產(chǎn)內(nèi)切菊粉酶的海洋放線菌菌株的篩選與鑒定

宮 穎，于基成，劉 秋

(大連民族學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，遼寧大連116600)

菊粉又稱菊糖，是由D-呋喃果糖分子經(jīng)β-2，1糖苷鍵脫水聚合而成的線性直鏈多糖［1-2］。菊粉酶是一種催化水解菊粉中β-2，1果糖糖苷鍵的水解酶，可根據(jù)對底物作用方式的不同分為外切菊粉酶和內(nèi)切菊粉酶［3］，外切菊粉酶水解菊粉用于生產(chǎn)高果糖漿，內(nèi)切菊粉酶水解菊粉則用于生產(chǎn)低聚果糖［4-5］，研究表明菊粉酶的生產(chǎn)為微生物菌株發(fā)酵獲得［6］。目前，關(guān)于產(chǎn)菊粉酶微生物菌株報(bào)道較多，主要集中于曲霉屬和酵母菌屬［7-8］，也有少部分的細(xì)菌和極少的放線菌［9］。報(bào)道的各種微生物菌株的菊粉酶產(chǎn)量不一，酶活力一般在14.6～20.15U/mL，大多表現(xiàn)為外切菊粉酶活性［10］。因此獲得高效產(chǎn)內(nèi)切菊粉酶微生物菌株具有潛在和重要的工業(yè)化應(yīng)用意義。本研究目的則是從特殊生境—鴨綠江濱海濕地樣品中篩選獲得產(chǎn)內(nèi)切菊粉酶菌株，以期獲得產(chǎn)高活性內(nèi)切菊粉酶濕地放線菌菌株，為進(jìn)一步開展產(chǎn)內(nèi)切菊粉酶海洋微生物菌株研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

菊粉 鞍山生物技術(shù)有限公司，純度＞95%;3，5-二硝基水楊酸(DNS) 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，化學(xué)純;L-天門冬酰胺 北京奧博星生物技術(shù)責(zé)任有限公司;瓊脂 日本進(jìn)口分裝;酵母提取物 北京希凱創(chuàng)新科技有限公司;甘油 天津市瑞金特化學(xué)品有限公司;乙酸、乙酸鈉、K2HPO4·3H2O、KNO3、MgSO4·7H2O、FeSO4·7H2O、MgCl2·7H2O、ZnSO4·7H2O 均為天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，所有分析用試劑均為分析純;海水 取自黃海。

UV-2600紫外可見分光光度計(jì) 日本島津公司;S-4800掃描電子顯微鏡 日本日電;HYG-3多功能搖床 金壇市杰瑞爾電器有限公司;DNP-9082電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;H-1850R離心機(jī) 湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司等。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)基 初篩培養(yǎng)基ISP5(g/L):酵母提取物5g，L- 天門冬酰胺 1g，甘油 10mL，K2HPO4·3H2O 0.01g，KNO31g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01g，MgCl2·7H2O 0.01g，ZnSO4·7H2O 0.01g，瓊脂 20g，pH7.2，海水500mL，去離子水500mL，121℃高壓滅菌20min。

選擇培養(yǎng)基(g/L):菊粉 20g，KNO31g，K2HPO4·3H2O 0.5g，MgSO4·7H2O 0.5g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01g，瓊脂 20g，pH7.2，海水 500mL，去離子水 500mL，112℃高壓滅菌20min。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):菊粉 20g，KNO31g，K2HPO4·3H2O 0.5g，MgSO4·7H2O 0.5g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01g，海水500mL，去離子水500mL，112℃高壓滅菌20min。

1.2.2 菌株的篩選 取新鮮海泥樣品5.0g置于45mL無菌水中充分混勻，梯度稀釋到10-4后涂布到ISP5培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)5～7d。用接種環(huán)挑取典型單菌落在以菊粉為唯一碳源的選擇培養(yǎng)基上分區(qū)劃線，28℃培養(yǎng)。

1.2.3 孢子菌懸液的制備 將菌種劃線于平板上，28℃培養(yǎng)3～5d，用無菌小鏟子將孢子輕輕刮下，置于無菌水中稀釋至孢子懸液濃度為10-6cfu/mL，然后以4%接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基搖瓶培養(yǎng)3d，采用DNS法測定其酶活性。

1.3 DNS法測定菊粉酶的活力

根據(jù)茍亞峰等人［11］和 Trivedi等人［12］報(bào)道方法并適當(dāng)改良。發(fā)酵液于4℃，8000×g離心20min。取上清液1.0mL，加入4.0mL 2%菊粉溶液(0.2mol/L，pH5.0醋酸緩沖溶液配制)中，50℃反應(yīng)30min。取反應(yīng)液1.0mL加入1.5mL DNS混合后沸水浴5min，立即取出流水冷卻至室溫，加蒸餾水定容至25.0mL，混勻后靜置30min，于540nm處測定其吸光度值。取3次平行實(shí)驗(yàn)平均值，根據(jù)果糖標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中還原糖含量。

菊粉酶酶活力定義為1min轉(zhuǎn)化生成1μmol還原糖所需的酶量為一個(gè)菊粉酶酶活力單位，表示為I值;同理，以4mL 2%蔗糖溶液(0.2mol/L，pH5.0醋酸緩沖溶液配制)替代菊粉溶液進(jìn)行測定，以1min水解1μmol蔗糖所需的酶量為一個(gè)蔗糖酶酶活力單位，以S值表示。

由于許多微生物有菊粉酶活性的同時(shí)也伴隨著有蔗糖酶活性，通常用I/S比來描述其催化活力，因此，用I/S比值來描述酶的特征;I/S＞10時(shí)表現(xiàn)為內(nèi)切菊粉酶活性，I/S＜10時(shí)表現(xiàn)為外切菊粉酶活性［13-14］。

式中，C:還原糖含量(mg/mL);t:反應(yīng)時(shí)間(min);V:反應(yīng)酶液體積(mL)。

1.4 果糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

依照曹澤虹等［15］報(bào)道的方法繪制果糖標(biāo)準(zhǔn)曲線。分別取果糖標(biāo)準(zhǔn)溶液 0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6mL于25.0mL刻度試管中，以蒸餾水補(bǔ)足至2.0mL，再分別加入DNS溶液1.5mL，充分混勻后沸水5min，迅速流水冷卻并靜置回復(fù)至室溫，蒸餾水定容25.0mL。于540nm處測其吸光值，以果糖含量為橫坐標(biāo)，以各果糖濃度對應(yīng)的吸光度(Abs)為縱坐標(biāo)，繪制果糖標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.5 菌株鑒定

1.5.1 培養(yǎng)形態(tài)觀察 將純化的菌株接種于固體培養(yǎng)基平板上28℃培養(yǎng)2～7d觀察菌落生長特征。

1.5.2 菌絲形態(tài)觀察 將菌株接種于固體培養(yǎng)基上，將硅片(3mm×10mm，121℃高壓滅菌30min)45°插入平板劃線處，28℃培養(yǎng)5d。將硅片取出后置于25%戊二醛溶液中，于4℃冰箱中過夜固定，然后分別用40%、70%、90%和100%的乙醇脫水4次后，用醋酸正戊酯置換乙醇。鍍金處理后于電子顯微鏡下觀察。

1.5.3 構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹 采用徐平等［16］人報(bào)道的微波法快速提取放線菌基因組DNA。設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對PCR產(chǎn)物純化及測序，用MEGA5.0軟件進(jìn)行拼接，提交到EzBioCloud網(wǎng)站上搜索相近菌株序列，采用MEGA5.0軟件中的CLUSTAL-W進(jìn)行比對，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，確定菌株的分類地位。

2 結(jié)果與討論

2.1 果糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖1為果糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過線性回歸分析，得到回歸方程 y=0.2058x-0.0038，其相關(guān)系數(shù) R2=0.9996。

圖1 果糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of fructose

2.2 產(chǎn)內(nèi)切菊粉酶菌株的篩選

以ISP5作為初篩培養(yǎng)基，經(jīng)復(fù)篩實(shí)驗(yàn)獲得產(chǎn)菊粉酶菌株14株，產(chǎn)酶活力及其酶活特征見表1。其中菊粉酶活力為3.46～28.52U/mL，有11株菌I/S＜10，表現(xiàn)為外切菊粉酶活性，菌株S511酶活力(7.74U/mL)最高。而菌株S502、S503和S505，I/S值均大于10，表現(xiàn)為內(nèi)切菊粉酶活性，菊粉酶活力分別為14.13、18.24、28.52U/mL。與已報(bào)道的來源于土壤樣品中產(chǎn)菊粉酶的放線菌屬菌株 Streptomyces sp.CP01(1.6U/mL)［17］，Streptomyces sp.ALKC4(0.524U/mL)［13］，Streptomyces sp.GNDU 1(0.552U/mL)［18］產(chǎn)酶活力相比，該 3 株海洋放線菌具有較高內(nèi)切菊粉酶活力。

表1 產(chǎn)菊粉酶活力及酶特征(n=3)Table 1 Inulinase activity and the enzyme characteristics(n=3)

2.3 產(chǎn)內(nèi)切菊粉酶菌株形態(tài)觀察

菌株S502、S503和S505培養(yǎng)形態(tài)分別如圖2所示，菌絲和孢子形態(tài)分別如圖3所示。表2詳細(xì)描述了待鑒定菌株S502、S503和S505于28℃培養(yǎng)3d后的菌落形態(tài)特征，并在掃描電鏡下觀察其培養(yǎng)5d的菌絲與孢子形態(tài)特征。

表2 產(chǎn)內(nèi)切菊粉酶菌株培養(yǎng)形態(tài)、菌絲和孢子形態(tài)Table 2 Culture morphology，mycelia and spore characters of the strain producing endoinulinase

2.4 系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

篩選獲得的產(chǎn)內(nèi)切菊粉酶菌株S502、S503和S505，通過16S rRNA序列分析，利用MEGA5.0軟件建樹(圖4、圖5和圖6)，確定了其菌株分類地位。菌株 S502、S503、S505與 Streptomyces malachitofuscus NBRC 13059T (AB184282)、Micromonospora echinosporaATCC 15837T(U58532)、Streptomyces carpaticus NBRC 15390T(AB184641)相似度分別為99.227%、99.146%和99.859%。綜合菌株形態(tài)特征，最終將菌株S502、S503和S505鑒定為孔雀石褐鏈霉菌 Streptomycesmalachitofuscus、棘 孢小 單 孢 菌Micromonospora echinospora和鋰鏈霉菌Streptomyces carpaticus。

圖2 菌株培養(yǎng)形態(tài)Fig.2 The colony morphology of strain

圖3 菌株S502、S503和S505的菌絲和孢子形態(tài)Fig.3 The morphological of mycelia and spore of strain S502，S503 and S505

3 結(jié)論與討論

圖4 菌株S502系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.4 Phylogenetic tree of strain S502 based on 16S rRNA sequence

圖5 菌株S503系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.5 Phylogenetic tree of strain S503 based on 16S rRNA sequence

圖6 菌株S505系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.6 Phylogenetic tree of strain S505 based on 16S rRNA sequence

本研究從鴨綠江濱海濕地海泥樣品中初篩獲得14株產(chǎn)菊粉酶菌株，復(fù)篩獲得3株(S502、S503和S505)產(chǎn)內(nèi)切菊粉酶放線菌菌株，其酶活力分別為14.13、18.24、28.52U/mL，且其 I/S 值分別為 19.67、29.00、15.38。經(jīng)形態(tài)觀察和16S rRNA測序及構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹分析，確定其分類地位分別為孔雀石褐鏈霉菌 Streptomyces malachitofuscus、棘孢小單孢菌Micromonospora echinospora和鋰鏈霉菌Streptomyces carpaticus。目前報(bào)道產(chǎn)菊粉酶的放線菌僅有鏈霉菌屬，但大多表現(xiàn)為外切菊粉酶活性且產(chǎn)酶活力較低，本文所篩選的放線菌不僅產(chǎn)酶活力高，而且種類不一，豐富了我國產(chǎn)內(nèi)切菊粉酶菌株的種類。此外，這3株菌為海洋放線菌，培養(yǎng)基中添加了一半的海水，全球有71%的海洋區(qū)域，如果將來能作為工業(yè)酶制劑的生產(chǎn)原料，那么大規(guī)模的工業(yè)發(fā)酵消耗的就是大量的海水，從而節(jié)約了淡水資源，這為進(jìn)一步研究3株放線菌產(chǎn)內(nèi)切菊粉酶特性和商品綠色化生產(chǎn)及應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

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