酶標儀法測定γ-氨基丁酸

梁慧，薛正蓮，周揚，汪冬冬，葉楊

(安徽工程大學生物與化學工程學院，微生物發(fā)酵安徽省工程技術(shù)研究中心，安徽蕪湖，241000)

γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)是一種非蛋白質(zhì)天然氨基酸，又稱哌啶酸、氨酪酸，化學名4-氨基丁酸，是一種非蛋白質(zhì)組成的天然氨基酸，在動物、植物和微生物中廣泛存在［1-2］。由谷氨酸(glutamic acid，Glu)經(jīng)谷氨酸脫羧酶(Glutamate decarboxylase，簡稱GAD或GDC)催化而來，是哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)中重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)［3-5］。關(guān)于GABA的測定近年來國內(nèi)外有酶法、色質(zhì)聯(lián)用法、柱層析熒光測定法、紙電泳比色、毛細管氣相色譜法、放射性受體法、毛細管電泳法、液相色譜法等，但以上方法大多成本高、費時長，不宜用于大批量樣品的定量分析。

可見光分光光度計是常用的化合物分析測量儀器［6］，酶標儀是酶聯(lián)免疫測定的常用儀器［7］，測定物質(zhì)含量二者均服從朗伯-比爾定律:物質(zhì)在一定波長處的吸光度與濃度之間存在線性關(guān)系，從而實現(xiàn)對化合物定量檢測的目的?？梢姽夥止夤舛扔嫹ㄓ绊懸蛩厣伲僮鞣爆?，試劑用量大，消耗時間長;酶標儀影響因素較多，但速度快，效率高，試劑用量少，適于大批量樣品的快速分析［8］。

鑒于在菌種選育過程中，獲得的GABA乳酸菌突變株的數(shù)量多，通過96孔板發(fā)酵的樣品多，尋找與之相匹配的簡便、準確、快速的GABA測定方法尤為重要。本實驗采用酶標儀法測定GABA含量，并與分光光度計法進行了比較，用Origin軟件對2種方法進行擬合分析，顯示2種測定方法具有很好的一致性。到目前為止，尚未見有關(guān)酶標儀測定GABA含量方面的相關(guān)研究報道，本實驗研究結(jié)果對于快速，簡便、準確的測定GABA具有很好的指導意義，為高通量選育GABA乳酸菌奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

γ-氨基丁酸(分析純)，上海元吉化工有限公司;L-Glu(純度99.9%，食品級)，河南蓮花味精股份有限公司;NaClO(生化試劑)，國藥集團化學試劑有限公司;H3BO3(分析純)，國藥集團化學試劑總廠;硼砂(分析純)，國藥集團化學試劑總廠;6%重蒸苯酚(生化試劑)，國藥集團化學試劑有限公司;FC型酶標儀，Thermo Fisher Scientific;常溫室壓等離子體(ARTP)，北京思清源生物科技有限公司;單道、八道手動可調(diào)移液器，Sartorius;723N可見分光光度計，上海佑科儀器儀表有限公司;Sorvall ST 16R Centrifug，Thermo Fisher Scientific。

1.2 菌種

糞腸乳酸球菌:本實驗室篩選獲得。

1.3 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基(g/L):蛋白胨10、酵母提取物10、葡萄糖5、乙酸鈉 5、K2HPO40.2、檸檬酸三胺 0.2、MgSO40.2、MnSO40.05、吐溫 -80 0.1 mL/L，pH 6.5。115℃，滅菌25 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):酵母提取物5、胰蛋白胨5、葡萄糖10、丁二酸鈉5、加入1%的 L-Glu，pH 6.5。115℃，滅菌25 min。

1.4 實驗方法

1.4.1 GABA測定原理及方法

比色法測定GABA的原理:Berthelot反應(yīng)是利用苯酚和NaClO與游離氨反應(yīng)，生成藍色的吲哚酚類(Indophenol dye)，GABA在該反應(yīng)中反應(yīng)靈敏，而α-氨基酸響應(yīng)低，利用在反應(yīng)中的差別來達到測定混合氨基酸中GABA的目的［9-10］。

測定方法:參照文獻［10-11］進行。吸取樣液0.8 mL，依次加入1 mol/L的 Na2CO3溶液0.2 mL，0.2 mol/L pH10.0的硼酸鹽緩沖液1 mL，6%的重蒸苯酚2 mL，混勻后加入NaClO溶液2 mL，混勻后放置4～8 min，然后沸水浴10 min，立即冰浴20 min，待溶液出現(xiàn)藍綠色后，加入4 mL 60%的乙醇溶液，混勻后放置20 min，酶標儀在640 nm測定OD值。

1.4.2 測定方法中主要影響因素的優(yōu)化

取0.4、0.6和0.8 mol/L的標準GABA溶液0.8 mL，按1.4.1的測定方法對主要影響因素硼酸鹽緩沖液、重蒸苯酚以及NaClO的添加量進行優(yōu)化;其中對硼酸鹽緩沖液添加量進行優(yōu)化時0.2 mol/L pH 10.0的硼酸鹽緩沖液取值分別為0.5，0.75，1.0，1.25，1.5 mL;對6%的重蒸苯酚進行優(yōu)化時6%的重蒸苯酚取值分別為 1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，3.5 mL;對NaClO進行優(yōu)化時含有效氯5.2%的NaClO溶液取值分別為 1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 mL。

1.4.3 標準曲線的建立

采用底物L-Glu與產(chǎn)物GABA混合配制標樣。精確配制1 g/L GABA和1 g/L L-Glu各100 mL按表1混合制成標準液。按優(yōu)化后的方法在640 nm下酶標儀測值繪制標準曲線，同時用可見光分光光度計在640 nm下進行測定并繪制標準曲線。

表1 標準溶液GABA和L-Glu組成表Table 1 Ingredients of the standard mixed solution composed by GABA and glutamic acid

1.4.4 精密度試驗

分別以濃度0.25 g/L和0.75 g/L的GABA按工作曲線的建立方法進行同樣操作，按標準曲線的線性回歸方程計算GABA的含量，并進行統(tǒng)計分析。

1.4.5 加標回收率試驗

分別取配制好的 1 g/L L-Glu 9.972、9.944、9.72、7.5、2.5 mL，添加配 制好的 1 g/L GABA 0.028、0.056、0.28、2.5、7.5 mL，配制成 0.002 8、0.005 6、0.028、0.25、0.75 g/L 的 GABA 按優(yōu)化后的方法測值，并且按標準曲線的線性回歸方程計算GABA的含量，進行統(tǒng)計分析。

1.4.6 兩種方法的擬合驗證

將實驗中通過ARTP誘變所獲得的75株乳酸菌突變菌經(jīng)96孔板發(fā)酵制得的發(fā)酵液離心，取上清液0.8 mL，按優(yōu)化后的方法，在640 nm下分別采用酶標儀與可見光分光光度計進行測值，并用origin 8.0 professional軟件擬合驗證。

2 結(jié)果與討論

2.1 硼酸鹽緩沖液添加量的影響

按方法1.4.2所測得的結(jié)果見圖1。

圖1 硼酸鹽緩沖液添加量對吸光度的影響Fig.1 The influence of borate buffer on absorbance

如圖1所示，隨著硼酸鹽緩沖液的添加量的增加OD值出現(xiàn)先上升后下降的趨勢，且0.4、0.6與0.8 mol/L的GABA都在添加0.75 mL的0.2 mol/L pH10.0的硼酸鹽緩沖液時OD值達到最大，這是由于添加0.75 mL的0.2 mol/L pH 10.0的硼酸鹽緩沖液所達到的pH值是Berthelot反應(yīng)的最適pH值，添加量過多過少都不利于反應(yīng)的進行，不能使反應(yīng)達到最大效率，因此本實驗確定添加0.2 mol/L pH10.0的硼酸鹽緩沖液0.75 mL。

2.2 6%重蒸苯酚添加量的影響

按方法1.4.2所測得的結(jié)果見圖2。

圖2 6%重蒸苯酚添加量對吸光度的影響Fig.2 The influence of 6%redistilled phenol on absorbance

如圖2所示隨著6%重蒸苯酚添加量的增加，OD值呈先增加后減少的趨勢，且0.4、0.6與0.8 mol/L的GABA都在添加2.5 mL 6%重蒸苯酚時達到最高OD值，究其原因為在Berthelot反應(yīng)中苯酚添加量與NaClO中有效氯含量存在一定比例關(guān)系［12］;因此，本實驗確定6%重蒸苯酚的添加量為2.5 mL。

2.3 NaClO添加量的影響

按方法1.4.2所測得的結(jié)果見圖3。

圖3 NaClO的添加量對吸光度的影響Fig.3 The influence of NaClO on absorbance

如圖3所示隨著NaClO添加量的增加，OD值呈先增加后減少的趨勢，且0.4、0.6與0.8 mol/L的GABA都在添加2 mL含有效氯5.2%的NaClO時達到最高OD值，其原因為在Berthelot反應(yīng)中2 mL 6%的重蒸苯酚與含有效氯5.2%的NaClO在一定pH條件下與游離氨反應(yīng)，反應(yīng)效率最高。

2.4 標準曲線的建立

按方法1.4.3分別繪制通過可見光分光光度計與酶標儀測得的GABA濃度的標準曲線，結(jié)果分別見圖4和圖5。

圖4 可見光分光光度計的標準曲線Fig.4 The standard curve of GABA by spectrophotometer

圖5 酶標儀的標準曲線Fig.5 The standard curve of GABA by microplate reader

由圖5可知，GABA的濃度在0～1.0 g/L范圍內(nèi)R=0.998 9線性關(guān)系良好，可以用于GABA濃度的測定，酶標儀法測GABA最低檢出限為0.002 8 g/L。

2.5 精密度試驗

按方法1.4.4所測得的精密度結(jié)果見表2，該方法在低濃度和高濃度都有很好的檢測精密度，相對誤差及各組的變異系數(shù)均小于5%;表明酶標儀法測GABA結(jié)果重現(xiàn)性好，精密度高，所得數(shù)據(jù)準確。

2.6 加標回收率試驗

按方法1.4.5所測得的加標回收率數(shù)據(jù)見表3，由表可知，當加標濃度為檢測限的10倍時，加標回收率為92.86% ～106.07%;為檢測限的2倍時，加標回收率為83.93% ～105.36%;而為最低檢測限時，加標回收率為125.00%。鑒于加入過多或過少標準物質(zhì)，均不能保證加標樣品有較好的回收率并且一般的分析方法適用濃度范圍的中、高濃度水平，因此，對0.25、0.75 g/L GABA的加標回收率進行測定，加標回收率為98.27%～103.60%，表明酶標儀法可以用于GABA濃度的測定。

2.7 擬合曲線的建立

按方法1.4.5，分別用可見光分光光度計與酶標儀對75株乳酸菌發(fā)酵液中GABA的含量進行測定，并進行擬合，驗證兩方法之間的相關(guān)性，擬合曲線見圖6。

表2 精密度試驗Table 2 Accuracy examinations

表3 加標回收率Table 3 Recoveries of spiked sample

圖6 分光光度計法與酶標儀法的擬合曲線Fig.6 The fitting curve of the spectrophotometer and enzyme-labelling measuring instrument

相關(guān)系數(shù)的正負表示的是相關(guān)的方向，而相關(guān)的強度決定于相關(guān)系數(shù)的絕度值。統(tǒng)計學家根據(jù)經(jīng)驗給出了判斷相關(guān)關(guān)系強弱的標準，把R=0.70看成是一個中等到較高的相關(guān)［13］。本實驗的樣本量為75，相關(guān)系數(shù)R=0.949 3，說明酶標儀法和可見光分光光度計之間具有較高的正相關(guān)性，酶標儀法可以作為快速、準確地測定發(fā)酵液中GABA含量的有效方法。

3 結(jié)論

本實驗基于Berthelot反應(yīng)原理，對酶標儀測定GABA含量方法的主要因素進行優(yōu)化，并對該方法進行精密度檢驗，表明酶標儀法測GABA可靠性高。本實驗還通過分光光度計與酶標儀對ARTP誘變獲得的75株突變株分別進行測值并進行擬合，實驗結(jié)果表明2種測定方法具有很好的一致性。酶標儀能快速，簡便、準確、大批量的測定發(fā)酵液中GABA含量，為高通量選育GABA乳酸菌奠定了實驗基礎(chǔ)。

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