一種球蚧類蚧蟲基因組DNA 的提取方法

李惠萍，王靜慧，張龍霞，劉海峰，劉曉琳

(山西出入境檢驗檢疫局，太原 030024)

球蚧類蚧蟲在分類學上屬于蚧科(Coccidae)，因其雌成蟲在發(fā)育過程中蟲體膨大成半球狀并變硬，而被歸為球蚧類(湯祊德，1991)。球蚧類雌成蟲發(fā)育前期蟲體較扁，易于制作玻片標本，形態(tài)比較規(guī)則，鑒定特征明顯(湯祊德，1991)，但此期較短，甚至只有幾天，因此樣本的獲得變得困難;發(fā)育中期蟲體體壁鼓起成半球狀，有些種類高達14 mm;發(fā)育后期蟲體皺縮干枯，變脆變硬，甚至木質(zhì)化，幾乎不能用來制作標本，實現(xiàn)對種類的鑒定(謝映平，1998)。

目前，生物技術(shù)已越來越廣泛地運用于生物領(lǐng)域，已開始從分子水平上探討物種進化以及相似種的鑒定。在蚧蟲的系統(tǒng)進化方面，國外科學家在功能基因，親本起源和協(xié)同進化等方面進行了部分研究，也有運用分子標記做蚧蟲近似種的區(qū)分或復(fù)合種鑒別(Rung et al.，2008;Edwards et al.，2008;Provencher et al.，2005)，Park 等(2011)對粉蚧和盾蚧兩科的蚧蟲進行了DNA 條碼數(shù)據(jù)的研究。在我國，蚧蟲分子系統(tǒng)學研究剛剛起步，僅高寶嘉等(2007)采用RAPD 技術(shù)測定分析了河北省皺大球蚧和瘤堅大球蚧8個地理種群的遺傳結(jié)構(gòu)。馬力等(2007)篩選出了適合蚧蟲DNA 擴增的引物“AGAGGTGGGCAGGTG”。

基因組DNA 的提取是任何分子學研究的前提，因此許多研究致力于建立快速、穩(wěn)定地提取高質(zhì)量基因組方法。果蠅、瓢蟲、蝗蟲等大型昆蟲，因材料易取，運用常規(guī)提取方法(SDS)或改進的提取方法或提取試劑盒即可完成基因組DNA的提取(Harrison 1987;Taylor，1993;代金霞等，2004)，對于小型昆蟲如蚧蟲，因其活動器官嚴重退化，只剩下膜質(zhì)或革質(zhì)或木質(zhì)化的體壁和體液，使得其基因組的提取難度加大。因此國內(nèi)外學者正努力嘗試多種提取方法來獲得基因組，如采用試劑盒方法(Edwards et al.，2008;Provencher et al.，2005)，sunnucks 鹽析法(Morse et al.，2006)，silica 方法或玻璃纖緯方法替代了酚氯仿抽提(Park et al.，2011)，CTAB 和NaCL 方法(石晶等，2005)等等均有報道。

但這些報道大多是對盾蚧和粉蚧的研究，材料常選擇高濃度酒精浸泡的新鮮蟲體。石晶等(2005)和高寶嘉等(2007)對棗大球蚧和皺大球蚧的研究中，同樣選擇了新鮮蟲體試驗，而且對于材料的前處理過程描述不多或簡單。這些方法在蚧蟲分子研究的實際應(yīng)用中會有些限制，如材料不一定新鮮，或用常規(guī)濃度的酒精固定的樣本，或遇到特殊的體壁極其硬化甚至木質(zhì)化的球蚧類蚧蟲。那么材料前處理是否成為解決基因組提取的關(guān)鍵環(huán)節(jié)也有待研究。本文嘗試在材料的選擇和前處理過程兩個關(guān)鍵環(huán)節(jié)進行試驗，并進行SDS、CTAB、TES、NaCl 和TNES 五種提取方法的篩選，旨在獲得一種適合球蚧基因組DNA 提取的有效方法。

1 材料與方法

1.1 材料

本實驗以棗大球蚧 Eulecanium gigantea(Shinji)、皺大球蚧Eulecanium kuwanai(Kanda)、盔蚧屬一種 Saissetia sp.、沙里院褐球蚧Rhodococcus sariuoni Borchsenius、朝鮮毛球蚧Didesmococcus koreanus Borchsenius、扶桑綿粉蚧Phenacoccus solenopsis Tinsley、白蠟綿粉蚧Phenacoccus fraxinus Tang 和桔小粉蚧Pseudococcus cryptus Hempel 為研究對象(表1)。所有標本的成蟲都經(jīng)準確的鑒定，供試材料置于-20℃冰箱中保存待用。

表1 供試的蚧蟲種類一覽表Table 1 The list of scale insect species for testing

1.2 試劑及儀器

1.2.1 試劑:

CTAB、EDTA、TRIS 購自上海索萊寶生物科技有限公司;蛋白酶K、RNA 酶購自Takala 寶生物工程(大連)有限公司;Agarose 購自Invitrogen公司;β-巰基乙醇購自美國Amresco。

1.2.2 儀器:

EYEL4 恒溫水槽(日本)、Miniplus 離心機(德國Eppendorf)、Bio-RAD Power Pac 300 電泳系統(tǒng)(美國伯樂)、GENE GENIUS 全自動凝膠成像分析系統(tǒng)(英國Syngene)、微量紫外分光光度儀(德國jena)。

1.3 樣品采集和保存

采集球蚧樣品時，一部分用75%酒精溶液直接固定，盡快置于-4℃冰箱保存，一部分連同寄主枝干一起采回。盡快將采回的樣品在室內(nèi)剝離寄主置-20℃冰箱冷凍保存。本實驗所用樣品大都在此條件下保存1-3年。

1.4 基因組提取前的樣品選擇和清洗

本實驗選擇不同的樣品材料，一是整頭蟲體，二是蟲體外骨髂，即表皮。試驗前，對于整頭蟲體的材料須進行顯微檢查，選擇單頭非寄生的蟲體，用100%酒精清洗至蟲體表面干凈，再用蒸餾水浸泡清洗三次，每次浸泡30 min，自然晾干;對于蟲體外骨骼的材料，同樣要用100%酒精清洗干凈體內(nèi)物質(zhì)，再用蒸餾水洗滌4-5 次，涼干待用。

1.5 基因組提取第一步驟樣品磨碎處理改進

本實驗將選擇好的樣品材料放入1.5 mL 離心管中，分別加入 SDS、CTAB、TES、NaCL 和TNES 法的提取緩沖液或裂緩沖液以剛剛淹沒材料，始終保持在冰上剪碎。

1.6 基因組提取的隨后步驟按SDS、CTAB、TES、NaCl 和TNES 法分別進行

1)SDS 法(童麗娟等，2002)

在本文1.5 剪碎樣品的EP 管中，補加入SDS法裂解緩沖液(100 mmol/L NaC1，10 rnmol/L Tris-HCl，50 mmol/L EDTA，0.5% SDS，蛋白酶K100 ug，0.2% β-巰基乙醇)至400μL，65℃水浴1 h。室溫下，12000 r/min 離心10 min。取上清液加入300μL 飽和NaC1 溶液混勻，12000 r/min離心10 min。取上清液移加等體積異丙醇，輕輕混勻后置-20℃冰箱1 h。在4℃下，12000 r/min離心15 min。棄液體，用70%酒精洗滌沉淀，待完全干燥后加適量TE 溶解DNA，4℃或-20℃保存待用。

2)CTAB 法(Boyce T.M.等，1989)

在本文1.5 剪碎樣品的EP 管中，補加入CTAB 法提取緩沖液(Tris-HC1 100 mmol/L，20 mmol/L EDTA，1.4 mol/L NaC1，0.2% β-巰基乙醇，50 mmol/L CTAB，pH 8.3)至400μL，65℃水浴1 h。加入等體積酚:氯仿:異戊醇(25∶24∶1)，12000 r/min 離心10 min。取上清加入等體積的氯仿:異戊醇(24∶1)，12000 r/min離心10 min。取上清加入等體積預(yù)冷的異丙醇，輕輕混后置-20℃ 沉 淀 1 h，4℃，12000 r/min離心15 min。棄液體，用500μL 70%乙醇溶液洗滌DNA，4℃，12000 r/min 離心1 min。棄液體，待完全干燥后，加入適量TE 溶解，4℃或-20℃保存待用。

3)TES 法(張敏等，2008)

在本文1.5 mL 剪碎樣品的EP 管中，補加入TES 法提取沖液(100 mmol/L Tris-HCl，1.4 mol/L NaCl，20 mmol/L EDTA，pH8.0，l%SDS，0.2 mg/mL 蛋白酶K)至400μL，55℃水浴10 h。加入等體積飽和酚，顛倒混勻，12000 r/min離心10 min。取上清，加入等體積的酚:氯仿:異戊醇(25∶24∶1)，12000 r/min 離心10 min。取上清加入等體積的氯仿:異戊醇(24∶1)，12000 r/min 離心10 min。取上清液加入2 倍體積預(yù)冷的無水乙醇，-20℃沉淀1 h，4℃，12000 r/min離心15 min。棄液體加500μL 70%乙醇溶液，洗滌DNA，4℃，12000 r/min 離心1 min。棄液體，待完全干燥后，加入適量TE 溶解，4℃或-20℃保存待用。

4)NaCl 法(石晶等，2005)

在本文1.5 mL 剪碎樣品的EP 管中，補加入NaCl 法提取緩沖液(10 mmol/L Tris-HCI，pH 8.0，100 mmol/LNaCl，1 mmol/L EDTA)至400μL，加90-100μL 10%SDS、4-5 uLRNA酶，37℃水浴1 h。加4-5μL 蛋白酶K，55℃消化6-12 h 或者過夜消化，12000 r/min 離心10 min。取上清，加6 mol/L NaCl 溶液600μL，12000 r/min 離心30 min。取上清加2 倍體積預(yù)冷的無水乙，-20℃冰箱靜 1 h，4℃，12000 r/min離心15 min。棄液體加500μL 70%乙醇溶液洗滌DNA，4℃，12000 r/min 離心1 min。棄液體，待完全干燥后，加入適量TE 溶解，4℃或-20℃保存待用。

5)TNES 法(Paul Sunnucks 等，1996)

在本文1.5 剪碎樣品的EP 管中，補加入TNES 法提取緩沖液(50 mmol/L Tris-HCI，pH 8.0，400 mmol/L NaCl，20 mmol/L EDTA，0.5 %SDS)至300 ul，加入0.1 mg/mL 蛋白酶K，37℃中水浴8 h。加入5 mol/L 氯化鈉溶液85μL，劇烈搖晃20 s，13000 r/min 離心10 min。取上清，加入2 倍體積預(yù)冷的無水乙醇，輕輕混勻后置于-20℃冰箱中沉淀1 h，4℃ 12000 r/min 離心15 min。棄液體加入500μL 70% 乙醇溶液洗滌DNA，4℃，12000 r/min 離心1 min。棄液體，加入適量TE 溶解，4℃或-20℃保存待用。

1.7 基因組DNA 檢測

用1%瓊脂糖凝膠、1×TAE 電泳緩沖液檢測所提取的DNA，各取5μL;電壓120 V，室溫下電泳30-45 min，EB 染色，用凝膠成像系統(tǒng)拍照分析。用微量紫外分光光度儀測定OD260nm和OD280nm，以O(shè)D260nm/OD280nm比值分析DNA 的純度。

1.8 PCR 擴增

對運用CTAB 法提取的球蚧基因組DNA，采用C.Simon 等(1994)報道的mtDNA 中COⅠ和CO Ⅱ通用引物 C1-J-2753ywr(5'-GTAAACCTAACATTTTTYCCWCARCA-3')和C2-N-3662(5'-CCACAAATTTCTGAACATTGACC-3')進行PCR 擴增。

擴增體系:Taq DNA 聚合酶0.25μL、10×Buffer 5μL、dNTP 4μL、上游引物1μL、下游引物1μL，模板5μL，ddH2O 補足50μL。擴增條件:94 ℃3 min 后，按94 ℃，1 min;50-40℃(-2℃/1 cycle)，1 min;72 ℃，2 min 進行33個循環(huán)，72 ℃，10 min。4℃保存。

PCR 擴增結(jié)束后取6μL 擴增產(chǎn)物與溴酚藍混勻，以1×TAE 緩沖液、1%瓊脂糖凝膠電泳，附帶Marker 檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品保存方式對結(jié)果影響

實驗結(jié)果表明，球蚧類蚧蟲材料無論是冷凍保存還是75%酒精固定液-4℃保存均可完成基因組的提取。

2.2 材料處理方式對結(jié)果影響

實驗結(jié)果表明，對于球蚧類蚧蟲，蟲體體壁更容易提取出全基因組。表2 給出用五種蚧蟲整蟲提取的DNA OD 值為1.3-1.5，而用體壁提取的DNA OD 值為1.7-1.8。顯然選擇蚧蟲體壁作為提取材料，更適全基因組的獲得。

表2 用不同材料提取DNA 的OD 值Table 2 OD value of genomic DNA from different samples

2.3 樣品磨碎處理方式對結(jié)果影響

實驗結(jié)果表明，用剪刀剪碎的方式更適合球蚧類蚧蟲的基因組的提取，實驗過程中不難發(fā)現(xiàn)，球蚧類蚧蟲的外骨骼木質(zhì)化，有韌性，研磨杵很難將其分開磨碎。

2.4 選擇冷凍保存的樣品材料或75%酒精保存的材料，取用蟲體體壁，經(jīng)冷凍剪碎后再通過SDS、CTAB、TES、NaCL 和TNES 法比較提取結(jié)果

圖1 五種方法提取基因組的電泳圖Fig.1 The electrophorgram of genomic DNA abstracted using SDS、CTAB、TES、NaCL and TNES methods

由圖1 可知，CTAB 法、TES 法和TNES 法對五種球蚧均可提出較為完整的基因組，而用SDS法和NaCl 法對棗大球蚧則沒能獲得基因組。同時結(jié)果表明TES 和TNES 法獲得的基因組DNA 混有或多或少蛋白質(zhì)、色素或RNA，而CTAB 法提取的基因組DNA 主條帶清晰整齊，無拖尾降解現(xiàn)象，DNA 純度很高。

總體來看，材料選擇和樣品前處理方法對后續(xù)的基因組提取至關(guān)重要，本研究所嘗試的以球蚧體壁作為提取材料及運用剪碎的樣品處理方法，更是五種后續(xù)提取方法得以成功獲得基因組DNA的關(guān)鍵所在，圖1 也可看出，除棗大球蚧外，其它球蚧運用這五種方法，均獲得了基因組，只是基因組的純度有差異而已，完全可通過修改純化步驟來改進。

2.4 對CTAB 法提取的基因組進行PCR 擴增結(jié)果

圖2 五種球蚧基因擴增電泳圖Fig.2 Gene amplification electrophorgram of five scale insect species

經(jīng)過后續(xù)驗證試驗，表明利用CTAB 法提取的五種球蚧基因組DNA 擴增的目的片段穩(wěn)定，且擴增條帶單一、亮度高，顯然CTAB 法提取球蚧基因組DNA 的效果非常好。

3 結(jié)論與討論

用于分子試驗的生物樣本，采用冷凍低溫保存是目前最好的保存方法，無水乙醇保存方法也是有效的，但不宜長期保存(李夢，2006)，用福爾馬林常溫浸泡和75%酒精常溫密封保存的昆蟲數(shù)周后也可用于分子試驗(林萬華等，2006)。本試驗表明，用75%酒精密封-4℃可保存較長時間，甚至達到冷凍低溫保存的時間和效果。但在試驗前，樣本必須經(jīng)過蒸餾水充分洗滌，以置換樣本體內(nèi)酒精，消除酒精對后續(xù)實驗的影響。同時75%酒精溶液保存樣本的方法是常規(guī)的生物學方法，便于野外采集標本的保存和運輸，更有利于生物學研究和分子學研究的進一步開展。

基因組提取的關(guān)鍵步驟是材料的破碎，對小型昆蟲的破碎，大多數(shù)文獻報道采用勻漿棒搗碎或者研碎，但對于蚧蟲，由于蟲體極小，在提取緩沖液中容易漂浮;且體壁韌性大，不易搗碎或研碎。同時如果搗碎或研碎的時間太長會使基因組降解。當然也有利用液氮研磨以及超聲破碎的(安瑞生等，2002)，但這兩種方法卻不適合球蚧類蚧蟲體壁的研碎，且因蟲體小，液氮研磨后，材料粘壁，不易收集。本實驗將蚧蟲放入裝有提取緩沖液的離心管中置于-20℃冰箱中冷凍，然后用預(yù)冷的小剪刀在冰上剪碎，既解決了蟲體在提取緩沖液中漂動的問題，又使得基因組不易被自身的核酸酶降解。

本實驗在對球蚧進行基因組DNA 提取過程中，發(fā)現(xiàn)有很多色素和蛋白質(zhì)，這就給如何獲得高質(zhì)量的DNA 帶來了困擾。五種提取方法比較表明，CTAB 法的去除效果最好。但DNA 損失較大。另外，我們也嘗試運用試劑盒(Qiagen Dneasy tissue kit)進行了試驗，發(fā)現(xiàn)對于體壁硬化的球蚧類，無法提取出基因組，而對于膜質(zhì)的粉蚧類，可以提取出來，這跟國外大多數(shù)文獻報道相一致(Edwards et al.，2008;Provencher et al.，2005)。但蚧蟲種類多，結(jié)構(gòu)差異也大，不會有固定的提取方法，還需大量的試驗來建立相關(guān)類群的有效提取方法。

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