HPLC-ELSD法測定冰酒中的糖類含量

王運(yùn)照，胡文忠，李婷婷，馬 堃，姜愛麗

(大連民族學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，遼寧大連116600)

冰酒(Ice wine)是一種甜型葡萄酒，被贊譽(yù)為“酒中貴婦”及葡萄酒世界的“冰美人”。從冰酒的釀制工藝上講，完全成熟并且晚收的葡萄，會(huì)發(fā)生脫水其糖分會(huì)提高，同時(shí)，又在自然條件下冰凍，葡萄中的水分會(huì)全部凝結(jié)成冰，這樣榨出的葡萄汁糖度更高，這使得冰酒中的殘留含糖量從180g/L到320g/L不等，但由于其高酸度，冰酒仍然非常清爽［1］。葡萄酒中的含糖量影響葡萄酒的口感、格調(diào)風(fēng)格和酒的品質(zhì)［2］。加拿大、奧地利以及德國的葡萄酒工業(yè)協(xié)會(huì)就冰葡萄酒產(chǎn)品糖度達(dá)成國際標(biāo)準(zhǔn):最小的天然糖分含量應(yīng)該是15%，但是由于自然條件影響，可以超過這個(gè)最小量。冰酒酒體飽滿、爽口、清新，甜而不膩，是不可多得的上乘佳釀。

酒中糖的定量檢測分析方法主要有高效液相色譜法［3-4］、離子色譜法［5］、核磁共振波譜分析技術(shù)［6］和氣相色譜法［7］，目前使用高效液相色譜法的有莫海濤［8］等人建立了同時(shí)測定低蔗糖食品中葡萄糖、蔗糖、麥芽糖和乳糖的高效液相色譜方法，檢出限為4.5～6mg/L。魯琳［9］等人采用測定食品中的三氯蔗糖回收率達(dá)94.3%～97.1%，精密度(n=6):1.9%～2.3%。Morenno等人［10］用HPLC測定了多種維生素藥劑中5種水溶性維生素。然而目前將HPLC-ELSD方法應(yīng)用于冰酒中糖類含量的分離測定相對(duì)較少，其他通用方法前處理繁瑣，產(chǎn)生較多工作量。因此本實(shí)驗(yàn)利用HPLC-ELSD測定冰酒中各類糖含量，操作簡單、重現(xiàn)性好，并可同時(shí)測定多種糖。本實(shí)驗(yàn)?zāi)康脑谟诮⒈浦刑穷愇镔|(zhì)的分離測定常用方法，為鑒別真假冰酒提供參考依據(jù)，并為開發(fā)營養(yǎng)健康的冰酒佳釀提供理論依據(jù)。

1 材料及方法

1.1 材料與儀器

六個(gè)不同品種的葡萄酒:德國藍(lán)白pfalz葡萄酒、遼寧本溪森奧冰紅葡萄酒、張?jiān)１凭魄f黃金冰谷葡萄酒、加拿大冰(紅)葡萄酒、普瑞麗家族甜白葡萄酒、遼寧五女山窖藏冰葡萄酒;乙腈(色譜純);超純水;葡萄糖(50-99-7，Dr.Ehrenstorfer Gmbh，99.5%);果糖 ，7660-25-5，Dr.Ehrenstorfer Gmbh，99.5%);麥芽糖，16984-36-4，Dr.Ehrenstorfer Gmbh，99.5%);蔗糖(57-50-5，Dr.Ehrenstorfer Gmbh，99.5%);乳糖(63-42-3，Dr.Ehrenstorfer Gmbh，99.5%)。

高效液相色譜儀LC-10A 日本島津;蒸發(fā)光檢測器SEDEX75 日本島津;超聲波破碎儀 昆山市超聲儀有限公司;色譜柱 NH2柱(5μm 4.6mm×25cm) 大連依利特科學(xué)儀器有限公司;PL203型精密電子天平 上海梅特勒-托利多儀器有限公司;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 德國IKA公司;CUM-1107超純水機(jī) 威立雅水處理技術(shù)上海有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 色譜條件 NH2色譜柱(5μm，250mm×4.6mm);流動(dòng)相:乙腈∶水 =80∶20;流速:0.8mL/min;蒸發(fā)光檢測器溫度:40℃;20μL進(jìn)樣。

1.2.2 試液的配制

1.2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 葡萄糖、果糖、麥芽糖、蔗糖、乳糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制:稱取標(biāo)準(zhǔn)品10mg，用6mL超純水溶解，超聲溶解30min，定容至10mL棕色容量瓶中，配制成1g/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別稀釋得到300、250、200、150、100、50、30、20mg/L 的標(biāo)準(zhǔn)溶液，搖勻，經(jīng)微孔濾膜(0.45μm)過濾。

混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制:將配制好的相同濃度葡萄糖、果糖、麥芽糖、蔗糖、乳糖標(biāo)準(zhǔn)溶液分別混合，得到 300、250、200、150、100、50、30、20mg/L 的標(biāo)準(zhǔn)溶液，每種濃度中均含有相同濃度的五種糖含量，搖勻，經(jīng)微孔濾膜(0.45μm)過濾。

1.2.2.2 樣品的處理和待測溶液的制備 冰酒酒樣的處理:取2.5mL酒樣于25mL容量瓶，加5mL石油醚和5mL乙酸乙酯，振蕩萃取15min，分離上清液，留下層液，重復(fù)三次，40℃條件下，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至3～5mL，加5mL水，超聲溶解5min，移至10mL容量瓶，定容至10mL為待測液，0.45μm濾膜過濾，20μL進(jìn)樣測定。

1.2.3 結(jié)果的計(jì)算

式中:X為冰酒中各種糖分的含量，g/L;C為由標(biāo)準(zhǔn)曲線查得的樣品溶液濃度，mg/L;V1為樣品溶液體積，mL;n為稀釋倍數(shù);V2為試樣體積，mL。

1.3 數(shù)據(jù)分析

用Excel作圖，實(shí)驗(yàn)結(jié)果取六次測定的平均值并計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)差，以SPSS進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜柱的選擇

氨基柱的鍵合官能團(tuán)氨丙基糖與糖分子上因端基異構(gòu)碳上所帶的羥基被去質(zhì)子化而帶負(fù)電荷之間相互作用使糖被保留，從而達(dá)到分離。在測量糖類含量實(shí)驗(yàn)中，氨基(NH2)柱有著廣泛的應(yīng)用基礎(chǔ)，具有方法線性好、回收率高、重現(xiàn)性好和穩(wěn)定性能優(yōu)越等特點(diǎn)。張偉、王磊［11］等在其《高效液相氨基柱和C18柱測定甜菊糖含量方法對(duì)比》中對(duì)比了氨基(NH2)柱與C18柱在測量甜菊中糖含量的性能，C18柱檢測結(jié)果比NH2柱低1.5%～3%。該色譜柱成功實(shí)現(xiàn)了葡萄糖、果糖與葡萄酒中干擾峰的基線分離。本次實(shí)驗(yàn)在選擇以乙腈與水的混合流動(dòng)相的前提下，對(duì)比了氨基(NH2)柱與C18柱在測量混合標(biāo)準(zhǔn)溶液中糖含量，C18柱檢測峰行比NH2柱峰行偏低，因此本實(shí)驗(yàn)采用了氨基(NH2)柱作為色譜柱。

2.2 流動(dòng)相及流速的選擇

在相同流量下改變流動(dòng)相濃度只改變被測物質(zhì)的出峰時(shí)間，隨著水溶液濃度減小，流動(dòng)相強(qiáng)度也逐漸減弱，被測物質(zhì)的保留時(shí)間延后，分離度有一定提高，但是濃度過小會(huì)導(dǎo)致峰形展寬，分離度有所下降。

流動(dòng)相在乙腈∶水=80∶20時(shí)，峰形較好，且混合標(biāo)準(zhǔn)液中五種糖可以在25min之內(nèi)分離開來，而乙腈∶水=75∶25時(shí)，葡萄糖和果糖所出峰無法分離開來，而乙腈∶水=85∶15時(shí)，需要40min才可以將五種糖完全分離開來。實(shí)驗(yàn)選擇最佳的流動(dòng)相為乙腈∶水=80∶20。

隨著流動(dòng)相流量減小，糖類的保留時(shí)間延后，峰形展寬，峰面積增大，峰高值下降。但是流量過大會(huì)導(dǎo)致峰形過窄難于分辨。實(shí)驗(yàn)選擇最佳的淋洗液流量為0.8mL/min。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制及檢出限

將配制好的不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液按1.2.1所述的色譜條件測定，六次平行進(jìn)樣，結(jié)果顯示:在500mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液檢測時(shí)出現(xiàn)平頭峰，在20mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液檢測時(shí)沒有出現(xiàn)峰行，在此范圍之內(nèi)的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液檢測時(shí)出現(xiàn)了較好的峰行，本次選取了100mg/L和200mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液在30min內(nèi)的峰行曲線如圖1所示。利用檢測所得的各濃度混合標(biāo)準(zhǔn)溶液所出的峰行曲線并制得標(biāo)準(zhǔn)曲線，五種糖的線性范圍、線性回歸方程及儀器檢出限見表1。

圖1選取了100mg/L和200mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液在30min內(nèi)的峰行曲線。從圖1可以看出，在按1.2.1所述的色譜條件測定五種糖類可以在25min內(nèi)全部出峰，且效果明顯。果糖出峰時(shí)間最早，在9.643min，乳糖出峰時(shí)間最晚，在22.084min。

圖1 5種標(biāo)準(zhǔn)品曲線色譜圖Fig.1 Chromatograms of 5 types of sugar in ice wine standard

表1 各種糖類標(biāo)準(zhǔn)曲線及相關(guān)系數(shù)Table 1 Different types of sugar in ice wine standard curve Linear and correlation coefficients

表3 六種冰酒的糖分含量測定結(jié)果Table 3 Results of sugar content determination in six types of ice wine

2.4 精密度

取200mg/L的葡萄糖、果糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖的標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別連續(xù)6次平行進(jìn)樣，計(jì)算5種糖的保留時(shí)間及峰面積的精密度，對(duì)冰葡萄酒進(jìn)行6次平行測定，葡萄糖、果糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖含量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)分別為1.2%、2.1%、1.2%、1.3%、0.7%，結(jié)果見表2。

表2 方法精密度Table 2 The method of RSD

2.5 樣品的測定結(jié)果

2.5.1 六種冰酒中各糖分含量測定結(jié)果 應(yīng)用HPLC-ELSD法按上述色譜條件檢測，并對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線，對(duì)冰葡萄酒進(jìn)行6次平行測定，按1.2.3所述公式計(jì)算，將測得的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，取平均值，得到六種冰酒中各糖分的含量，測定結(jié)果見表3。

經(jīng)測定各種品種的冰葡萄酒糖含量范圍在160～280g/L之間，主要為果糖和葡萄糖，且果糖含量大于葡萄糖含量。

德國pfalz藍(lán)冰白葡萄酒中葡萄糖和果糖的含量比例為3∶5，葡萄糖所占比例最高，而其他冰酒葡萄糖含量所占比例相對(duì)較低，其中張?jiān)１凭魄f黃金冰谷葡萄酒及遼寧五女山窖藏冰葡萄酒中葡萄糖和果糖的含量比例為1∶3，同時(shí)加拿大冰(紅)葡萄酒、普瑞麗家族甜白葡萄酒中葡萄糖和果糖的含量比例也接近1∶3。此次選擇的六種冰酒中，除德國pfalz藍(lán)冰白葡萄酒之外，另五種所選冰酒原料葡萄品種均為威代爾，且葡萄糖和果糖的含量比例接近為 1∶3。

由表3可見，各種品種的冰酒總糖度相差較大，同時(shí)葡萄糖和果糖的含量相差也較大，原因可能為各種冰葡萄酒所用的原料葡萄本身所含糖分不同，在釀造過程中不同的釀酒酵母品種消耗的葡萄糖和果糖不同，同時(shí)釀酒酵母生成的酒精含量和剩余糖類也會(huì)不同，并且各地區(qū)品種冰酒釀造時(shí)間不同，釀酒酵母的選擇不同，釀造工藝不同等都有可能導(dǎo)致這樣的結(jié)果。

2.6 樣品加標(biāo)回收率

對(duì)葡萄酒進(jìn)行加標(biāo)回收率的測定，分別加入低、中、高三種濃度的葡萄糖和果糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，按本文方法進(jìn)行測定，結(jié)果見表4。

果糖的出峰時(shí)間9.643min，葡萄糖的出峰時(shí)間10.865min，六種樣品的回收率在94.7%～103.4%，說明此實(shí)驗(yàn)方法重現(xiàn)性好，回收率高，性能穩(wěn)定，具有可行性。

3 結(jié)論和展望

本實(shí)驗(yàn)建立了冰葡萄酒中糖類含量的分析方法，在流動(dòng)相為乙腈∶水=80∶20，流速0.8mL/min時(shí)，成功實(shí)現(xiàn)了冰葡萄酒中糖類(主要為葡萄糖和果糖)含量的分離。此方法能快速定性和定量的測定糖類含量，利用各種糖分折光度不同的等特點(diǎn)，選擇適合的色譜柱和分析條件，利用蒸發(fā)光檢測器快速分析出樣品中各種糖分的含量，并且，葡萄糖、果糖、麥芽糖、蔗糖、乳糖五種糖分能同時(shí)測定，該方法準(zhǔn)確度可靠，靈敏度較高，回收率在94.7%～103.4%，表明本實(shí)驗(yàn)建立的HPLC-ELSD法是可以快速、準(zhǔn)確、可靠的測定水溶性糖類物質(zhì)含量，大大節(jié)省了樣品處理的時(shí)間和分析時(shí)間，是可以廣泛使用的一種測定方法。

各品種冰酒糖分雖有差異，但找出各地區(qū)品種冰酒的糖分含量特征，冰酒釀造過程中各糖分的含量變化與釀酒酵母活性之間的關(guān)系，以及糖分變化與酒精度和香氣成分之間的規(guī)律仍然可行。且糖類作為冰酒營養(yǎng)成分及酵母發(fā)酵過程的雙功能必需品，對(duì)其研究必將對(duì)冰酒營養(yǎng)成分及冰酒的釀造提供有效指導(dǎo)和理論依據(jù)。其中各種冰酒中葡萄糖含量與果糖含量的比例特征及各成分的特征含量有可能為冰酒的鑒別提供參考依據(jù)。

表4 方法樣品回收實(shí)驗(yàn)(n=6)Table 4 Degree of Sample recovery test(n=6)

利用本實(shí)驗(yàn)建立的HPLC-ELSD法可以用來檢測市場上不同品質(zhì)之間的各類冰葡萄酒，以期能以糖分含量將冰酒的品質(zhì)優(yōu)劣區(qū)別開來，并進(jìn)一步測定冰酒從原料葡萄到窖藏過程中的糖類含量變化，利用高效液相色譜、質(zhì)譜、核磁共振等儀器做冰葡萄酒的肽指紋圖譜及精確驗(yàn)證冰酒中的糖分含量，這將對(duì)于快速檢測冰葡萄酒的真假以及功能性保健食品的開發(fā)具有重要的意義。

［1］莫?jiǎng)冢?酒中貴婦［J］.中國食品，2009，01(6):289-293.

［2］郭偉強(qiáng)，齊凡.葡萄酒類別的色譜界定方法研究［J］.浙江大學(xué)學(xué)報(bào)，2001，28(3):289-293.

［3］黃翼飛.高效液相色譜法測定煙草中的果糖、葡萄糖和蔗糖［J］.煙草科技，2010(1):30-67.

［4］蔡欣欣，張秀堯.高效液相色譜蒸發(fā)光散射檢測法測定食品中果糖、葡萄糖、蔗糖、乳糖和麥芽糖［J］.中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志 .2007，17(6):968-982.

［5］曹文軍，崔晗.離子色譜法測定葡萄酒中葡萄糖和果糖［J］.現(xiàn)代科學(xué)儀器，2011，12(6):114-116.

［6］閻政禮，楊明生.甜型葡萄酒中主要糖類、檸檬酸和乙醇的NMR定量研究［J］.中國釀造，2009(11):145-147.

［7］薛連海，氣相色譜法測定大豆中低聚糖含量［J］.分析化學(xué)，2003，31(3):382-382.

［8］莫海濤，李永庫.高效液相色譜-激光蒸發(fā)光散射檢測法測定低蔗糖食品中葡萄糖、蔗糖、麥芽糖和乳糖含量［J］.食品工業(yè)科技，2006(3):186-187.

［9］魯琳，杭義萍，高燕紅.高效液相色譜-蒸發(fā)光檢測器測定食品中的三氯蔗糖［J］.中國熱帶醫(yī)學(xué)，2008(8):1628-1629.

［10］Moreno P，Salvado V.Determination of eight water-and fatsoluble vitamins in multi-vitamin pharmaceutical formulations by high-performance liquid chromatography［J］.J Chromatogr ，A，2000，870:207-215.

［11］張偉，王磊.高效液相氨基柱和C18柱測定甜菊糖含量方法對(duì)比［J］.中國食品添加劑，2013(4):201-204.