長木蜂蜂糧中10-羥基-2-癸稀酸測定及功能活性研究

賀春玲，張淑霞，嵇保中

(1.河南科技大學林學院，河南洛陽 471003;2.河南出入境檢驗檢疫局，河南洛陽 471000;3.南京林業(yè)大學森林環(huán)境學院，南京 210037)

10-羥基-2-癸烯酸((E)-10-hydrox-2-decylenic acid，簡稱10-HDA)又稱王漿酸，是一種不飽和脂肪酸，是蜂王漿中含有的特殊高效生物活性物質(zhì)(陳盛祿，2001;洪梅和史伯倫，2001;劉曉華和孫文基，2004)。10-HDA 主要由蜜蜂工蜂的上顎腺分泌，另外，從不同蜂產(chǎn)品中也檢測到10-HDA 的存在，意大利蜜蜂幼蟲體內(nèi)含有少量的10-HDA(李全陽，1999);蜂膠中10-HDA 平均含量為0.22%(潘建國等，2005)。從微生物中選育出產(chǎn)10-HDA 菌株，并通過改良產(chǎn)10-HDA 能力不穩(wěn)定的微生物菌株，提高其產(chǎn)10-HDA 的能力(王騰飛等，2006;王海燕，2008)。10-HDA 有多種生理活性，它具有抗菌、滅菌、強壯機體和強烈抑制淋巴癌、乳腺癌等多種癌細胞的作用，還有增強機體免疫功能等功能(Townsend et al.，1960;倪輝等，2006;賀春玲等，2007;王文鳳等，2007;黃盟盟，2010;陶文卿，2012)。袁耀東(1991)報道工蜂在采集花粉過程中，向花粉粒中分泌10-HDA，使花粉迅速喪失了發(fā)芽力。

在蜂糧釀制過程中，蜂糧中的花粉會很快失去萌發(fā)力，從而提高蜂糧的保質(zhì)期。蘇松坤等(2002)采用氯化三苯基四氮唑(TTC)花粉活性測定法測定蜜蜂茶花粉蜂糧樣品中花粉粒的活力。隨釀制時間的延長花粉逐漸失去活力，在第5 d 花粉生活力完全失去活性。文獻報道蜂糧中花粉失去萌發(fā)力是因為在蜜蜂釀貯蜂糧的過程中加入了唾腺分泌物10-HDA，在10-HDA 的作用下花粉粒很快喪失了發(fā)芽力(袁耀東，1991);10-HDA對植物的花粉萌發(fā)、花粉管伸長和生殖核的有絲分裂有強烈的抑制作用(許雅香等，2000);但是，茶花粉蜜蜂蜂糧中沒有檢測到10-HDA(蘇松坤，2000)。賀春玲等(2010)報道長木蜂Xylocopa tranquebarorum 蜂糧在釀制過程中花粉活力隨釀制時間延長而逐漸失去活力，在1 日齡蜂糧中花粉活力相比手采花粉明顯下降，3 日齡后均失去萌發(fā)力，并且不同的花粉蜂糧其花粉活力表現(xiàn)一致，本文為進一步明確長木蜂蜂糧中有無10-HDA的存在及其擔負的功能進行研究。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 長木蜂蜂花粉和蜂糧樣品

在南京情侶園花卉公園采集芍藥長木蜂蜂糧。芍藥花粉蜂糧的采集方法同賀春玲等(2010)。

1.1.2 不同植物花粉的采集

2008年3月下旬至2008年5月下旬，在南京情侶園花卉公園，在植物的盛花期采集已經(jīng)盛開的植物花粉(長木蜂釀貯蜂糧盛期采訪植物的新鮮花粉)，用無菌的鑷子取其花粉放入滅菌的5 mL離心管中，低溫條件下帶回實驗室，4℃保存?zhèn)溆?。主要采集的植物花粉?二月蘭Orychophragmus violaceus、紫藤Wisteria sinensis、芍藥Paeonia lactiflora。

1.1.3 試劑和儀器

試劑:10-羥基-2-癸烯酸(中國藥品生物制品鑒定所)。

儀器:多功能型全自動菌落/顯微圖像分析儀(杭州迅數(shù)科技有限公司);

1.2 方法

1.2.1 芍藥花粉、芍藥長木蜂花粉和不同日齡的蜂糧樣品處理

稱取芍藥花粉、不同時間(2007年和2008年)的芍藥長木蜂蜂糧樣品各0.2 g，分別放入甲醇溶液中用玻璃勻漿器研磨，研磨后的樣品放入10 mL 的離心管中，用無水甲醇定容至5 mL，超聲提取10 min，以10000 r/min 離心10 min，取上清液;連續(xù)離心三次，合并上清液，用氮吹儀揮去甲醇，待測定用。

1.2.2 標準品處理和色譜條件

標準品:稱取0.0067 g 10-HDA 對照品，用色譜甲醇溶解至0.5 mL，再取20μL 稀釋100 倍后備用。

樣品:提取的樣品用色譜甲醇定溶至0.5 mL，

高效液相色譜柱:Zorbax SB C18 150×4.6，3.5μm;采用反相液相色譜，流動相:水(0.1%TFA)∶甲醇(7∶3);柱溫:室溫;檢測波長:213 nm;流速:0.8 mL/min;進樣量:標準品為1 mL，樣品為20 mL;采用外表法定量，內(nèi)標法定性。

1.2.3 10-HDA 對花粉萌發(fā)的抑制作用

營養(yǎng)液為20%蔗糖+0.01%硼酸。在培養(yǎng)液內(nèi)添加HDA，配成1250μg/mL、625μg/mL、312.5μg/mL、156.2μg/mL、78.1μg/mL 五個濃度梯度。將配制好的不同濃度梯度的培養(yǎng)液用移液槍取200μL 滴人滅菌凹面載玻片的凹槽內(nèi)，將不同樣品的花粉均勻地灑在培養(yǎng)液上，放在無菌的培養(yǎng)皿中，25℃恒溫箱內(nèi)保濕培養(yǎng)12 h，觀察不同時間花粉萌發(fā)和花粉管生長情況，統(tǒng)計萌發(fā)率。每處理2個重復，每個重復隨即觀察5個視野。兩次重復的平均值為該處理的抑制率。抑制率=(對照組萌發(fā)率-處理組的萌發(fā)率)/對照組的萌發(fā)率×100%

1.3 數(shù)據(jù)采集與分析

采用多功能型全自動菌落/顯微圖像分析儀(杭州迅數(shù)科技有限公司生產(chǎn))進行數(shù)據(jù)采集;采用Microsoft Excel 和SPSS Base Ver.13.0 統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 蜂糧中10-HDA 的測定

10-HDA 標準品在恒溶劑系統(tǒng)中保留時間為8.367 min，蜂糧樣品在8.365 min 時出現(xiàn)一個峰，并且通過內(nèi)標法顯示在標準品和蜂糧樣品混合樣品中在8.379 min 時出現(xiàn)一個峰，在該峰的前后沒有其它峰，初步確定在蜂糧樣品中有10-HDA 的存在。同樣的方法，在芍藥花粉中沒有檢測到10-HDA(圖1)。

圖1 蜂糧中10-HDA 的HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of 10-HDA content in bee bread

2.2 10-HDA 對花粉萌發(fā)的抑制作用

2.2.1 10-HDA 對二月蘭花粉的抑制作用

10-HDA 對二月蘭花粉的萌發(fā)有非常顯著的抑制作用，在含有156.25μg/mL 10-HDA 的培養(yǎng)液上，其抑制率達70%以上，10-HDA 抑菌率幾率值與濃度對數(shù)之間的線性方程為y=1.6154x+1.8141(r2=0.9891)，EC50為93.81μg/mL(表1)。

2.2.2 10-HDA 對紫藤花粉的抑制作用

10-HDA 對紫藤花粉的萌發(fā)有顯著的抑制作用，在含有625μg/mL 10-HDA 的培養(yǎng)液上，其抑制率達76%以上，10-HDA 抑菌率幾率值與濃度對數(shù)之間的線性方程為y=1.7953x+1.0923(r2=0.9301)，EC50為150.18μg/mL(表2)。

表2 10-HDA 對紫藤花粉萌發(fā)的影響Table 2 The effect of 10-HDA on the pollen germination ratio of Wisteria sinensis

2.2.3 10-HDA 對芍藥花粉的抑制作用

10-HDA 對芍藥花粉的萌發(fā)有明顯的抑制作用，在含有312.5μg/mL 10-HDA 的培養(yǎng)液上，其抑制率接近70%，10-HDA 抑菌率幾率值與濃度對數(shù)之間的線性方程為y=1.6592x+1.4881(r2=0.9871)，EC50為130.81μg/mL(表3)。

2.3 10-HDA 對不同花粉的花粉管生長的影響

10-HDA 對二月蘭、紫藤、芍藥花粉的花粉管生長均有明顯的抑制作用(表4)。在供試的10-HDA濃度梯度下，隨著10-HDA 濃度的增加對花粉管的生長抑制表現(xiàn)明顯;對不同花粉的花粉管生長的抑制作用不同，二月蘭花粉的花粉管生長情況表現(xiàn)為10-HDA 各處理和對照之間表現(xiàn)出明顯差異，而不同10-HDA 濃度梯度之間花粉管的生長沒有顯著差異;紫藤花粉和芍藥花粉的花粉管生長情況均表現(xiàn)為10-HDA 各處理和對照之間有明顯差異，且10-HDA 不同濃度梯度之間花粉管的生長也有顯著差異。

表3 10-HDA 對芍藥花粉萌發(fā)的影響Table 3 The effect of 10-HDA on the pollen germination ratio of Paeonia lactiflora

表4 10-HDA 對不同花粉樣品花粉管生長的影響Table 4 The effect of 10-HDA on the pollen tube growth of different pollen samples

3 結(jié)論與討論

10-HDA 主要分泌于蜜蜂工蜂的上顎腺。不同日齡的工蜂上顎腺分泌10-HAD 的能力不同，剛出房的工蜂上顎腺中含量極微，隨著日齡的增加，含量有增加的趨勢，15-20 日齡哺育蜂的上顎腺中含量最高，20 日齡以后開始有降低的趨勢，在蜂群大繁殖期含量極高，而外勤蜂上顎腺中的10-HDA 含量則極低(李全陽，1999;荊戰(zhàn)星，2010);長木蜂屬于野生蜜蜂，雌蜂沒有職能上的分工，越冬的雌蜂擔負筑巢、采集花粉制作蜂糧并產(chǎn)卵(賀春玲等，2009)。在研究過程中，我們解剖長木蜂雌蜂的上顎腺和咽下腺，并初步采用高效液相法測定10-HDA 的有無，結(jié)果在上顎腺沒有檢測到10-HDA，而在咽下腺中檢測到10-HDA，因檢測結(jié)果與蜜蜂的研究結(jié)果不同，還有待進一步進行測定和驗證。在解剖不同日齡的長木蜂雌蜂腺體，也發(fā)現(xiàn)腺體的飽滿程度有區(qū)別，其分泌活性有無差別還有待進一步研究。不同花源的蜂王漿樣品中10-HDA 的含量也不同(羅莉萍等，2006)，是否因為不同地區(qū)蜜源不同對蜜蜂工蜂分泌能力有影響，也有待進一步研究。

蜜蜂在采集花粉上分泌唾腺分泌物，唾腺分泌物中含有的王漿酸(10-羥基-2-癸烯酸)，使花粉迅速喪失發(fā)芽力(袁耀東，1991)。但蘇松坤(2000)在茶花粉蜜蜂蜂糧中未檢測到10-HDA，花粉活力隨蜂糧釀制過程而迅速失去活力。賀春玲等(2010)測定紫藤花粉的長木蜂蜂糧和芍藥花粉的長木蜂蜂糧中的花粉活力，測定結(jié)果表明在1 日齡蜂糧中花粉活力明顯下降，3 日齡后均失去萌發(fā)力，并且不同的花粉蜂糧其花粉活力表現(xiàn)一致。本文采用高效液相色譜法檢測到芍藥花粉中沒有10-HDA，長木蜂蜂糧有10-HDA。通過采用10-HDA 的標準品在不同濃度下對花粉萌發(fā)抑制作用測定結(jié)果看，發(fā)現(xiàn)10-HDA 對花粉萌發(fā)和花粉管生長起到抑制作用，初步推測長木蜂蜂糧中花粉萌發(fā)的抑制作用與10-HDA 的存在有關(guān)。長木蜂蜂糧中抑制花粉萌發(fā)的因素還有待進一步研究。長木蜂屬于野生蜂類，10-HDA 的分泌能力以及分泌場所與家養(yǎng)蜜蜂是否一致，還有待進一步研究。關(guān)于家養(yǎng)蜜蜂和野生蜜蜂腺體活性成分之間的差異未見文獻報道，有待在后續(xù)的研究工作中通過可靠的理論去證實。

References)

Chen SL.The Apicultural Science in China［M］.Beijing:China Agriculture Press.2001，727-732.［陳盛祿.中國蜜蜂學［M］.北京:中國農(nóng)業(yè)出版社.2001，727-732］

Hang MM.Fresh preservation effect of 10-HDA to plasm wheat beer［D］.Master Dissertation of Shandong Polytechnic University，2010:1-66.［黃盟盟.10-HDA 對原漿小麥啤酒的保鮮作用［D］.山東輕工業(yè)學院碩士學位論文，2010，1-66］

He CL，Ji BZ，Liu SW，et al..Progress and prospects in research of 10-Hydroxy-z-Decenoic acid［J］.Chinese Agricultural Science Bulletin，2007，23(6):227-231.［賀春玲，嵇保中，劉曙雯，等.10-羥基-2-癸烯酸的研究進展［J］.中國農(nóng)學通報，2007，23(6):227-231］

He CL，Ji BZ，Liu SW.Determination of pH and the pollen germination ability during the process from pollen to bee bread of Xylocopa tranquebarorum(Swederus)［J］.Journal of Environmental Entomology，2010，32(1):78-84.［賀春玲，嵇保中，劉曙雯.長木蜂蜂糧釀貯過程中pH 和花粉活力的測定［J］.環(huán)境昆蟲學報，2010，32(1):78-84］

Hong M，Shi BL.Royal Jelly and 10-HDA［J］.Journal of Bee，2001，(6):22-23.［洪梅，史伯倫.蜂王漿與10-羥基癸烯酸［J］.蜜蜂雜志，2001，(6):22-23］

Jing ZX.The study compared the differences of 10-HDA secreted and gland proteins of Apis mellifera worker at different ages［D］.Master Dissertation of Fujian Agriculture and Forestry University，2010，1-50.［荊戰(zhàn)星.意大利蜜蜂工蜂上顎腺10-HDA 分泌規(guī)律及腺體蛋白研究［D］.福建農(nóng)林大學碩士學位論文，2010，1-50］

Li QY.Study on 10-HDA change rule of Apis mellifera larvae［J］.Apiculture of China，1999，50(5):5-6.［李全陽.意大利蜂幼蟲體內(nèi)10-HDA 變化規(guī)律的研究［J］.中國養(yǎng)蜂，1999，50(5):5-6］

Liu XH，Sun WJ.Development situation of royal acid research［J］.Drug Standards of China，2004，5(1):9-10.［劉曉華，孫文基.王漿酸的研究進展概況［J］.中國藥品標準，2004，5(1):9-10］

Luo LP，Zhou SQ，Yu WS.Detmnination of 10-HDA in different royaljelly by HPLC［J］.Journal of Anhui Agi.Sci.，2006，34(18):4532-4533.［羅莉萍，鄒盛勤，余無雙.HPLC 測定不同蜜源中10-HDA 的含量［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學，2006，34(18):4532-4533］

Ni H，Yang YF，Peng Y.Advancement of studies on 10-HDA of Royal Jelly［J］.Apiculture of China，2006，57(3):9-10.［倪輝，楊遠帆，彭鶯.蜂王漿中10-HDA 的研究進展［J］.中國蜂業(yè)，2006，57(3):9-10］

Pan JG，Zheng RL，Duan Y，et al.Determination of the 10-HDA in propolis［J］.Apiculture of China，2005，56(10):4-5.［潘建國，鄭堯隆，段怡，等.蜂膠中10-羥基-2-癸烯酸的含量測定［J］.中國養(yǎng)蜂，2005，56(10):4-5］

Su SK.Studies on brew mechanism and nutritive value of bee bread［D］.Master Dissertation of Zhejiang University，2000.［蘇松坤.蜂糧的釀制機理和營養(yǎng)價值的研究［D］.浙江大學碩士學位論文，2000］

Tao WQ.Study on inhibition mechanism of 10-HDA to E.Coli［D］.Master Dissertation of Shandong Institute of Light Industry，2012，1-65.［陶文卿.10-HDA 對大腸桿菌抑制機理的研究［D］.山東輕工業(yè)學院碩士學位論文，2012，1-65］

Townsend GF，Morgah JF，Tolnai S，et al.Studies on the in vitro antitumor activity of fatty acids.Ⅰ10-hydroxy-2-decenoic acid from royal jelly［J］.Cancer Research，1960，20:503-510.

Wang HY.Improvement and fermentation control of strains for producing 10-hydroxyl-2-decenoic acid［D］.Master Dissertation of Shandong Institute of Light Industry，2008，1-65.［王海燕.產(chǎn)10-HDA 菌株的改良及發(fā)酵調(diào)控［D］.山東輕工業(yè)學院碩士學位論文，2008，1-65］

Wang TF，Wang RM，Guo LM，et al.The screening of strains for producing 10-hydroxy-2-decenoic Acid［J］.Modern Food Science and Technology，2006，22(1):17-19.［王騰飛，王瑞明，郭利美，等.10-HDA 微生物菌株的選育［J］.現(xiàn)代食品科技，2006，22(1):17-19］

Wang TF，Wang RM.Preliminary study on antimicrobial action of 10-HDA［J］.Journal of Shandong Institute of Light Industry，2009，23(3):17-18/24.［王騰飛，王瑞明.10-HDA 抗菌實驗的初步研究［J］.山東輕工業(yè)學院學報，2009，23(3):17-18/24］

Wang WF，Mei LY，Xu L，et al.Study on antimicroblal action of 10-HDA［J］.Food Research and Development，2007，28(10):36-38.［王文風，梅英杰，徐玲，等.10-HDA 抗菌實驗的初步研究［J］.食品研究與開發(fā).2007，28(10):36-38］

Wang WF，Xu L，Wang HY.Rasearch and application of 10-HDA［J］.Food Science and Technology，2007，32(5):270-273.［王文鳳，徐玲，王海燕，等.10-HDA 的研究與應(yīng)用［J］.食品科技，2007，32(5):270-273］

Xu YX，Liu YH.Research on the physiological and pharmacological effects of royal jelly［J］.Blology Teaching，2000，25(7):8-10.［許雅香，劉艷荷.蜂王漿生理藥理作用研究現(xiàn)狀［J］.生物學教學，2000，25(7):8-10］

Yuan YD.The composition and function of bee bread.Apiculture of China，1991，(6):36-37.［袁耀東.蜂糧的成分和作用［J］.中國養(yǎng)蜂，1991，(6):36-37］