橙皮苷酶高產(chǎn)菌株的選育及其酶學(xué)性質(zhì)的研究

申麗靜，汪釗，章銀軍，沈雪亮

（1.嘉興職業(yè)技術(shù)學(xué)院生物與環(huán)境分院，浙江嘉興314036；2.浙江工業(yè)大學(xué)生物與環(huán)境工程學(xué)院，浙江杭州310014）

橙皮苷是一種生物類(lèi)黃酮，又名橘皮甙、陳皮甙、橘皮素-7-O-蕓香糖甙等，橙皮苷廣泛地分布于葡萄柚、橘、橙等蕓香科植物中。我國(guó)是柑橘生產(chǎn)大國(guó)，除部分品種用于鮮食及加工外，許多品種及下腳料都未得到綜合利用，造成極大的浪費(fèi)。橙皮苷大部分存在于柑橘加工的廢棄物中，每噸柑橘果實(shí)的下腳料中可得到橙皮苷7 kg～8 kg，橙皮苷在直徑為1.27 cm～2.54 cm的果實(shí)中甚至達(dá)到干重的10%，因此橙皮苷來(lái)源非常廣泛而且提取成本較低。由于橙皮苷在水中的溶解度和生物利用度都很低，所表現(xiàn)出來(lái)的藥理作用相對(duì)較弱，需通過(guò)化學(xué)或者生物的方法對(duì)其進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾，以改進(jìn)其溶解性，增強(qiáng)其功效。橙皮苷酶能夠?qū)⒊绕ぼ账鉃槌绕に貑翁擒蘸统绕に?。橙皮素單糖苷是一種甜味劑的前體，口感好，熱值低，安全性好，它還具有較強(qiáng)的抗感冒病毒的活性，并可用于生產(chǎn)染料。橙皮素是3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A（HMG-CoA）還原酶抑制劑，具有抗氧化[1]、抗腫瘤[2]等功效，對(duì)糖尿病慢性并發(fā)癥、皮膚病也有很好的療效。橙皮苷的另一酶解產(chǎn)物鼠李糖是合成強(qiáng)心藥物的前體之一，被廣泛地應(yīng)用于食品行業(yè)，如作為高檔咖啡、飲料、肉制品的食品添加劑。

據(jù)報(bào)道[3]，橙皮苷酶一般以酶系的方式存在，但是關(guān)于其作用機(jī)理的研究較少。本文利用固態(tài)發(fā)酵制備橙皮苷酶，初步研究了橙皮苷酶的酶學(xué)性質(zhì)，并且對(duì)其酶解產(chǎn)物進(jìn)行了鑒定，為橙皮苷酶作用機(jī)制的研究提供了一定的參考。橙皮苷酶還可防止橘片罐頭中白濁的產(chǎn)生[4-6]，影響橘片罐頭質(zhì)量的白點(diǎn)主要成分是橙皮苷，在其中添加一定的橙皮苷酶，即可防止白濁的產(chǎn)生。

1 材料與方法

1.1 培養(yǎng)基

1.1.1 富集培養(yǎng)基

酵母膏0.2%，葡萄糖2.0%，磷酸氫二鉀0.2%，七水硫酸鎂0.05%，硫酸鐵0.001%，橙皮苷0.25%，pH自然。

1.1.2 平板培養(yǎng)基

蔗糖0.1%，橙皮苷0.25%，硫酸鎂0.5%，磷酸氫二鉀1.0%，氯化鉀0.5%，硫酸鐵0.01%，瓊脂1.5%～2.0%，pH自然。

1.1.3 斜面培養(yǎng)基

硝酸鈉0.2%，磷酸氫二鉀0.1%，氯化鉀0.05%，硫酸亞鐵0.001%，硫酸鎂0.05%，蔗糖3%，瓊脂1.5%～2.0%，pH自然。

1.1.4 固體培養(yǎng)基

麩皮100 g，豆餅粉 20 g，200 mL水，磷酸氫二鉀0.1%。

1.2 菌體的富集培養(yǎng)

稱(chēng)取菌源土樣2 g，溶于裝有50 mL無(wú)菌水和數(shù)十顆玻璃珠的250 mL三角瓶中，搖勻，移取5 mL懸浮液加入盛有25 mL富集培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，在30℃、200 r/min的條件下?lián)u瓶培養(yǎng)4 d，移取5 mL培養(yǎng)液至另一盛有新鮮富集培養(yǎng)基的三角瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。如此重復(fù)3次。

1.3 菌種的初篩

將菌懸液涂布于平板培養(yǎng)基上，30℃下培養(yǎng)5 d，觀察其透明圈大小，挑取有透明圈的菌株，進(jìn)一步分離純化后，接種于斜面培養(yǎng)基，30℃下培養(yǎng)72 h。

1.4 菌種的復(fù)篩

初篩所得的菌株接種于固體培養(yǎng)基，30℃下培養(yǎng)72 h，分別測(cè)定各個(gè)菌株橙皮苷酶活力，選取橙皮苷酶活力較大的作為實(shí)驗(yàn)用菌株。

1.5 誘變方法

單孢子菌懸液的制備：菌種在斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)7天后，用接種環(huán)挑取4～5環(huán)孢子于50 mL生理鹽水中，用玻璃珠打散，通過(guò)雙層濾紙過(guò)濾，濾紙?jiān)陲@微鏡下觀察，99%為單孢子，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)算孢子數(shù)。

紫外線誘變處理：常規(guī)方法[7]。

硫酸二乙酯（DES）誘變處理：常規(guī)方法[7]。

1.6 橙皮苷酶的提取

將用固體培養(yǎng)基培養(yǎng)好的菌體用10倍培養(yǎng)基質(zhì)量的蒸餾水浸泡，靜置3 h～8 h，過(guò)濾得粗酶液，于0℃～4℃下保藏，備用。

1.7 橙皮苷酶酶活測(cè)定方法

橙皮苷酶酶活定義：在45℃、pH4.5的條件下，每分鐘轉(zhuǎn)化1μg橙皮苷所需的酶量為一個(gè)酶活力單位（U）。

橙皮苷及其酶解產(chǎn)物的檢測(cè)方法：反相高效液相色譜法（HPLC），分離柱是Agilent的 ZORAX SB-C18，流動(dòng)相比例為甲醇∶水＝55∶45，流速1 mL/min，進(jìn)樣量20 μL，檢測(cè)波長(zhǎng) 283 nm。

酶活測(cè)定方法：試管中加5 mL pH4.5的醋酸-醋酸鈉緩沖液、4.5 mL濃度為0.2%的橙皮苷溶液，在45℃下保溫10 min，加入0.5 mL酶液，保溫15 min，立即用沸水浴滅活10 min，高效液相色譜法測(cè)得剩余底物量或者生成產(chǎn)物的量，通過(guò)計(jì)算可得底物減少量。

2 結(jié)果與討論

2.1 產(chǎn)橙皮苷酶菌種的篩選

2.1.1 菌種的初篩

將富集過(guò)的土樣培養(yǎng)液和實(shí)驗(yàn)室保藏菌株斜面培養(yǎng)菌體用無(wú)菌水稀釋后涂布于平板培養(yǎng)基上，30℃下培養(yǎng)5 d，觀察其透明圈大小，挑取43株有透明圈的菌株，進(jìn)一步分離純化后，接種于斜面培養(yǎng)基，30℃下培養(yǎng)72 h。

2.1.2 菌種的復(fù)篩

初篩所得的菌株接種于固體培養(yǎng)基，30℃下培養(yǎng)72 h，根據(jù)方法1.6提取橙皮苷酶，測(cè)定橙皮苷酶活力，結(jié)果如圖1所示。

圖1 不同菌株的酶活力Fig.1 The enzyme activity of different strains

由菌種復(fù)篩結(jié)果可知，編號(hào)為10的菌株酶活力最高，達(dá)到105.6U/g培養(yǎng)基。酶活力為200 U/g～300 U/g的菌株共有19株，其活力只有第10號(hào)菌株的1/4左右，故選擇第10號(hào)菌株為實(shí)驗(yàn)用菌株，命名為WZ1。

2.1.3 菌種的誘變

紫外線誘變：在20 W紫外燈40 cm處，菌懸液在磁力攪拌器下邊攪拌邊誘變，照射時(shí)間為16 min，致死率達(dá)到98.2%，正突變率為20%，經(jīng)過(guò)篩選得到一突變株Aspergillus niger WZ01酶活有明顯提高，經(jīng)固態(tài)發(fā)酵后酶活可達(dá) 1839 U/g固體培養(yǎng)基，紫外誘變后其酶活力提高了74.2%。

硫酸二乙酯（DES）誘變：用磷酸緩沖液將Aspergillus niger WZ01新鮮斜面的孢子洗下，制成菌懸液，含孢子密度在106個(gè)/mL～107個(gè)/mL，取DES溶液和菌懸液等量（如5∶5）加入到無(wú)菌試管內(nèi)混合，最后處理濃度為1%，在30℃下振蕩處理30 min，致死率達(dá)到90%，正突變率為50%經(jīng)過(guò)篩選得到一酶活力較高突變株AspergillusnigerWZ001，經(jīng)固態(tài)發(fā)酵后酶活可達(dá) 3668 U/g固體培養(yǎng)基，DES誘變后其酶活力提高了99.4%。

2.2 橙皮苷酶解產(chǎn)物的鑒定

利用液質(zhì)聯(lián)用（LC-MS）法對(duì)橙皮苷酶轉(zhuǎn)化液進(jìn)行定性和定量的分析，并對(duì)液相色譜圖上的三個(gè)主峰和橙皮苷標(biāo)樣、橙皮素標(biāo)樣進(jìn)行二極管陣列全波長(zhǎng)掃描，其液相結(jié)果如圖2所示，質(zhì)譜圖如圖3所示。

圖2 酶轉(zhuǎn)化液色譜圖Fig.2 HPLC chromatogram of the enzymatic reactants

由圖2可知，酶轉(zhuǎn)化液中有三個(gè)主峰，峰1的保留時(shí)間和標(biāo)樣橙皮苷保留時(shí)間3.796 min一致，說(shuō)明峰1是底物橙皮苷，峰2的保留時(shí)間為4.233 min，峰3的保留時(shí)間和標(biāo)樣橙皮素保留時(shí)間是9.221 min一致，說(shuō)明峰3可能是橙皮素。

對(duì)液相色譜圖中三個(gè)主峰以及橙皮苷標(biāo)樣和橙皮素標(biāo)樣進(jìn)行二極管陣列全波長(zhǎng)掃描。由于黃酮分子中存在桂皮?；氨郊柞；M成的交叉共軛體系，故黃酮類(lèi)物質(zhì)一般在紫外區(qū)域內(nèi)有兩個(gè)主要的吸收帶，稱(chēng)為峰帶Ⅰ（300 nm～400 nm）和峰帶Ⅱ（220 nm～280 nm）[8]橙皮苷和橙皮素都是二氫黃酮，因其B環(huán)與吡喃酮環(huán)上的羰基共軛很弱，故帶Ⅰ很弱，只在主峰峰帶Ⅱ的長(zhǎng)波方向處有一肩峰，而帶Ⅱ也會(huì)有所紅移。物質(zhì)的吸收峰是由其結(jié)構(gòu)決定的，吸收峰的相似性可以說(shuō)明物質(zhì)結(jié)構(gòu)的相似性。由全波長(zhǎng)掃描結(jié)果可知，它們的掃描圖譜基本一致，即在250 nm～315 nm的范圍內(nèi)都有一明顯的吸收帶，其最大吸收波長(zhǎng)為288 nm，在長(zhǎng)波方向處都有一肩峰。掃描圖譜的相似性說(shuō)明了這5個(gè)峰所代表的物質(zhì)結(jié)構(gòu)的相似性，所以可以進(jìn)一步驗(yàn)證了轉(zhuǎn)化液的HPLC圖譜中峰1為橙皮苷，峰3為橙皮素，而峰2是與橙皮苷、橙皮素結(jié)構(gòu)相似的一種黃酮類(lèi)物質(zhì)。

圖3 兩種產(chǎn)物的質(zhì)譜圖Fig.3 Mass spectra of the products

由圖3可知，峰2物質(zhì)的分子量為464，與橙皮素單糖苷的分子量相吻合。通過(guò)全波長(zhǎng)掃描已知峰2是一種與橙皮素、橙皮苷結(jié)構(gòu)相似的物質(zhì)，而且它是橙皮苷的酶解產(chǎn)物，由此可以確定峰2即橙皮素單糖苷。峰3物質(zhì)的分子量與橙皮素的分子量302一致，在此也進(jìn)一步驗(yàn)證了峰3是橙皮素。

2.3 橙皮苷酶酶學(xué)性質(zhì)的研究

2.3.1 pH對(duì)酶活的影響

以橙皮苷作為底物，分別在pH為2.0、3.0、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、7.0、8.0、9.0 的條件下，測(cè)定橙皮苷酶酶活力，結(jié)果見(jiàn)圖4所示。

由圖4可見(jiàn)，當(dāng)pH為5.0時(shí)橙皮苷酶酶活最高。pH對(duì)橙皮苷酶酶活影響較大，處于堿性和pH小于3.0的環(huán)境中橙皮苷酶基本失活。

2.3.2 溫度對(duì)酶活的影響

以橙皮苷為底物，pH為4.5的醋酸-醋酸鈉作為緩沖液，分別在 0、20、30、40、50、55、60、65、70、80 ℃的溫度下，測(cè)定橙皮苷酶酶活，結(jié)果如圖5所示。

圖4 pH對(duì)酶活的影響Fig.4 Effect of pH on enzyme activity

圖5 溫度對(duì)橙皮苷酶的影響Fig.5 Effect of temperature on enzyme activity

由圖5可知，橙皮苷酶的最適轉(zhuǎn)化溫度為60℃，當(dāng)溫度小于60℃時(shí)，隨著溫度的增加橙皮苷酶活力也穩(wěn)步增加，而當(dāng)溫度大于60℃時(shí)，酶活下降趨勢(shì)較快，當(dāng)溫度達(dá)到80℃時(shí)，橙皮苷酶基本失活。

2.3.3 橙皮苷酶的酸堿穩(wěn)定性

將橙皮苷酶分別在 pH2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0 的環(huán)境中下放置 60 min，分別測(cè)定其酶活，結(jié)果如圖6所示。

圖6 橙皮苷酶的酸堿穩(wěn)定性Fig.6 Effect of pH on enzyme stability

由圖6可知，橙皮苷酶經(jīng)過(guò)不同pH的緩沖液處理后酶活有所變化，但是在pH3.0～10.0的范圍內(nèi)都比較穩(wěn)定，處理60 min后橙皮苷酶相對(duì)酶活都保持在90%以上，當(dāng)pH超出該范圍時(shí)橙皮苷酶酶活力急速下降。

2.3.4 橙皮苷酶的熱穩(wěn)定性

將橙皮苷酶分別在 0、20、30、40、50、60、70、80 ℃的環(huán)境中放置60 min，分別測(cè)定其酶活，結(jié)果如圖7所示。

由圖7可知，橙皮苷酶在低于60℃的條件下，其酶活性還可保持在最高酶活的90%以上，當(dāng)處理的溫度達(dá)到70℃時(shí)，酶活基本喪失。

圖7 橙皮苷酶的熱穩(wěn)定性Fig.7 Effect of temperature on enzyme stability

2.4 小結(jié)

從土壤和實(shí)驗(yàn)室保藏菌株中篩選得到了一株橙皮苷酶的高產(chǎn)菌株Aspergillus niger WZ1，經(jīng)紫外誘變和硫酸二乙酯（DES）誘變后酶活分別提高了74.2%和99.4%，酶活達(dá)到了 3668 U/g固體培養(yǎng)基。該菌株所產(chǎn)橙皮苷酶能夠?qū)⒊绕ぼ彰附鉃槌绕に貑翁擒蘸统绕に?，該酶最適pH和最適溫度分別是5.0和60℃，在pH 3.0～10.0和溫度0℃～60℃的環(huán)境中，酶的穩(wěn)定性較。

橙皮苷酶解后出現(xiàn)兩個(gè)產(chǎn)物，說(shuō)明橙皮苷酶可能以酶系的方式存在，它們分別作用于兩個(gè)不同的糖苷鍵，即α-L-鼠李糖苷鍵和β-D-葡萄糖苷鍵，但是也有可能是一個(gè)酶同時(shí)作用于兩個(gè)糖苷鍵。本論文的研究結(jié)果為進(jìn)一步研究橙皮苷酶催化機(jī)理提供了一定的參考，若要進(jìn)行深入的研究，還需對(duì)橙皮苷酶進(jìn)行分離純化，該工作的開(kāi)展不但有利于理論研究的進(jìn)行，而且能促進(jìn)其在工業(yè)上的應(yīng)用。

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