椰子種皮油提取物對(duì)氧化損傷的保護(hù)作用*

張玉鋒，段岢君，趙曉莉，陳衛(wèi)軍，趙松林

1(中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院椰子研究所，海南文昌，571339)

2(海南大學(xué)食品學(xué)院，海南?？?，570228)

3(國家重要熱帶作物工程技術(shù)研究中心，海南?？?，571101)

椰子(Cocosnucifera L.)為棕櫚科椰子屬多年生常綠喬木，是熱帶地區(qū)的一種重要水果和油料作物，除了用于生產(chǎn)食品外，還可作為椰殼活性炭、椰衣纖維、汽車坐墊等工業(yè)產(chǎn)品的原料，應(yīng)用范圍廣泛，被稱為“生命之樹”［1］。據(jù)報(bào)道，干燥后的成熟椰肉中脂肪含量高達(dá)70%，以其為原料生產(chǎn)的椰子油富含中短鏈飽和脂肪酸，具有殺菌、抗病毒、抗癌和減少心血管疾病發(fā)生危險(xiǎn)等多種功效［2］。因此，椰子油等相關(guān)產(chǎn)品的消費(fèi)量日益增加，這也意味著椰子種皮等副產(chǎn)物的大量產(chǎn)生，對(duì)這些副產(chǎn)物的加工利用已成為椰子加工業(yè)的重要課題，其高值化利用具有明顯的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)效益。

椰子種皮是成熟椰肉上附著的一層黑褐色薄皮，每個(gè)椰果可得種皮約100 g。在椰肉榨油時(shí)，如果附有種皮，會(huì)對(duì)所得油脂的色澤和性質(zhì)產(chǎn)生負(fù)面影響，不利于市場銷售，所以在榨油前將種皮削除。據(jù)統(tǒng)計(jì)，海南省每年可產(chǎn)椰子種皮2.37萬t，而這些種皮多被直接丟棄，或作為培養(yǎng)基質(zhì)和動(dòng)物飼料使用，附加值和利用率均較低［3］。因此，本文以椰子種皮為原料，提取種皮油，制備提取物，并探討該提取物對(duì)氧化損傷的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 椰子種皮油(coconutendocarp oil，CEO)的制備［4］

成熟的椰子，從中間剖開，取出椰肉，將附著于椰肉上的一層棕色椰子種皮削下收集，50℃烘干，粉碎，得種皮粉末。取粉末50 g，加入200 mL異丙醇，60℃超聲波輔助提取3h，真空抽濾，收集濾液;再向?yàn)V渣中加入200 mL異丙醇，重復(fù)提取3次，合并濾液，45℃旋蒸，除去溶劑，得椰子種皮油。4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 椰子種皮油提取物(coconut endocarp oil extract，CEOE)的制備

參考Seneviratne等［5］的方法，取椰子種皮油50 g，按照5∶1(mL∶g)的料液比，加入10 mL 體積分?jǐn)?shù)80%的甲醇，超聲波輔助提取10 min，然后于2 000 r/min離心30 min，收集上層清液，再加入10 mL體積分?jǐn)?shù)80%的甲醇，如此反復(fù)提取3次，合并上清液，于40℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去甲醇，而后冷凍干燥除去水分，得到椰子種皮油提取物。將提取物貯存于4℃冰箱中，用時(shí)取出用80%的甲醇溶解，并配制成一定濃度的溶液。

1.3 CEOE對(duì)人血清蛋白氧化損傷的保護(hù)作用

1.3.1 人血清蛋白(human serum albumin，HSA)的氧化處理［6］

10 mg/mL的人血清蛋白中分別加入等量的提取物甲醇溶液，Trolox，超純水，混勻，然后分別加入10 mmol的 H2O2，在37℃水浴中反應(yīng) 2 h。樣品與Trolox 的濃度梯度均為 0.5、1.0、1.5、2.0 和 2.5 mg/mL。

1.3.2 對(duì)蛋白質(zhì)羰基形成的抑制作用

參考Levine等人［7］的方法，并稍作修改:分別取上述混合液400 μL，加入400 μL濃度為 10 mmol/L的 2，4-二硝基苯肼(2，4-dinitrophenylhydrazine，DNPH)，空白以2 mol/L HCl代替，混勻，室溫下于暗處反應(yīng)1 h，每隔10 min漩渦1次。然后加入400 μL TCA(20%)蛋白質(zhì)腙衍生物。于4℃、16 000 r/min、離心5 min，棄去上清液。沉淀用1 mL乙醇/乙酸乙酯(體積比為1∶1)洗滌3次，每次洗完于16 000 r/min、4℃離心5 min，棄去上清液。最后沉淀用1.25 mL濃度為6 mol/L的鹽酸胍溶解，離心取上清液于370 nm測吸光值。每個(gè)樣品做3個(gè)平行。

蛋白質(zhì)羰基氧化抑制率/%=(1-A樣品/A空白)×100

1.3.3 蛋白質(zhì)氫過氧化物含量的測定

本實(shí)驗(yàn)采用二甲酚橙法［8］測定氫過氧化物含量。取0.1 mL氧化后的蛋白質(zhì)溶液，分別加入1 mL硫酸亞鐵銨(0.5 mmol)，1 mL 二甲酚橙(0.2 mmol)，室溫下反應(yīng)30 min，于560 nm處測試吸光值。

1.4 過氧化氫清除能力的測定［9］

1 mL的提取物/Trolox中依次加入1.0 mL的10 mmol/L H2O2，1.0 mL 硫酸亞鐵銨，0.3 mL 二甲酚橙，及1 mL 25 mmol/L的H2SO4，用PBS補(bǔ)充體積至5 mL，充分混勻，暗處反應(yīng)30 min，于560 nm處測試吸光值。對(duì)照組以水代替樣品，樣品對(duì)照組不添加H2O2，每個(gè)樣品做3個(gè)平行。

過氧化氫清除率/%=［1-(A樣品-A對(duì)照)/A對(duì)照］×100

1.5 CECO對(duì)羥基自由基誘導(dǎo)的DNA氧化損傷的保護(hù)作用

羥基自由基誘導(dǎo)DNA損傷，DNA結(jié)構(gòu)由超螺旋結(jié)構(gòu)斷裂成環(huán)狀或者線性結(jié)構(gòu)。參照Wei等［10］的方法，略加改動(dòng):準(zhǔn)確稱取瓊脂糖0.25 g，放入錐形瓶中，加入25 mL的1×TAE緩沖液，加熱使瓊脂糖完全溶解，待冷卻至60℃，加入2 μL EB(溴化乙錠)染色液，混勻，倒入膠板鋪板。室溫下(約30 min后)待凝膠完全凝固，拔出梳齒，將膠板放入盛有1×TAE緩沖液的電泳槽中。終體積為25 μL的反應(yīng)液中，分別含有 50 ng/μL 的 pBR 322 DNA 2 μL，5 mmol/L的 FeSO45 μL，3%的 H2O22 μL，100 mmol/L pH 7.4的PBS，濃度為0.1 mg/mL的提取物甲醇溶液1、2、3、4和5 μL，以同濃度同體積的Trolox作對(duì)照，以超純水代替樣品做空白。37℃水浴反應(yīng)1h，加入5 μL上樣緩沖液，點(diǎn)入1%的瓊脂糖凝膠中，90V電泳30 min，凝膠成像系統(tǒng)拍照。

1.6 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)均用平均值±SD表示;使用Origin 8.0和Excel制作圖表，并用SPSS 17.0進(jìn)行方差分析和顯著性檢驗(yàn)(P＜0.05)。

2 結(jié)果與討論

2.1 椰子種皮油提取物對(duì)人血清蛋白氧化的保護(hù)作用

2.1.1 提取物對(duì)蛋白質(zhì)羰基氧化的抑制作用

機(jī)體內(nèi)的蛋白質(zhì)氧化會(huì)影響多種細(xì)胞功能，涉及受體、信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制、運(yùn)輸系統(tǒng)和各種酶類，并可導(dǎo)致其他生物分子的二次損傷，如DNA修復(fù)酶失活等。有報(bào)道稱羰基生成是由活性氧攻擊氨基酸分子中自由氨基或亞氨基，經(jīng)反應(yīng)最終生成NH3和相應(yīng)的羰基衍生物［11］，可見蛋白質(zhì)羰基的產(chǎn)生是蛋白質(zhì)分子被自由基氧化修飾的一個(gè)重要標(biāo)記，因此可通過測定羰基的含量來判斷蛋白質(zhì)被氧化損傷的情況。

圖1顯示的是不同濃度的提取物對(duì)蛋白質(zhì)羰基氧化的抑制效果?？梢钥闯?，雖然CEOE的抑制效果均低于同濃度的Trolox，但是該提取物也表現(xiàn)出了抑制蛋白質(zhì)羰基生成的潛能，且隨著CEOE濃度的增加，其抑制作用呈現(xiàn)逐漸增強(qiáng)的趨勢(shì)，即具有明顯的劑量效應(yīng)。此外，濃度為 1.5、2.0 和 2.5 mg/mL 的CEOE 的抑制效果分別與 0.5、1.0 和 2.0 mg/mL 的Trolox的作用相當(dāng)。這就說明在一定程度上，椰子種皮油提取物可以作為一種抗氧化添加組分來降低由H2O2誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)羰基增多的氧化損傷。

圖1 CEOE/Trolox對(duì)蛋白質(zhì)羰基氧化的抑制作用Fig.1 Inhibiting effect of CEOE/Trolox on the oxidation of protein carbonyl

2.1.2 提取物對(duì)蛋白質(zhì)氫過氧化物含量的影響

Gieseg等人［12］的研究表明，人工培養(yǎng)的U973細(xì)胞在暴露于H2O2的情況下會(huì)誘發(fā)蛋白質(zhì)氫過氧化物的生成，并且該過氧化物會(huì)作為新的自由基源與細(xì)胞內(nèi)的抗氧化劑發(fā)生反應(yīng)，從而導(dǎo)致谷胱甘肽還原酶失活和DNA交聯(lián)等機(jī)體損傷。因此抑制蛋白質(zhì)氫過氧化物的形成也是抗氧化劑發(fā)揮其抗氧化作用的一種途徑。如圖2所示，與空白組(濃度為0 mg/mL組)相比，添加了CEOE與Trolox實(shí)驗(yàn)組的吸光值明顯降低，即CEOE與Trolox均可以有效降低蛋白質(zhì)氫過氧化物的含量;并且隨著濃度的增加，吸光值越來越小，表明高濃度的CEOE及Trolox更能抑制蛋白質(zhì)氫過氧化物的生成，從而降低氧化損傷。

圖2 CEOE/Trolox對(duì)蛋白質(zhì)氫過氧化物含量的影響Fig.2 Impaction effect of CEOE/Trolox on protein hydroperoxides

2.2 提取物對(duì)過氧化氫的清除能力

圖3顯示的是CEOE和Trolox對(duì)過氧化氫的清除能力。

圖3 CEOE/Trolox對(duì)過氧化氫的清除能力Fig.3 Scavenging activity of CEOE/Trolox on hydrogen peroxide

可以看出，隨著濃度的增加CEOE對(duì)H2O2的清除能力逐漸增強(qiáng)，在濃度為2.5 mg/mL時(shí)，清除率達(dá)(49.81±3.10)%，且其清除能力與自身濃度呈現(xiàn)正相關(guān)(R2=0.974)。有研究表明，機(jī)體內(nèi)的過氧化物和氫過氧化物一般是機(jī)體細(xì)胞組分與自由基或活性氧發(fā)生相互作用時(shí)的最初產(chǎn)物，當(dāng)機(jī)體細(xì)胞處在過氧化氫中時(shí)，糖酵解反應(yīng)中的ADP磷酸化過程會(huì)被抑制，從而造成機(jī)體供能不足［13］。因此，可將CEOE開發(fā)成一種抗氧化組分添加到食品中去，以清除機(jī)體內(nèi)的過氧化氫，保證機(jī)體供能。

2.3 椰子種皮油提取物對(duì)DNA損傷的保護(hù)作用

在Fe2+的催化作用下，過氧化氫可產(chǎn)生羥基自由基，從而引發(fā)自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。而超螺旋(SC)質(zhì)粒DNA在Fenton反應(yīng)體系中極易因氧化而使雙鏈斷裂形成開環(huán)(OC)或線性(L)結(jié)構(gòu)。在同一濃度的瓊脂糖凝膠中，超螺旋DNA分子遷移率比線性DNA分子快，線性DNA分子比開環(huán)DNA分子快［14］。由圖4可以看出，未加提取物的反應(yīng)組(Lane 2)在羥基自由基的作用下，DNA超螺旋結(jié)構(gòu)發(fā)生了嚴(yán)重的解螺旋現(xiàn)象，雙鏈斷裂形成了開環(huán)和線性結(jié)構(gòu)。而同Lane 2相比，加入100 ng CEOE的Lane 3的DNA超螺旋結(jié)構(gòu)僅發(fā)生部分?jǐn)嗔?，形成少許開環(huán)結(jié)構(gòu)，且未發(fā)現(xiàn)線性DNA。此外，隨著CEOE濃度的增加，該保護(hù)作用呈現(xiàn)逐漸增強(qiáng)的趨勢(shì):當(dāng)提取物添加量達(dá)到300ng(Lane 5)時(shí)，已不會(huì)出現(xiàn)解螺旋現(xiàn)象。這就說明該提取物可有效預(yù)防或者修復(fù)羥自由基誘導(dǎo)的DNA損傷。

圖4 CEOE/Trolox對(duì)羥基自由基誘導(dǎo)的DNA損傷的保護(hù)作用Fig.4 Protective effect of CEOE/Trolox on hydroxyl radical-induced DNA damage

3 展望

本研究結(jié)果表明，椰子種皮油提取物(CEOE)可有效抑制因自由基或活性氧引發(fā)的蛋白質(zhì)羰基和氫過氧化物的增多，并具有一定的過氧化氫清除能力;同時(shí)該提取物還可以顯著預(yù)防和修復(fù)羥自由基誘導(dǎo)的DNA損傷;表現(xiàn)出了較好的抗氧化潛能，是一種值得開發(fā)的抗氧化劑資源。但是，提取物的主要成分以及其中發(fā)揮抗氧化作用的主要物質(zhì)組成和其抗氧化機(jī)理還有待進(jìn)一步研究。

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