酵母源金屬硫蛋白體外清除自由基及抑菌活性的研究

徐炳政，王 穎，2，張東杰，* ，易偉民

(1．黑龍江八一農墾大學食品學院，黑龍江大慶163319;2．國家雜糧工程技術研究中心，黑龍江大慶163319)

金屬硫蛋白(Metallothionein，簡稱MT)是一種低分子量、富含半胱氨酸的胞內蛋白質［1］。傳統(tǒng)研究證實MT幾乎存在于所有哺乳動物中，而且在部分組織中大量富集，隨著對MT研究的深入及基因工程等技術的引入，越來越多的MT及類似物被發(fā)現于高等植物、原核及真核微生物中。金屬硫蛋白結構復雜，含多種異構體形式，結構中含有豐富的巰基［2］，該結構賦予了金屬硫蛋白多種生物學功能。已有大量資料證明金屬硫蛋白具有顯著的抗氧化、抗腫瘤［3］、重金屬解毒［4］、調節(jié)機體免疫力及微量元素平衡等功能。

自由基是機體氧化反應產生的有害產物，對細胞膜、線粒體、遺傳物質(DNA)、脂肪和碳水化合物等具有強損害作用［5］，目前認為自由基為機體衰老及多種疾病發(fā)生的根源。傳統(tǒng)研究使用的金屬硫蛋白主要提取于動物肝臟，但存在周期時間長、提取量低和價格昂貴等弊端，而從微生物中誘導提取金屬硫蛋白因其周期短、易操作與價格低廉等特點逐漸引起了各國學者的重視。本文以兔肝Zn-MT為對照，探討了兩種異構形式的酵母源金屬硫蛋白體外清除自由基及抑菌功能活性，為金屬硫蛋白的活性研究及深入開發(fā)利用提供一定的實驗基礎及數據支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

兔肝Zn-MT(純度99%) 購自大連保稅區(qū)聯合博泰生物技術有限公司;酵母源金屬硫蛋白(MT-Ⅰ、MT-Ⅱ，純度95%) 黑龍江八一農墾大學食品學院實驗室自提;結晶紫(Cv)、硫酸亞鐵(FeSO4)、過氧化氫(H2O2)、鄰苯三酚 國藥集團化學試劑有限公司。

DPPH sigma公司;ultrospec 3300 pro紫外分光光度計 英國Biochrom公司;BP301S電子天平 德國Sartorius公司。

1.2 實驗方法

1．2．1 酵母源金屬硫蛋白對羥自由基清除率 與H2O2與Fe2+能夠混合產生羥基自由基，而過氧化氫自由基能夠與結晶紫發(fā)生親電加成反應，從而使結晶紫褪色［6］，因此采用H2O2-Fe2+體系體外模擬產生羥基自由基，以結晶紫為顯色劑，探討酵母源金屬硫蛋白對羥自由基清除率。并稍加改進，實驗前使用蒸餾水將結晶紫配制為0．7×10-3mol/L溶液，硫酸亞鐵配制為0．7×10-3mol/L溶液，過氧化氫采用蒸餾水配制為0．05%(質量分數)溶液。取1．2mL結晶紫溶液和0．2mL FeSO4溶液于比色皿中，510nm處測定吸光值 A0，分別加入0．16mL H2O2溶液，510nm 處測定吸光值A1，向上述溶液體系中分別加入不同濃度MT樣品及Vc溶液，加入同體積蒸餾水為空白組，用Tris-HCl緩沖液稀釋至20mL，測定吸光值，室溫避光靜置5min，測定吸光值A2，羥自由基的清除率(S)參照以下公式計算:

1．2．2 酵母源金屬硫蛋白對超氧陰離子自由基清除率 參照文獻方法，采用鄰苯三酚體系測定MT對超氧陰離子自由基清除率［7］。實驗前將鄰苯三酚配置為5×10-3mol/L溶液，取0．15mL鄰苯三酚溶液于25mL比色皿中，加25℃的Tris-HCl緩沖液定容至20mL，調節(jié) pH7．7，322nm 處迅速測定體系吸光值A3，向上述溶液體系中分別加入不同濃度MT樣品及VC溶液，另設同體積蒸餾水為空白組，30℃靜置溫浴1h，322nm處迅速測定溶液吸光值A4。超氧陰離子自由基清除率(S)按以下公式計算。

1．2．3 酵母源金屬硫蛋白對DPPH自由基清除率 DPPH自由基是一種極為穩(wěn)定的有機自由基，DPPH自由基溶于甲醇后顯紫紅色，當加入自由基清除劑后，DPPH的孤對電子被配對，從而褪色，因此DPPH被廣泛用于自由基清除及抗氧化研究。參照文獻方法［8］，實驗前將 DPPH 配制為 59．85μmol/L 工作液，分別取3．9mL DPPH工作液與0．1mL甲醇混合加入25mL比色皿中，517nm處測定吸光值A5，向上述溶液體系中分別加入不同濃度MT樣品及VC溶液，另設同體積蒸餾水為空白組，室溫避光靜置5min，測定吸光值A6，按以下公式計算不同樣品對DPPH自由基清除率(S)。

1．2．4 酵母源金屬硫蛋白抑菌活性 無菌條件下挑取金黃色葡萄球菌、大腸桿菌與李斯特氏菌單菌落接種于MRS液體培養(yǎng)基中，37℃進行傳代培養(yǎng)，每隔12h傳代一次，兩次傳代培養(yǎng)后，經觀察菌落形態(tài)趨于一致并與典型菌落形態(tài)描述一致，可認為指示菌已獲得純培養(yǎng)［9］，符合后續(xù)實驗要求。采用牛津杯法檢測MT對致病菌的抑制效果。加熱融化指示菌培養(yǎng)基，冷卻后倒平板。待平板凝固后，均勻放入牛津杯。再將指示菌半固體培養(yǎng)基融化，冷卻至45～50℃，把指示菌液先稀釋至10-2后，吸取50μL接入指示菌半固體培養(yǎng)基中，倒平板。待平板凝固后將牛津杯拔出，在孔中加入50μL不同濃度MT樣品溶液。30℃培養(yǎng)24h，觀察有無抑菌圈產生，測量抑菌圈直徑，繪制MT抑菌譜，其中每個樣品設2個重復，抑菌圈直徑取其平均值［10］。

2 結果與分析

2.1 酵母源金屬硫蛋白對羥基自由基清除作用

MT對Cv-FeSO4-H2O2體系所產羥基自由基清除作用如圖1所示，Zn-MT、MT-Ⅰ、MT-Ⅱ和VC溶液對羥基自由基均有顯著的清除效果，且具有良好的量效關系。與VC處理組比較，40～100μg/mL時，Zn-MT處理組對自由基清除效果極顯著(p=0．0076＜0．01)，MT-Ⅰ(p=0．0127 ＜ 0．05)與 MT-Ⅱ(p=0．0191＜0．05)處理組對自由基清除效果顯著，MT 對羥基自由基的清除能力約為VC3倍。當MT終濃度達到80μg/mL后，羥基自由基清除率達到峰值，80μg/mL以后清除效果趨于平緩。三種MT樣品對羥基自由基的清除能力關系為Zn-MT＞MT-Ⅰ＞MT-Ⅱ。

圖1 酵母源金屬硫蛋白對羥自由基清除率Fig．1 The scavenging rate of metallothioneins from yeast on·OH

2.2 酵母源金屬硫蛋白對超氧陰離子自由基清除作用

鄰苯三酚在堿性條件下能夠發(fā)生自氧化反應［11］，產生穩(wěn)定濃度的超氧陰離子自由基與中間物，中間物又與超氧陰離子自由基反應，得到一種帶有顏色的中間產物，此物在紫外有吸收，這為體外模擬機體超氧陰離子自由基并實時監(jiān)測其數量提供可能性。本實驗以鄰苯三酚氧化體系成功模擬了機體超氧陰離子，同時測定Zn-MT、MT-Ⅰ、MT-Ⅱ和VC溶液對超氧陰離子的清除作用。結果顯示，四種樣品對超氧陰離子均有較好的清除作用，隨著樣品濃度的升高，對超氧陰離子的清除率呈上升趨勢，當樣品濃度為100μg/mL時清除效果最好。在整個自由基清除過程中，當樣品濃度達到60μg/mL后，與各MT處理組比較，VC溶液對超氧陰離子的清除效果最為顯著(p=0．0069 ＜0．01)，三種 MT 樣品對超氧陰離子的清除效果相當，結果見圖2。

表1 酵母源金屬硫蛋白對致病菌抑菌圈直徑Table 1 The inhibitory zone of metallothioneins from yeast on pathogenic bacteria

圖2 酵母源金屬硫蛋白對超氧陰離子自由基清除率Fig．2 The scavenging rate of metallothioneins from yeast on

2.3 酵母源金屬硫蛋白對DPPH自由基清除作用

DPPH作為一種穩(wěn)定的固體自由基［12］，目前已被廣泛用于生物試劑、抗氧化試劑和食品等抗氧化能力的定量分析。Zn-MT、MT-Ⅰ、MT-Ⅱ和VC溶液對DPPH自由基清除作用如圖3所示，四種樣品對DPPH均有一定的清除效果，隨著樣品濃度的增加，三種MT樣品對DPPH自由基的清除能力也逐漸增強，切呈劑量依賴關系，但VC溶液濃度達到60μg/mL后對DPPH的清除效果趨于穩(wěn)定。當樣品濃度達到80μg/mL后，Zn-MT與MT-Ⅰ對DPPH自由基的清除能力極顯著高于VC(p＜0．01)，MT-Ⅱ對DPPH自由基的清除能力顯著高于VC(p＜0．05)。相同濃度下，樣品對DPPH自由基的清除能力關系為Zn-MT＞MT-Ⅰ ＞MT-Ⅱ ＞VC。

2.4 酵母源金屬硫蛋白對三種致病菌抑制作用

圖3 酵母源金屬硫蛋白對DPPH自由基清除率Fig．3 The scavenging rate of metallothioneins from yeast on DPPH·

目前對金屬硫蛋白的研究主要集中在提純或抗氧化等功能活性的研究，對金屬硫蛋白抑制致病菌方面還鮮有報道，實驗選取金黃色葡萄球菌、大腸桿菌與李斯特氏菌為指示菌，探討MT對三種致病菌抑制作用。MT對三種致病菌抑菌圈直徑如表1所示，目前對抑菌劑抑菌效果評價標準通常采用NCCLLS［13］所制定的:6～10mm 為低敏，10～15mm 為中敏，＞15～20mm為高敏，由此判定，在50～100μg/mL濃度范圍內，Zn-MT對金黃色葡萄球菌與李斯特氏菌抑菌圈直徑范圍為 3．2～12．7mm，屬于中敏級別，MT-Ⅰ添加量為150μg/mL時對金黃色葡萄球菌與李斯特氏菌抑菌圈直徑為11mm，屬于中敏級別;MT-Ⅱ對金黃色葡萄球菌與李斯特氏菌抑菌圈直徑范圍為3．6～6mm，屬于低敏級別。實驗同時發(fā)現，三種MT樣品對大腸桿菌的抑菌效果均較差，近乎于無抑菌效果。

3 結論與討論

經過近半個世紀的研究，金屬硫蛋白作為強抗氧化功能活性物質已逐漸被人們所熟知，尤其是在醫(yī)療、美容、保健食品等方面的應用與開發(fā)引起國內外學者越來越多的興趣。由于目前對金屬硫蛋白的研究多數集中在動物源金屬硫蛋白，而動物源金屬硫蛋白在價格與提取率方面具有較大的局限性，所以本實驗選取酵母源金屬硫蛋白為實驗材料，探討不同異構形式酵母源金屬硫蛋白與兔肝Zn-MT在體外清除自由基與抑菌活性方面的差異性。

實驗結果表明，金屬硫蛋白能夠顯著清除體外自由基，對于羥基自由基與DPPH自由基，金屬硫蛋白的清除效果顯著強于VC，但VC在清除超氧陰離子方面較金屬硫蛋白表現效果更好。抑菌實驗證明金屬硫蛋白對金黃色葡萄球菌與李斯特氏菌具有一定的抑制作用，但對大腸桿菌的抑制作用不明顯，這為金屬硫蛋白的保健功能聯合防腐功能在食品中的應用提供了新思路。與酵母源金屬硫蛋白比較，兔肝Zn-MT無論在清除自由基或是抑菌方面效果較強，但差異性不大，這可能是因為本實驗所選用金屬硫蛋白純度不足。由于金屬硫蛋白家族龐大，異構體形式復雜，而通常所指的金屬硫蛋白主要為MT-Ⅰ、MT-Ⅱ，因此本實驗選取MT-Ⅰ與MT-Ⅱ兩種異構形式進行研究，探討金屬硫蛋白在自由基清除與抑菌方面的構效關系。研究發(fā)現，在自由基清除與抑菌方面，MT-Ⅰ效果要好于MT-Ⅱ，該結果與已有報道相似［14］。

由于機體釋放自由基方式復雜，且自由基種類不同，因此酵母源金屬硫蛋白清除機體自由基的構效、量效關系及清除機制仍待進一步研究與闡述。但在本實驗中，酵母源金屬硫蛋白顯示出了其強大的抗氧化能力及對部分致病菌的抑制作用，相信隨著研究的深入，酵母源金屬硫蛋白因其安全、經濟及豐富的生物學功能將會在醫(yī)藥、化妝品、保健食品、生物防腐和環(huán)保等方面有著廣闊的市場與發(fā)展前景。

［1］Klaassen C D．Learning to Program the Liver［J］．Annual Review of Pharmacology and Toxicology，2014，54:1-8．

［2］ SkutkovaH，BabulaP，StiborovaM，etal．Structure，Polymorphisms and Electrochemistry of Mammalian Metallothioneins-A Review［J］．Int J Electrochem Sci，2012，7:12415-12431．

［3］蘭欣怡，張彬，羅佳捷．MT對熱應激奶牛外周血淋巴細胞凋亡相關基因cytc和Fas表達水平的影響［J］．中國乳業(yè)，2013，12:44-48．

［4］全先慶，張洪濤，單雷．植物金屬硫蛋白及其重金屬解毒機制研究進展［J］．遺傳，2006(3):375-382．

［5］Liochev S I．Reactive oxygen species and the free radical theory of aging［J］．Free Radical Biology and Medicine，2013，60:1-4．

［6］李連平．小球藻類金屬硫蛋白結構表征及抗氧化與抗菌活性研究［D］．廈門:集美大學，2009．

［7］郭雪峰，岳永德，湯鋒．用清除超氧陰離子自由基法評價竹葉提取物抗氧化能力［J］．光譜學與光譜分析，2008(8):1823-1826．

［8］李紅兵，劉曄瑋，李立．鎖陽清除自由基活性的研究［J］．食品科技，2009(10):166-169．

［9］劉紋芳，曲琪環(huán)，陸黎敏．溶菌酶活力測定及其體外抑菌實驗［J］．飼料博覽，2006，10:5-7．

［10］余風華，高婷婷，張之慧．新疆紫草不同部位不同溶劑提取物體外抑菌效果的研究［J］．食品科技，2014(2):202-204．

［11］ Molyneux P．The use of the stable free radical diphenylpicrylhydrazyl(DPPH)for estimating antioxidant activity［J］．Songklanakarin J Sci Technol，2004，26(2):211-219．

［12］Hauser-Davis R A，Bastos F F，Dantas R F，et al．Behaviour of the oxidant scavenger metallothionein in hypoxia-induced neotropical fish［J］．Ecotoxicology and environmental safety，2014，103:24-28．

［13］韓梅紅．10味中草藥對金黃色葡萄球菌的體外抑菌實驗［J］．長江大學學報:自然科學版，2011(10):240-242．

［14］Huang ，Gu W Q，Hu Y，et al．Separation and Purification of rat liver metallothionein，preparation of α -domain fragments of MT-Ⅱ and their characterization by NMR［J］．Chemical Research in Chinese Universities，1993，4:454-457．