響應(yīng)面法優(yōu)化新疆昆侖雪菊多糖提取工藝研究

邵 理，詹 萍，田洪磊

(石河子大學(xué)食品學(xué)院，新疆石河子832000)

昆侖雪菊(Coreopsis tinctoria Nuff.)是菊科金雞菊屬一年生草本植物，其學(xué)名為蛇目菊、雙色金雞菊［1］。原產(chǎn)地為美國(guó)中西部地區(qū)，目前在新疆和田地區(qū)廣泛種植，在當(dāng)?shù)赜址Q之為雪菊、昆侖血菊、高寒雪菊等，維語(yǔ)名稱為古里恰依［2］。也是目前在新疆唯一可以與雪蓮媲美，具有特殊功效和藥用價(jià)值的高寒野生植物［3］。昆侖雪菊味甘，性平，具有活血化瘀、和胃健脾、降血壓和降血脂的作用。長(zhǎng)期以來(lái)都被當(dāng)?shù)鼐用癞?dāng)花茶來(lái)飲用，并有減肥養(yǎng)顏、抗菌消炎的功效，具有極高的藥用價(jià)值，歷代藥典中關(guān)于昆侖雪菊的藥用價(jià)值記載也很多，因此昆侖雪菊是具有廣闊前景和研究?jī)r(jià)值的新品種［4-7］。

近幾年來(lái)，隨著人們對(duì)天然產(chǎn)物保健品越來(lái)越重視，加之植物多糖類化合物有著廣泛的生物活性(如免疫調(diào)節(jié)、降血糖、抗氧化等)作用，引起了許多學(xué)者對(duì)多糖的關(guān)注和研究?，F(xiàn)代藥理研究已表明菊花多糖是一種良好的氧自由基清除劑，具有良好的預(yù)防保健作用［8］。昆侖雪菊的藥理作用［9-10］，及其氨基酸［11］、總黃酮［3］、揮發(fā)油［12］等化學(xué)成分的研究已有報(bào)道，但對(duì)其多糖的研究報(bào)道尚待深入。本論文以多糖得率為指標(biāo)，結(jié)合超聲波輔助提取及響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)Box-Behnken設(shè)計(jì)的方法，探討了液料比、超聲時(shí)間、提取溫度等參數(shù)對(duì)昆侖雪菊多糖得率的影響。預(yù)期研究成果為新疆昆侖雪菊生物活性物質(zhì)制備提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

昆侖雪菊 西域金鋤生物工程有限責(zé)任公司提供;苯酚、硫酸、乙醇、葡萄糖等標(biāo)品及其他試劑 均為分析純，蒸餾水為實(shí)驗(yàn)室自制。

雙頻數(shù)控超聲波清洗器KQ-200VDE 昆山市超聲儀器有限公司;紫外可見分光光度計(jì)UVmini-1240 島津國(guó)際貿(mào)易公司;離心機(jī) 力康發(fā)展有限公司;粉碎機(jī) 上海百豐食品機(jī)械有限公司;HHS-216型恒溫水浴槽 常州國(guó)華電器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 昆侖雪菊多糖的提取方法 參考文獻(xiàn)［13］，將昆侖雪菊放入40℃的烘箱中干燥24h，粉碎，過60目篩，密封后避光保存。采用索氏提取法在有機(jī)溶劑丙酮-石油醚(1∶1，V/V)65℃的回流下對(duì)昆侖雪菊粉末進(jìn)行脫脂處理，并烘干脫脂后的粉末。再進(jìn)行超聲萃取處理，經(jīng)提取，離心合并上清液并濃縮后，用Sevag法除蛋白、醇沉、抽濾，濾餅依次用無(wú)水乙醇、丙酮、乙醚洗滌后，真空干燥，得昆侖雪菊粗多糖。其工藝流程:昆侖雪菊→干燥→粉碎→脫脂→超聲波萃取→離心→濃縮→去蛋白→醇沉→洗滌→冷凍干燥→粗多糖。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 參考文獻(xiàn)［14-15］，分別吸取(1.0mg/mL)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液 2.0、4.0、6.0、8.0、10.0mL，分別置100mL容量瓶中，用蒸餾水稀釋至刻度，搖勻。精密移取上述系列標(biāo)準(zhǔn)溶液各0.5mL，置于具塞玻璃試管(10mL)中，空白對(duì)照用蒸餾水0.5mL。每管加入1.0mL苯酚溶液(5%)，混勻后，加3.5mL濃硫酸，迅速混勻，室溫放置10min，置40℃水浴中加熱反應(yīng)30min，冰水浴冷卻至室溫，于487nm處測(cè)吸光度。以標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。回歸方程為:A=0.0072C-0.002，R2=0.9981(n=5)，線性關(guān)系良好。式中:A表示波長(zhǎng)487nm處的吸光度;C表示葡萄糖的濃度。

1.2.3 苯酚-硫酸法測(cè)定昆侖雪菊多糖的得率 昆侖雪菊多糖的得率(%)=C×V×D/W×100，式中:C為根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出的濃度，μg/mL;V為提取液的體積，mL;D為樣品溶液的稀釋倍數(shù);W為樣品的質(zhì)量，μg。

1.2.4 單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.4.1 液料比對(duì)昆侖雪菊多糖得率的影響 準(zhǔn)確稱取昆侖雪菊粉末2.00g，設(shè)置超聲時(shí)間為60min、提取次數(shù)為一次、提取溫度為70℃，分別在液料比(mL/g)梯度為 20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、60∶1、70∶1 條件下制備粗多糖樣品，并結(jié)合離心、醇沉及洗滌等環(huán)節(jié)對(duì)制備粗液進(jìn)行純化。通過樣品復(fù)溶稀釋測(cè)定吸光值，計(jì)算昆侖雪菊多糖的得率。

1.2.4.2 超聲時(shí)間對(duì)昆侖雪菊多糖得率的影響 準(zhǔn)確稱取昆侖雪菊粉末2.00g，設(shè)置液料比(mL/g)40∶1、提取次數(shù)為一次、提取溫度為70℃，分別在超聲時(shí)間為 15、30、45、60、75、90min 條件下制備粗多糖樣品，并結(jié)合離心、醇沉及洗滌等環(huán)節(jié)對(duì)制備粗液進(jìn)行純化。通過樣品復(fù)溶稀釋測(cè)定吸光值，計(jì)算昆侖雪菊多糖的得率。

1.2.4.3 提取次數(shù)對(duì)昆侖雪菊多糖得率的影響 準(zhǔn)確稱取昆侖雪菊粉末2.00g，設(shè)置液料比(mL/g)40∶1、超聲時(shí)間為60min、提取溫度為 70℃，分別在提取次數(shù)為一次、兩次、三次、四次、五次條件下制備粗多糖樣品，并結(jié)合離心、醇沉及洗滌等環(huán)節(jié)對(duì)制備粗液進(jìn)行純化。通過樣品復(fù)溶稀釋測(cè)定吸光值，計(jì)算昆侖雪菊多糖的得率。

1.2.4.4 提取溫度對(duì)昆侖雪菊多糖得率的影響 準(zhǔn)確稱取昆侖雪菊粉末2.00g，設(shè)置液料比(mL/g)40∶1、超聲時(shí)間為60min、提取次數(shù)為一次，分別在提取溫度為30、40、50、60、70、80℃ 條件下制備粗多糖樣品，并結(jié)合離心、醇沉及洗滌等環(huán)節(jié)對(duì)制備粗液進(jìn)行純化。通過樣品復(fù)溶稀釋測(cè)定吸光值，計(jì)算昆侖雪菊多糖的得率。

1.2.5 響應(yīng)面分析法優(yōu)化實(shí)驗(yàn)驗(yàn) 根據(jù)Box-Benhnken的中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理［16］，結(jié)合前期單因素實(shí)驗(yàn)，選取液料比、超聲時(shí)間、提取溫度、提取次數(shù)各因素的最優(yōu)實(shí)驗(yàn)范圍，以多糖得率(%)為響應(yīng)值，運(yùn)用響應(yīng)面法進(jìn)行四因素三水平的昆侖雪菊多糖提取工藝優(yōu)化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，以確定昆侖雪菊多糖最佳提取工藝。因素水平及編碼如表1所示。

表1 響應(yīng)面因素水平及編碼Table 1 The factors and levels of response surface

1.2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析 數(shù)據(jù)采用origin8.0及Design-Expert 8.06軟件處理分析，所有數(shù)據(jù)均進(jìn)行三次平行實(shí)驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 液料比對(duì)昆侖雪菊多糖得率的影響 從圖1可以看出，液料比在(mL/g)20∶1～50∶1 之間，多糖的得率隨溶劑量的增加而增大，在50∶1時(shí)多糖得率達(dá)到最大，當(dāng)進(jìn)一步增大液料比時(shí)，多糖的得率反而下降。在一定范圍內(nèi)，由于萃取體系溶劑量的增加會(huì)導(dǎo)致溶質(zhì)細(xì)胞內(nèi)外滲透壓產(chǎn)生明顯差異，從而在加速多糖擴(kuò)散程度的同時(shí)，輔助于多糖浸出效率的提升;隨著細(xì)胞內(nèi)外多糖濃度趨向平衡的動(dòng)態(tài)變化，多糖溶出量達(dá)到最大［17］;繼而增大液料比，可能會(huì)加速胞內(nèi)其它物質(zhì)浸出及多糖螯合的機(jī)率，致使多糖得率降低。故選取液料比(mL/g)50∶1左右為宜。

2.1.2 超聲時(shí)間對(duì)昆侖雪菊多糖得率的影響 從圖2可以看出，超聲時(shí)間在15～45min之間，多糖得率隨超聲時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸增加，45min時(shí)多糖得率達(dá)到最大，而后隨時(shí)間的延長(zhǎng)得率呈下降趨勢(shì)。由于超聲波剪切力強(qiáng)和對(duì)細(xì)胞的空化作用，使得細(xì)胞內(nèi)部的多糖逐漸向外擴(kuò)散，得率呈上升趨勢(shì);當(dāng)處理數(shù)分鐘后，細(xì)胞破碎程度增大，有利于多糖浸出，多糖的含量升高到最大值;隨超聲波處理時(shí)間的延長(zhǎng)，多糖結(jié)構(gòu)遭到破壞，這可能是造成得率下降的原因［18］。故選取超聲時(shí)間45min左右為宜。

圖1 液料比對(duì)多糖得率的影響Fig.1 The influence of liquid-solid ratio on polysaccharide yield

圖2 超聲時(shí)間對(duì)多糖得率的影響Fig.2 The influence of ultrasound time on polysaccharide yield

2.1.3 提取次數(shù)對(duì)昆侖雪菊多糖得率的影響 從圖3可以看出，隨著提取次數(shù)的增加，得率增加基本平緩。一次提取，整個(gè)體系較稠，溶液顏色較深，多糖不能完全浸出。提取次數(shù)增加，得率變化不大，所得溶液的體積增加，為后期溶液的處理帶來(lái)試劑上的浪費(fèi)。故選取提取次數(shù)為兩次左右為宜。

圖3 提取次數(shù)對(duì)多糖得率的影響Fig.3 The influence of extraction times on polysaccharide yield

2.1.4 溫度對(duì)昆侖雪菊多糖得率的影響 從圖4可以看出，在30～60℃范圍內(nèi)，多糖得率呈上升趨勢(shì)，在60℃時(shí)，得率達(dá)到最大，而后隨著溫度升高多糖得率呈降低趨勢(shì)。溫度升高，使得多糖分子擴(kuò)散運(yùn)動(dòng)加強(qiáng)，促使多糖浸出，多糖得率增加;然而在溫度過高的情況下，可能由于多糖糖苷鍵的破壞與降解，導(dǎo)致多糖得率下降。故選取提取溫度60℃左右為宜。

圖4 溫度對(duì)多糖得率的影響Fig.4 The influence of extraction temperature on polysaccharide yield

2.2 響應(yīng)面分析法優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

2.2.1 回歸模型的建立及方差分析 采用Design Expert8.0.6軟件中的Box-Behnken模型設(shè)計(jì)分析方案，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果如表2所示。

表2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 The experimental scheme and results of central composite design

表3 回歸模型及方差分析結(jié)果Table 3 The regression models and results of variance analysis

根據(jù)表2中Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果，采用Design-Expert 8.06統(tǒng)計(jì)軟件，通過回歸分析對(duì)表2實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合，得到A(液料比)、B(超聲時(shí)間)、C(提取次數(shù))、D(溫度)四個(gè)因素對(duì)昆侖雪菊多糖得率(Y)的二次回歸方程為:

Y=+11.82+0.65A+0.35B+0.16C-0.63D-0.43AB-1.07AC+0.48AD-0.62BC-0.16BD+1.00CD-1.35A2-1.94B2-0.79C2-0.74D2。對(duì)該回歸模型及其系數(shù)進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，結(jié)果見表3。

由表3可知:模型極顯著(p＜0.0001)，一次項(xiàng)(A、B、D)、交互項(xiàng)(AC、BC、CD)、各平方項(xiàng)均對(duì)響應(yīng)值有極顯著性影響;失擬項(xiàng)p=0.9893＞0.05，失擬項(xiàng)差異不顯著，該回歸方程對(duì)實(shí)驗(yàn)擬合程度較好;模型相關(guān)系數(shù)為0.9705，說(shuō)明該模型能解釋97.05%的響應(yīng)值變化，僅有2.95%的變異不能由此模型解釋，預(yù)測(cè)值與實(shí)驗(yàn)值具有高度的相關(guān)性，該模型成立。對(duì)回歸系數(shù)顯著性檢驗(yàn)，在α=0.05顯著水平剔除不顯著項(xiàng)，得到優(yōu)化后的方程為:

通過對(duì)回歸系數(shù)的檢驗(yàn)可知，各因素對(duì)昆侖雪菊多糖得率影響的大小順序?yàn)锳(液料比)＞D(溫度)＞B(超聲時(shí)間)＞C(提取次數(shù))，其中液料比、溫度、超聲時(shí)間對(duì)得率具有極顯著的影響，提取次數(shù)對(duì)得率沒有顯著影響。

2.2.2 響應(yīng)面分析 該數(shù)學(xué)回歸模型中響應(yīng)面圖形是響應(yīng)值(得率)對(duì)各因素所構(gòu)成的三維空間的曲面圖。為考察交互項(xiàng)對(duì)多糖得率的影響，在其他兩因素條件取最優(yōu)工藝參數(shù)值時(shí)，考察另外兩因素交互項(xiàng)對(duì)多糖得率的影響［19-20］。由方差分析表3可知，在本實(shí)驗(yàn)所建立的數(shù)學(xué)回歸模型中，AC、BC和CD三項(xiàng)之間存在極顯著的交互作用。利用Design-Expert8.0.6軟件對(duì)回歸模型進(jìn)行響應(yīng)面分析，得到AC、BC和CD的響應(yīng)面三維立體圖(圖5～圖7)。

圖5 液料比與提取次數(shù)交互作用的響應(yīng)面Fig.5 The response surface and contour of interacting between liquid-solid ratio and extraction times

從圖5可以看出:響應(yīng)曲面走勢(shì)劇烈，說(shuō)明提取次數(shù)和液料比之間交互作用強(qiáng);同時(shí)液料比的曲面較提取次數(shù)的曲面陡，亦說(shuō)明當(dāng)其它因素為固定時(shí)，料液比對(duì)多糖得率的影響顯著，等高線圖的圓心接近橢圓，交互作用強(qiáng);沿液料比軸向的等高線密集，說(shuō)明液料比對(duì)多糖得率的影響顯著性比提取次數(shù)對(duì)多糖得率的影響更加顯著。從圖7可以看出:提取次數(shù)曲面比溫度曲面平緩，當(dāng)其它因素固定時(shí)，與提取次數(shù)相比提取溫度呈顯著性變化趨勢(shì)，且其等高線成橢圓，此兩因素交互作用較強(qiáng)，沿溫度軸的等高線較為密集，說(shuō)明超聲溫度對(duì)多糖得率影響較顯著。從圖6可以看出:超聲時(shí)間曲面比提取次數(shù)曲面陡，說(shuō)明超聲時(shí)間對(duì)多糖得率的影響顯著，等高線接近圓，說(shuō)明這兩因素交互作用不明顯。結(jié)合表3可以得出各因素的交互作用對(duì)得率的影響由強(qiáng)到弱依次為 AC、CD、BC。

圖6 超聲時(shí)間與提取次數(shù)交互作用的響應(yīng)面Fig.6 The response surface and contour of interacting between extraction time and extraction times

圖7 溫度與提取次數(shù)交互作用的響應(yīng)面Fig.7 The response surface and contour of interacting between extraction temperature and extraction times

2.3 昆侖雪菊多糖最優(yōu)提取條件的確定和驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

通過所得回歸模型對(duì)提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，得到昆侖雪菊多糖得率的最佳工藝條件為:液料比(mL/g)為 59.6∶1，超聲時(shí)間 52.54min，提取次數(shù)為1.76次，溫度為67.90℃，在此條件下多糖得率的理論值為10.07%。為檢驗(yàn)Box-Behnken(BBD)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法的可靠性，采用上述最佳工藝條件進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，同時(shí)考慮到操作的方便性，將提取工藝參數(shù)修正為液料比(mL/g)60∶1，超聲時(shí)間53min，提取次數(shù)兩次，溫度68℃，設(shè)三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)。測(cè)得多糖平均得率為9.85%，相對(duì)誤差約為2.18%，實(shí)際值與理論值相差較小，說(shuō)明由Box-Behnken(BBD)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法進(jìn)行該實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化，具有可行性。

3 結(jié)論

本論文以新疆昆侖雪菊為材料，運(yùn)用了Box-Behnken(BBD)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案，采用超聲波輔助法對(duì)昆侖雪菊多糖的提取工藝進(jìn)行了研究。在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，利用 Design Expert軟件Box-Behnken設(shè)計(jì)法設(shè)計(jì)響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)，建立了數(shù)學(xué)模型，預(yù)測(cè)了昆侖雪菊多糖最優(yōu)的提取工藝條件，并進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，經(jīng)修正后確定昆侖雪菊多糖最佳提取工藝條件:液料比(mL/g)60∶1，超聲時(shí)間53min，提取次數(shù)兩次，溫度68℃，此條件下昆侖雪菊多糖得率可達(dá)9.85%。超聲波輔助法對(duì)提取昆侖雪菊多糖工藝具有操作簡(jiǎn)單、效率高等優(yōu)點(diǎn)，為進(jìn)一步的工藝開發(fā)提供較好的參考依據(jù)。

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