膠化學(xué)修飾電極直接測(cè)定醬油中的曲酸［J］.食品科技，2007(6):214-215.

［16］ 賈莉，雷秋芬，張修華，等.鄰氨基硫酚自組裝膜修飾電極測(cè)定多巴胺［J］.應(yīng)用化學(xué)，2005，22(2):172-175.

［17］ 孫登明，馬偉，吳云.聚L-異白氨酸修飾電極的制備及對(duì)多巴胺的測(cè)定［J］.應(yīng)用化學(xué)，2006，23(11):1 214-1 217.

［18］ 韓曉霞，高作寧.DA和AA在CPB現(xiàn)場(chǎng)修飾碳糊電極上的電化學(xué)行為及電分析方法［J］.應(yīng)用化學(xué)，2007，24(7):770-773.

［19］ 陳高禮，馬偉，孫登明.銀摻雜聚L-天冬氨酸修飾電極的制備及對(duì)腎上腺素的測(cè)定［J］.應(yīng)用化學(xué)，2010，27(3):353-357.

［20］ 馬心英，林憲杰.聚纈氨酸修飾電極在抗壞血酸共存下選擇性測(cè)定去甲腎上腺素［J］.應(yīng)用化學(xué)，2009，26(3):287-291.