超聲波輔助提取板栗多糖的工藝研究

伍小紅，張潤(rùn)光，吳倩，韓軍岐

（1.西北政法大學(xué)經(jīng)濟(jì)管理學(xué)院，陜西西安710122；2.陜西師范大學(xué)食品工程與營(yíng)養(yǎng)科學(xué)學(xué)院，陜西西安710119）

板栗（Castanea mollissima Blume）為殼斗科喬本植物栗的種子，素有“千果之王”的美稱，是世界著名的干果之一。果實(shí)富含碳水化合物、蛋白質(zhì)、維生素、礦物質(zhì)及不飽和脂肪酸等多種成分，不僅具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，而且具有健脾養(yǎng)胃、益氣補(bǔ)腎、強(qiáng)筋活血等保健功能[1-3]。板栗中含有大量的板栗多糖，它具有增強(qiáng)免疫、抗腫瘤、抗血栓、降血壓、降血脂等藥理功效，對(duì)高血壓、冠心病、動(dòng)脈硬化和脾虛、腎虛等疾病有良好的預(yù)防和治療作用[4-6]，因此近年來(lái)板栗多糖的研究日益受到人們的重視。

高強(qiáng)度超聲波是一種可強(qiáng)化植物中多糖類化合物萃取的提取技術(shù)，可加速傳熱和傳質(zhì)過程。超聲波輔助提取的原理主要是利用超聲波的空化和振動(dòng)作用，使得植物細(xì)胞壁破裂，而且整個(gè)破裂過程在瞬間完成，不僅加速植物中有效成分的溶出，而且有利于活性成分的保留[7]。目前國(guó)內(nèi)外有關(guān)板栗多糖提取工藝的研究報(bào)道甚少[8-9]。以板栗為原料，采用超聲波輔助提取方法，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過正交試驗(yàn)對(duì)板栗多糖提取工藝進(jìn)行優(yōu)化以獲得最佳工藝條件，旨在為板栗的綜合利用、功能開發(fā)及產(chǎn)品精深加工提供一定的參考依據(jù)。

1 材料、試劑與儀器

1.1 材料、試劑

陜西省鎮(zhèn)安縣優(yōu)質(zhì)板栗；葡萄糖、濃硫酸、苯酚、95%乙醇等化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純，試驗(yàn)用水為蒸餾水。

1.2 主要儀器

T6型紫外可見分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；AL204型電子天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；DZX-9146MBE型數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱：上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；KQ-500E型超聲波清洗器：昆山市超聲波儀器有限公司；TCL-16G型高速冷凍臺(tái)式離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；HHB-21CU-600型電熱恒溫水浴鍋：上海?，攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；FW400A型高速萬(wàn)能粉碎機(jī)：北京科偉永興儀器設(shè)備有限公司。

2 試驗(yàn)方法

2.1 板栗粉制備的工藝流程

新鮮板栗→清洗→去皮→破碎→烘干→粉碎→過40目篩→脫脂→板栗粉→儲(chǔ)存?zhèn)溆?/p>

2.2 板栗多糖提取的工藝流程

脫脂板栗粉→超聲波處理→熱水浸提→離心→醇沉→離心→透析→冷凍干燥→板栗多糖粗品

2.3 板栗多糖的測(cè)定

將經(jīng)超聲波處理、熱水浸提的板栗多糖提取液冷卻至室溫，在 4000 r/min的轉(zhuǎn)速下離心15 min。取上清液倒入三角瓶中，加入4倍體積的95%乙醇醇沉過夜。再將溶液在 5000 r/min的轉(zhuǎn)速下離心10 min，回收上層乙醇，用少量蒸餾水溶解離心得到的沉淀多糖，定容至100 mL。再依次取1 mL溶液稀釋至25 mL。將稀釋后的溶液依次取2mL到試管中，分別加入5%的苯酚1 mL和濃硫酸5 mL搖勻。以蒸餾水做空白，再靜置20 min后立即在490 nm處用紫外可見分光光度計(jì)測(cè)吸光度并記錄。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

苯酚-濃硫酸法[10]：準(zhǔn)確移取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液（0.1 mg/mL）0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 mL，依次置于9個(gè)試管中，再分別加入蒸餾水補(bǔ)至0.8 mL，搖勻后分別加入5%的苯酚溶液0.3mL和濃硫酸2.0 mL，搖勻，放入沸水浴中顯色15 min，冷卻至室溫，以空白溶液作對(duì)照，分別于490 nm處測(cè)定各溶液吸光度（A），以葡萄糖質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（見圖1），并計(jì)算回歸方程。

經(jīng)過線性擬合得到回歸方程為：y=0. 0747x-0. 0926，R2=0. 9983，表明葡萄糖質(zhì)量濃度在0.1 mg/mL～0.8 mg/mL范圍內(nèi)，多糖類物質(zhì)含量與吸光度線性關(guān)系良好。

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of glucose sample

2.5 板栗多糖得率的計(jì)算

按下列公式計(jì)算板栗多糖的得率：

X=[（0.9×C×V×F）/（M× 1000）]×100%

式中：X為提取多糖類物質(zhì)的得率，%；0.9為葡萄糖轉(zhuǎn)化為多糖的轉(zhuǎn)換因子；C為待測(cè)液濃度，（mg/mL）；V為待測(cè)液體積，mL；M為樣品質(zhì)量，g；F為稀釋倍數(shù)。

2.6 板栗多糖提取工藝的單因素試驗(yàn)

2.6.1 料液比對(duì)板栗多糖提取效果的影響

準(zhǔn)確稱取板栗粉5.0 g，倒入500 mL三角瓶中，分別加入 50、100、150、200、250 mL 蒸餾水混合均勻，在超聲波功率200 W條件下超聲處理20 min，然后在80℃恒溫水浴鍋中加熱浸提，提取時(shí)間為3 h。提取液按葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定方法測(cè)定其吸光度，并計(jì)算樣品中板栗多糖的得率。

2.6.2 超聲波功率對(duì)板栗多糖提取效果的影響

準(zhǔn)確稱取板栗粉5.0 g，倒入500 mL三角瓶中，加入150 mL蒸餾水混合均勻，分別在超聲波功率50、100、150、200、250、300 W 條件下超聲處理 20 min。然后在80℃恒溫水浴鍋中加熱浸提，提取時(shí)間為3 h。提取液按葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定方法測(cè)定其吸光度，并計(jì)算樣品中板栗多糖的得率。

2.6.3 超聲波處理時(shí)間對(duì)板栗多糖提取效果的影響

準(zhǔn)確稱取板栗粉5.0 g，倒入500 mL三角瓶中，加入150 mL蒸餾水混合均勻，在超聲波功率200 W條件下進(jìn)行超聲處理，處理時(shí)間分別為 5、10、15、20、25、30 min，然后在80℃恒溫水浴鍋中加熱浸提，提取時(shí)間為3 h。提取液按葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定方法測(cè)定其吸光度，并計(jì)算樣品中板栗多糖的得率。

2.6.4 提取溫度對(duì)板栗多糖提取效果的影響

準(zhǔn)確稱取板栗粉5.0 g，倒入500 mL三角瓶中，加入150 mL蒸餾水混合均勻，在超聲波功率200 W條件下超聲處理 20 min，然后分別在 50、60、70、80、90、100℃下恒溫水浴鍋中加熱浸提，提取時(shí)間為3 h。提取液按葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定方法測(cè)定其吸光度，并計(jì)算樣品中板栗多糖的得率。

2.6.5 提取時(shí)間對(duì)板栗多糖提取效果的影響

準(zhǔn)確稱取板栗粉5.0 g，倒入500 mL三角瓶中，加入150 mL蒸餾水混合均勻，在超聲波功率200 W條件下超聲處理20 min，然后在80℃恒溫水浴鍋中加熱浸提，提取時(shí)間分別為 1、2、3、4、5、6 h。提取液按葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定方法測(cè)定其吸光度，并計(jì)算樣品中板栗多糖的得率。

2.7 板栗多糖提取最佳工藝條件的優(yōu)化

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇超聲波功率、料液比、提取溫度、超聲波處理時(shí)間和提取時(shí)間為試驗(yàn)因素，以板栗多糖得率為試驗(yàn)指標(biāo)，采用五因素四水平即L16（45）正交試驗(yàn)（具體設(shè)計(jì)見表1），優(yōu)化確定最佳提取工藝條件。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal test

3 結(jié)果與分析

3.1 板栗多糖提取工藝單因素試驗(yàn)結(jié)果

3.1.1 料液比對(duì)板栗多糖提取效果的影響

在超聲波功率200 W，超聲波處理時(shí)間20 min，提取溫度80℃，提取時(shí)間3 h的條件下，改變料液比，考察不同料液比對(duì)板栗多糖提取效果的影響見圖2。

圖2 料液比對(duì)板栗多糖得率的影響Fig.2 Effect of solid-liquid ratio on the extraction rate of chestnut polysaccharide

從圖2可以看出，板栗多糖得率隨料液比的增大而增加，但當(dāng)料液比達(dá)到1∶30（g/mL）后，得率隨料液比增大而變化幅度不大，這可能是最初隨著料液比的增大，多糖充分溶解到水中，當(dāng)料液比達(dá)到1∶30（g/mL）時(shí)，板栗中的多糖基本上完全溶出，繼續(xù)增加溶劑用量，多糖得率增加趨勢(shì)減緩?？紤]到節(jié)約成本，選擇料液比1∶30（g/mL）提取板栗多糖為好。

3.1.2 超聲波功率對(duì)板栗多糖提取效果的影響

在料液比 1 ∶30（g/mL），超聲波處理時(shí)間 20 min，提取溫度80℃，提取時(shí)間3 h的條件下，改變超聲波功率，考察不同功率對(duì)板栗多糖提取效果的影響見圖3。

圖3 超聲波功率對(duì)板栗多糖得率的影響Fig.3 Effect of ultrasonic power on the extraction rate of chestnut polysaccharide

由圖3可以看出，隨著超聲波功率的增大，板栗多糖得率不斷增加，當(dāng)功率達(dá)到200 W時(shí)，多糖得率最高，此后得率反而降低。超聲波功率200 W時(shí)，條件相對(duì)溫和，既可使多糖類物質(zhì)盡可能多地溶出，又不會(huì)使其降解；但當(dāng)超聲波功率過大時(shí)，溶液中分子振動(dòng)加劇，溫度急劇上升，導(dǎo)致部分多糖降解，從而影響得率。因此，超聲波功率選擇200 W時(shí)，提取效果較好。

3.1.3 超聲波處理時(shí)間對(duì)板栗多糖提取效果的影響

在料液比 1∶30（g/mL），超聲波功率 200 W，提取溫度80℃，提取時(shí)間3 h的條件下，改變超聲波處理時(shí)間，考察不同時(shí)間對(duì)板栗多糖提取效果的影響見圖4。

圖4 超聲波處理時(shí)間對(duì)板栗多糖得率的影響Fig.4 Effect of ultrasonic treatment time on the extraction rate of chestnut polysaccharide

從圖4可以看出，板栗多糖得率在20 min內(nèi)隨超聲波處理時(shí)間的延長(zhǎng)而升高，大于20 min后，得率有所下降，其原因可能是在超聲波功率200 W的條件下，超聲波在短時(shí)間內(nèi)即對(duì)板栗組織細(xì)胞壁產(chǎn)生了較大的破壞作用，提高了多糖類物質(zhì)的溶出速率，到20 min時(shí)多糖溶出最多，此后隨著超聲波處理時(shí)間的延長(zhǎng)，部分多糖可能遭到破壞，導(dǎo)致多糖得率下降。綜合分析，超聲波處理時(shí)間選擇20 min較好。

3.1.4 提取溫度對(duì)板栗多糖提取效果的影響

在料液比 1∶30（g/mL），超聲波功率 200 W，超聲波處理時(shí)間20 min，提取時(shí)間3 h的條件下，改變提取溫度，考察不同溫度對(duì)板栗多糖提取效果的影響見圖5。

從圖5可以看出，在80℃以內(nèi)隨著提取溫度的升高，板栗多糖得率呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，70℃以前得率隨溫度的變化而增加的幅度較小，當(dāng)溫度超過70℃后，得率大幅度增加，80℃時(shí)得率達(dá)到最高，其后得率又開始降低。分析其原因可能是提取溫度較低時(shí)，分子運(yùn)動(dòng)緩慢，多糖分子不能充分地溶解到水中，提取效果不佳；而當(dāng)溫度超過80℃后，由于溫度過高，導(dǎo)致部分多糖發(fā)生氧化變性，引起多糖得率下降。綜合考慮，提取溫度選擇80℃較為適宜。

3.1.5 提取時(shí)間對(duì)板栗多糖提取效果的影響

在料液比 1∶30（g/mL），超聲波功率 200 W，超聲波處理時(shí)間20 min，提取溫度80℃的條件下，改變提取時(shí)間，考察不同時(shí)間對(duì)板栗多糖提取效果的影響見圖6。

圖6 提取時(shí)間對(duì)板栗多糖得率的影響Fig.6 Effect of extraction time on the extraction rate of chestnut polysaccharide

從圖6可以看出，板栗多糖得率在前3 h內(nèi)呈明顯上升趨勢(shì)，到達(dá)3 h時(shí)得率出現(xiàn)最高值，3 h后多糖得率逐漸下降，這可能是由于超聲波處理破壞板栗細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)后，在3 h時(shí)溶出物基本達(dá)到飽和，但隨著加熱浸提時(shí)間的延長(zhǎng)，長(zhǎng)時(shí)間的高溫環(huán)境使部分多糖被氧化或降解，因此得率有所下降。試驗(yàn)得出，板栗多糖提取時(shí)間以3 h為宜。

3.2 板栗多糖提取工藝條件優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

在上述單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取超聲波功率、料液比、提取溫度、超聲波處理時(shí)間和提取時(shí)間五個(gè)因素按L16（45）正交表進(jìn)行正交試驗(yàn)，結(jié)果見表2。

由表2極差分析可得，各因素對(duì)板栗多糖得率影響的主次順序?yàn)椋篊﹥D﹥A﹥B﹥E，即提取溫度＞超聲波處理時(shí)間＞超聲波功率＞料液比＞提取時(shí)間。通過試驗(yàn)結(jié)果理論分析可得最佳組合為A3B1C3D4E1，而由試驗(yàn)數(shù)據(jù)直接得到的最佳組合為A3B1C3D2E4，兩者不一致，因此需要做驗(yàn)證試驗(yàn)。經(jīng)過對(duì)兩個(gè)組合進(jìn)行5次驗(yàn)證試驗(yàn)，得出采用A3B1C3D4E1組合處理，板栗多糖得率平均值可達(dá)14.20%（見表3），高于A3B1C3D2E4組合，所以最終確定超聲波輔助提取板栗多糖的最佳工藝條件為超聲波功率200 W，料液比1∶25（g/mL），提取溫度80℃，提取時(shí)間2.5 h，超聲波處理時(shí)間24 min，多糖得率為14.20%。

表2 板栗多糖提取正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 The results of orthogonal test for chestnut polysaccharide extraction

表3 板栗多糖提取工藝條件驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果Table 3 The validation test results of technological conditions for chestnut polysaccharide extraction

在得出超聲波輔助提取最佳工藝的基礎(chǔ)上，采用常規(guī)熱水回流提取法[試驗(yàn)條件：料液比1∶25（g/mL），提取溫度80℃，提取時(shí)間4 h]提取板栗中的板栗多糖來(lái)對(duì)比兩種方法的提取效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)常規(guī)回流提取法的多糖得率為9.68%，明顯低于超聲波輔助提取法。

4 結(jié)論

通過本試驗(yàn)研究，得到了超聲波輔助提取板栗多糖的最佳工藝條件，即料液比1∶25（g/mL），超聲波功率200 W，超聲波處理時(shí)間24 min，提取溫度80℃，提取時(shí)間2.5 h，此條件下，板栗多糖的得率為14.20%，提取效果較為理想。超聲波輔助提取方法與其它傳統(tǒng)提取工藝相比，不僅大大降低了提取時(shí)間和生產(chǎn)成本，而且顯著提高了有效成分的提取效率，是一種快速、節(jié)能、高效的新型提取技術(shù)，值得在實(shí)際生產(chǎn)中推廣應(yīng)用。

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