慢性丙型肝炎患者治療前后外周血T細(xì)胞CD28、CD152水平變化分析

陳 杰，武 玲(孝感市中心醫(yī)院檢驗科，孝感 432100;通訊作者，E-mail:crystal_cj0404@126.com)

丙型病毒性肝炎(hepatitis C，HC)是由丙型肝炎病毒(HCV)引起的急性肝臟炎癥，臨床表現(xiàn)與乙型肝炎相似。國外人群HCV感染率高達3%，我國健康人群 HCV 抗體陽性率為0.7%-3.1%［1］。丙型病毒性肝炎傳染性很強，一旦感染很難治愈，并極易轉(zhuǎn)為慢性肝炎和發(fā)生肝硬化，甚至誘發(fā)肝癌。患者機體免疫狀態(tài)主要通過檢測外周血HCV含量和T淋巴細(xì)胞表達來反映，可用于指導(dǎo)臨床治療。T淋巴細(xì)胞與臨床治療效果有密切關(guān)系，起非常重要的作用，CD28和CD152在CD4+細(xì)胞和CD8+細(xì)胞活化及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中起重要作用［2］。本研究采用流式細(xì)胞儀檢測慢性丙肝患者治療前后外周血T淋巴細(xì)胞表面CD28和CD152水平變化情況，以了解慢性丙肝患者在治療過程中細(xì)胞免疫狀態(tài)的變化，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2011年-07～2013-07在我院診治的慢性丙型肝炎患者40例，其中男性28例，女性12例，平均年齡(28.6±8.5)歲。所有患者均以丙型病毒性肝炎診斷標(biāo)準(zhǔn)(WS213-2008)進行。選我院健康體檢中心40例健康人群作為對照組，研究對象肝功能及生化指標(biāo)均正常，其中男性28例，女性12例，平均年齡(28.3±8.7)歲。排除檢測前引起CD4+、CD8+升高的疾病。兩組患者在性別、年齡方面無明顯差異(P＞0.05)，具有較好的可比性。

1.2 方法

治療前后采集兩組患者的外周血進行CD4+、CD8+T細(xì)胞表面CD28、CD152檢測，檢測觀察組治療前后HCV-RNA陽性變化。

1.2.1 儀器及試劑 儀器:FACSCalibur流式細(xì)胞儀(美國BD公司產(chǎn)品)，實驗數(shù)據(jù)收集分析(BD公司CELLQuest軟件)。Cellpack血細(xì)胞稀釋液(美國Systmex公司)、熒光PCR儀器(美國ABI7000)。試劑:美國CALTAG公司生產(chǎn)的CD4-PECY5、CD8-PE、CD3-APC熒光單克隆抗體;美國 eBioscience公司生產(chǎn)的 CD28-FITC(Clon:CD28.8，Cat:11-0289-73)、CD152-FITC(Clon:14D3，Cat:12-1529-71)、同型對照Mouse IgG1-FITC;中山達安公司生產(chǎn)的HCV-RNA定量檢測試劑。

1.2.2 CD28、CD152檢測過程 兩組研究對象治療前后6個月，均于清晨空腹?fàn)顟B(tài)下采集外周靜脈血3 ml，使用枸櫞酸鈉抗凝后，血樣標(biāo)本在6 h內(nèi)進行測定。使用3個試管分裝每份標(biāo)本，其中A管加入 CD28-FITC 、CD8-PE、CD4-PFCY5、CD3-APC 各 5 μl;B 管加入 CD152-FITC、CD8-PE、CD4-PECY5、CD3-APC 各5 μl;C 管加入 IgG2α -FITC、CD8-PE、CD4-PECY5、CD3-APC 各 5 μl。將標(biāo)本充分混勻后，分別滴加25 μl標(biāo)本于上述A、B試管中，置震蕩器上充分混勻，避光放置15 min;加入溶血素445 μl后充分震蕩，再次避光放置10 min。1 500 r/min離心5 min后棄去上清液，加入生理鹽水2 ml震蕩，1 500 r/min再離心5 min，棄去上清液，加入生理鹽水100 μl，充分震蕩混勻，使用FACSCalibur流式細(xì)胞儀檢測，檢測結(jié)果以±s表示。

1.2.3 HCV-RNA檢測 對觀察組40例患者進行血清HCV-RNA的測定，按照HCV-RNA檢測試劑盒說明書操作，在ABI7000儀器熒光定量PCR檢測儀上檢測。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

使用SPSS19.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行分析，計量資料組間比較使用t檢驗，計數(shù)資料組間比較使用卡方檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 慢性丙型肝炎患者治療前后T細(xì)胞CD28變化情況

觀察組慢性丙型肝炎患者治療前CD4+CD28、CD8+CD28 明顯低于對照組(t=5.317，P=0.000;t=2.257，P=0.027);觀察組患者經(jīng)過治療后CD4+CD28、CD8+CD28 明顯升高(t=4.886，P=0.000;t=8.439，P=0.027);治療后觀察組患者CD4+CD28、CD8+CD28與對照組相比較無明顯差異(t=0.114，P=0.909;t=0.957，P=0.339，見表1)。

表1 慢性丙型肝炎患者治療前后T細(xì)胞CD28變化情況(%，±s)Table 1 Changes of CD28 in patients with chronic hepatitis C before and after treatm ent(%，±s)

表1 慢性丙型肝炎患者治療前后T細(xì)胞CD28變化情況(%，±s)Table 1 Changes of CD28 in patients with chronic hepatitis C before and after treatm ent(%，±s)

與對照組治療前相比較，*P＜0.05;與同組治療前的比較，#P＜0.05

組別n CD4+CD28 CD8+CD28治療前 治療后 治療前 治療后觀察組 40 53.85 ±3.86* 59.44 ±6.12# 15.66 ±3.78* 17.20 ±3.12#對照組 40 59.24 ±5.12 59.28 ±6.48 17.25 ±2.36 17.83 ±2.76

2.2 慢性丙型肝炎患者治療前后T細(xì)胞CD152變化情況

觀察組慢性丙型肝炎患者治療前CD4+CD152明顯高于對照組(t=6.686，P=0.000);CD8+CD152 與對照組無明顯差異(t=0.241，P=0.809);觀察組患者經(jīng)過治療后CD4+CD152明顯降低(t=4.591，P=0.000)，CD8+CD152 無明顯變化(t=0.042，P=0.966);治療后觀察組 CD4+CD152、CD8+CD152與對照相比較無明顯差異(t=0.662，P=0.508;t=0.345，P=0.729，見表 2)。

表2 慢性丙型肝炎患者治療前后T細(xì)胞CD152變化情況(%，±s)Table 2 Changes of CD152 in patients with chronic hepatitis C before and after treatment(%，±s)

表2 慢性丙型肝炎患者治療前后T細(xì)胞CD152變化情況(%，±s)Table 2 Changes of CD152 in patients with chronic hepatitis C before and after treatment(%，±s)

與對照組治療前比較，*P＜0.05;與同組治療前的比較，#P＜0.05

組別n CD4+CD152 CD8+CD152治療前 治療后 治療前 治療后觀察組 40 2.48 ±0.72* 1.72 ±0.76#9.96 ±2.11 9.98 ±2.16對照組40 1.66 ±0.56 1.62 ±0.58 9.85 ±1.97 9.82 ±1.98

2.3 慢性丙型肝炎患者治療前后HCV-RNA變化情況

治療前HCV-RNA陽性率為82.5%(33/40)，治療后為17.5%(7/40)，治療后 HCV-RNA陽性率明顯降低(χ2=31.250，P=0.000)。

3 討論

慢性丙型肝炎是由于體內(nèi)HCV持續(xù)感染誘導(dǎo)機體免疫系統(tǒng)應(yīng)對而產(chǎn)生的免疫耐受狀態(tài)，造成機體清除病毒的能力下降，引起病毒繼續(xù)感染導(dǎo)致的疾?。?］。機體免疫系統(tǒng)能識別侵入機體內(nèi)增殖的HCV，因此，引起一系列的特異性免疫應(yīng)答。病毒特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)在免疫應(yīng)答過程中發(fā)揮極其重要的作用［4］。CD28是T細(xì)胞表面上的一種黏附分子，是免疫球蛋白超家族的重要一員，其主要生物學(xué)活性有:①發(fā)揮共刺激作用，激活T細(xì)胞;②調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的表達和產(chǎn)生;③介導(dǎo)T-B細(xì)胞黏附。CD152與CD28一樣也屬于免疫球蛋白超家族成員，其在結(jié)構(gòu)與氨基酸序列上都有一定的相似性，并有相同的配體B7;CD152(CTLA-4)則通過與CD28競爭性結(jié)合配體B7并給予負(fù)向調(diào)節(jié)信號抑制T細(xì)胞增殖，增加抗原特異的細(xì)胞凋亡，并抑制Thl和Th2細(xì)胞因子的產(chǎn)生［5］。細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞應(yīng)答的強弱是影響HCV清除或者感染持續(xù)的主要因素，慢性丙型肝炎患者均存在免疫功能紊亂，共刺激分子對CD28、CD152在慢性丙型肝炎的T細(xì)胞活化調(diào)節(jié)和功能紊亂中發(fā)揮重要作用?；颊哐錒CV濃度能準(zhǔn)確反映肝組織HCV RNA復(fù)制情況，是機體免疫狀態(tài)的間接反映，可作為抗病毒治療適應(yīng)證選擇及療效預(yù)測因子，而CD28、CD152更能直接反映機體免疫系統(tǒng)狀態(tài)［1］。

本研究結(jié)果顯示，慢性丙型肝炎患者治療前CD4+CD28、CD8+CD28明顯低于對照組，可能原因是外周血中CD28淋巴細(xì)胞在病毒感染等因素作用下向肝組織遷移增多，CD28淋巴細(xì)胞與B7分子結(jié)合形成共刺激信號激活T細(xì)胞。提示，慢性丙肝T細(xì)胞的激活受到抑制，不能有效清除體內(nèi)HCV，導(dǎo)致病毒在體內(nèi)持續(xù)復(fù)制，導(dǎo)致治療效果不佳［6］。治療后CD4+CD28、CD8+CD28明顯升高，說明肝組織內(nèi)HCV感染明顯減少，免疫反應(yīng)減弱，外周血中CD28向肝組織遷移減少［7］。提示，機體進入免疫平衡狀態(tài)。另外，本研究結(jié)果也顯示，慢性丙型肝炎患者治療前CD4+CD152明顯高于對照組，而CD8+CD152無明顯變化?？赡茉蚴钱?dāng)CD28的表達水平升高時，會導(dǎo)致CD152表達短暫升高。經(jīng)過治療后，CD4+CD152明顯降低，CD8+CD152無明顯變化，提示負(fù)調(diào)節(jié)受到抑制，細(xì)胞免疫功能增強。感染初期HCV復(fù)制活躍，HCV-RNA陽性率高，CD8+CD28T細(xì)胞表達比較低，肝組織病變輕微，隨著CD8+CD28T細(xì)胞表達增強破壞HCV感染的肝細(xì)胞，肝組織病變嚴(yán)重，HCV 復(fù)制水平降低［8，9］。

綜上所述，外周血T細(xì)胞CD28、CD152水平變化，更能準(zhǔn)確判斷慢性丙型肝炎患者HCV RNA復(fù)制情況、肝臟損傷程度及免疫系統(tǒng)狀態(tài)，為指導(dǎo)臨床慢性丙型肝炎抗病毒治療和免疫治療提供參考依據(jù)。

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