基于DSPE-LC-MS/MS法的畜禽產(chǎn)品中雌激素的測(cè)定

王 剛，孫媛媛，唐曉姝，張秋香，印伯星，房東升，張 灝，陳 衛(wèi)，2，*

(1．江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇無(wú)錫214122;2．江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室江蘇無(wú)錫214122;3．揚(yáng)州市揚(yáng)大康源乳業(yè)有限公司，江蘇揚(yáng)州225004)

環(huán)境激素是由于人類的生產(chǎn)及活動(dòng)而釋放到周圍環(huán)境中，能夠影響人類或動(dòng)物的內(nèi)分泌、神經(jīng)和免疫系統(tǒng)等，從而導(dǎo)致其生殖、發(fā)育異常甚至惡性腫瘤發(fā)生等異常生物學(xué)效應(yīng)的一類環(huán)境污染物［1-6］。1996年歐盟首次將環(huán)境激素分為5大類，其中類固醇類雌激素是一類生物活性最強(qiáng)的環(huán)境激素［7］。雌激素可以分為天然雌激素和人工合成雌激素兩大類:天然雌激素主要來(lái)源于人體和哺乳動(dòng)物，又稱為內(nèi)源性雌激素，主要包括雌酮(estrone，E1)、雌二醇(estradiol，E2)和雌三醇(estriol，E3)等;人工合成雌激素以己烯雌酚(diethylstibestrol，DES)為代表。雌激素類藥物在畜禽養(yǎng)殖中具有通過(guò)蛋白質(zhì)同化作用提高食欲的功效，曾被用來(lái)提高飼料轉(zhuǎn)化率，促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)。但由于人工合成雌激素具有致癌作用，美國(guó)和加拿大已限量使用，而歐盟則禁止使用［8-9］。我國(guó)也于2002年發(fā)布《中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部公告第235號(hào)》，明確將DES及其鹽列為禁止使用的藥物，在動(dòng)物性食品中不得檢出［10］。然而現(xiàn)階段雌激素在動(dòng)物養(yǎng)殖過(guò)程中濫用的情況時(shí)有發(fā)生，畜禽類產(chǎn)品中的雌激素殘留已經(jīng)成為一個(gè)日益嚴(yán)重的食品安全問(wèn)題。因此，對(duì)畜禽產(chǎn)品中雌激素的含量進(jìn)行檢測(cè)很有必要。

雌激素檢測(cè)的傳統(tǒng)方法通常有免疫法［11］、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法［12］、氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法［13］等。本實(shí)驗(yàn)室曾建立了用分散固相萃取方法(DSPE)前處理、液相色譜串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜(LC-MS/MS)測(cè)定牛奶及酸奶中雌激素含量的檢測(cè)方法(DSPE-LC-MS/MS)［14］。本研究在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步使用該方法對(duì)部分畜禽產(chǎn)品中4種雌激素的殘留進(jìn)行了分析。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

雌酮(E1)、雌二醇(E2，96．7%)、雌三醇(E3，97．4%)、己烯雌酚(DES，99．9%) 中國(guó)藥品生物制品檢定所;乙腈、甲醇、醋酸(色譜純)Tedia公司;分析純無(wú)水硫酸鈉、無(wú)水硫酸鎂、氯化鈉，弗羅里硅土(Florisil，60-100 目)，中性氧化鋁(Alumina-N，100-200目):國(guó)藥集團(tuán);N-丙基乙二胺(PSA)Agilent公司;雞肉、牛肉、豬肉、雞肝及雞蛋等 當(dāng)?shù)厥袌?chǎng)。

超高效液相-串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜儀(UPLC-TQD)及 ACQUITY BEH C18柱(1．7μm，100mm × 2．1mm)美國(guó)Waters公司;超聲儀(SB4200DT) 寧波新芝生物技術(shù);電子天平 EL3002(d=0．01g)、分析天平AB103-N(d=0．0001g) 瑞士Mettler Toledo公司;超速離心機(jī)(D-78532) 德國(guó)Hettich公司;小型高速離心機(jī)(5415R) 德國(guó)Eppendorf公司;九陽(yáng)攪拌機(jī)(JYL-C020) 九陽(yáng)股份有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

標(biāo)準(zhǔn)溶液配制:分別精確稱取 E1、E2、E3、DES各2mg置于5mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，配制成終濃度為400mg/L的單標(biāo)儲(chǔ)備液，-20℃保存;為達(dá)到快速檢測(cè)的目的，將4種單標(biāo)儲(chǔ)備液按一定比例混合配成混合標(biāo)準(zhǔn)液，以繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。由于質(zhì)譜儀對(duì)4種雌激素的響應(yīng)值不同，通過(guò)調(diào)整將單標(biāo)儲(chǔ)備液按比例 E1∶E2∶E3∶DES=2∶8∶8∶1 混合，以保證4種雌激素的峰面積在同一數(shù)量級(jí)上。

樣品制備:稱取剔除骨、皮的動(dòng)物肌肉組織及內(nèi)臟樣本200g，用家用攪拌器進(jìn)行攪拌粉碎，-20℃密封保存;雞蛋只需于實(shí)驗(yàn)前去蛋殼，將蛋清與蛋黃打碎攪勻。向攪碎的畜禽產(chǎn)品中添加不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)液(每種濃度做6組平行)，充分?jǐn)嚢杈鶆蚝蟪?min;取4．00g樣品置于50mL聚丙烯離心管中，加入8mL乙腈，渦旋振蕩5min后并于室溫下超聲20min 以充分萃取;加入 0．05g NaCl和 1．60g 無(wú)水MgSO4，渦旋振蕩1min，8000r/min、4℃離心10min;取1mL上清至1．5mL離心管中，加入80mg PSA，渦旋振蕩 1min，6000r/min、4℃離心 6min，上清液經(jīng) 0．22μm微孔濾膜過(guò)濾，濾液用LC-MS/MS測(cè)定。

液相色譜條件［14］:色譜柱:ACQUITY BEH C18(1．7μm，100mm × 2．1mm);流動(dòng)相:1% 醋酸銨溶液(A)和甲醇(B);采用梯度洗脫程序:0～0．3min，90%A，10%B(保持 0．2min);0．5～2min，10%A，90%B;2～3min，0% A，100% B(保 持 2min);流 速:0．3mL/min;進(jìn)樣體積:2μL。

質(zhì)譜條件［14］:電離方式:ESI-;霧化器壓力:310．3kPa;離子噴霧電壓:4000V;干燥器(N2)流速:650L/min;柱溫:40℃;離子源溫度:120℃;檢測(cè)以多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)方式掃描;4種雌激素經(jīng)優(yōu)化后的質(zhì)譜分析參數(shù)見(jiàn)表1。

表1 4種雌激素質(zhì)譜分析參數(shù)Table 1 MS/MS parameters of 4 estrogens

數(shù)據(jù)處理:作圖及實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)、分析均使用Microsoft office Excel 2013。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品前處理?xiàng)l件的選擇

萃取劑與其用量對(duì)回收率的影響:同處理牛奶及酸奶樣品結(jié)果相似［14］，當(dāng)分別使用乙腈和甲醇以沉淀畜禽產(chǎn)品中的蛋白質(zhì)并萃取雌激素時(shí)，甲醇處理后的樣品離心分層效果不明顯，上清液較渾濁;而乙腈萃取的樣品分層效果明顯，上清液清澈。因此本實(shí)驗(yàn)的萃取溶劑仍選擇乙腈。經(jīng)調(diào)整，當(dāng)使用8mL乙腈處理4．0g畜禽樣品時(shí)，萃取液可達(dá)澄清且足夠檢測(cè)。

吸水劑及其用量對(duì)回收率的影響:本研究發(fā)現(xiàn)在雞肉中以無(wú)水MgSO4作為吸水劑時(shí)，4種雌激素的回收率要明顯高于使用相同量的無(wú)水Na2SO4作為吸水劑(結(jié)果未顯示)。因此選擇無(wú)水MgSO4作為樣品制備時(shí)的吸水劑并進(jìn)一步對(duì)雞肉樣品中無(wú)水MgSO4的最適加入量進(jìn)行了研究。如圖1所示，在4．0 g雞肉樣品中加入0．05g NaCl及不同量的無(wú)水MgSO4，分別檢測(cè)其回收率。結(jié)果顯示當(dāng)加入 1．60g無(wú)水MgSO4時(shí)，4種雌激素的回收率最高，隨著無(wú)水MgSO4含量的增加，回收率幾乎保持不變或稍稍有所下降。因此在本研究中每4．00g畜禽產(chǎn)品中無(wú)水MgSO4的添加量定為 1．60g。

圖1 添加無(wú)水MgSO4對(duì)回收率的影響Fig．1 Effect of MgSO4amount on the recovery of 4 estrogens

固相分散吸附劑對(duì)回收率的影響:本研究分別以PSA、Florisil和Alumina-N作為固相分散吸附劑檢測(cè)了其對(duì)雞肉中雌激素回收率的影響。同牛奶中的情況一致，PSA處理過(guò)的樣品明顯澄清于用Florisil和Alumina-N處理的樣品(結(jié)果未顯示)。因此，選擇PSA作為分散固相吸附劑。

2.2 流動(dòng)相選擇及質(zhì)譜條件優(yōu)化

由于檢測(cè)的雌激素相同，本研究沿用了在檢測(cè)牛奶及酸奶中雌激素的流動(dòng)相參數(shù)以及質(zhì)譜條件［14］。流動(dòng)相具體參數(shù)為:體積分?jǐn)?shù)為1%的醋酸銨水溶液和甲醇溶液。

2.3 基質(zhì)效應(yīng)

為了評(píng)估畜禽產(chǎn)品基質(zhì)對(duì)雌激素檢測(cè)的影響，本實(shí)驗(yàn)在質(zhì)譜分析中比較了加標(biāo)雞肝、雞肉、牛肉及雞蛋等樣品的響應(yīng)值(a)與加標(biāo)純水的響應(yīng)值(b)的比率(a/b×100，%)。當(dāng)該比值等于100%時(shí)，說(shuō)明待測(cè)物無(wú)基質(zhì)效應(yīng);如果比值小于100%，說(shuō)明基質(zhì)對(duì)待測(cè)物的離子響應(yīng)產(chǎn)生了抑制作用;若比值大于100%，則說(shuō)明基質(zhì)的存在增強(qiáng)了待測(cè)物的離子響應(yīng)強(qiáng)度［15］。由表 2可見(jiàn)，4種雌激素的響應(yīng)比率為90．16%～99．01%，均在 90%以上。畜禽產(chǎn)品基質(zhì)對(duì)4種雌激素的離子響應(yīng)均只產(chǎn)生了微弱的抑制作用［15］。

表2 4種雌激素在不同樣品中的基質(zhì)效應(yīng)Table 2 Matrix effects of animal products on 4 estrogens

2.4 線性范圍、標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢出限

以雌激素的質(zhì)量濃度為X(μg/L)，以目標(biāo)組分的峰面積為Y(S)作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到4種雌激素對(duì)應(yīng)的線性方程及相關(guān)系數(shù)。如表3所示，各校準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)的平方值(R2)均大于0．99，4種雌激素的質(zhì)量濃度在8～1500μg/L具有良好的線性關(guān)系。以信噪比為3(S/N=3)時(shí)，最低檢出限(LOD)可達(dá)到0．66μg/L，根據(jù)樣品處理方式(樣品∶乙腈 =1∶2)折算至畜禽產(chǎn)品各雌激素最低檢出限為:LOD(E1)=8．06μg/kg，LOD(E2)=16．52μg/kg，LOD(E3)=5．86μg/kg，LOD(DES)=1．32μg/kg。

表3 4種雌激素的線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和線性范圍Table 3 Regression equation，correlation coefficient(R2)，detection limits and linear range of 4 estrogens

2.5 回收率與精密度

在雞肝、雞肉和牛肉樣品中分別添加3個(gè)濃度水平的4種雌激素混合標(biāo)準(zhǔn)液，每個(gè)添加濃度重復(fù)測(cè)定6次，計(jì)算添加回收率和測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(表4)。雞肝中4種雌激素的回收率為75．00%～79．13% ，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為 0．47% ～8．82%;雞肉中 4種雌激素的回收率為77．40%～81．28%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0．42%～6．57%;牛肉中4種雌激素的回收率為75．25% ～80．61% ，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為 0．24% ～6．25%;雞蛋中4種雌激素的回收率為92．36%～96．63%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0．21%～2．06%。采用本方法檢測(cè)，雌激素在禽蛋中的回收率最高可達(dá)96．63%，而在基質(zhì)更為復(fù)雜的畜禽肉類中雌激素的回收率也均在75%以上，參照畜肉產(chǎn)品中其他物質(zhì)的檢測(cè)［16-18］，本方法基本能夠滿足畜禽產(chǎn)品中E1、E2、E3、DES檢測(cè)的要求。

2.6 實(shí)際樣品檢測(cè)

取不同批次和種類的畜禽產(chǎn)品(每種樣品樣本數(shù)≥5)，按照實(shí)驗(yàn)方法1．2中“樣品制備”進(jìn)行樣品前處理操作(不添加混合標(biāo)準(zhǔn)液)，運(yùn)用LC-MS/MS進(jìn)行分析，計(jì)算各樣品中4種雌激素殘留量的平均值，結(jié)果見(jiàn)表5。從表格中可以看到:E1在各樣品中均無(wú)檢出，雞蛋和豬肉中檢測(cè)出微量的E2和E3，在所有樣品中均未檢出人工合成雌激素DES。天然雌激素主要來(lái)源于卵巢的卵泡顆粒細(xì)胞和卵泡內(nèi)膜細(xì)胞。在動(dòng)物體內(nèi)，E2活性最強(qiáng)、含量最多，在體內(nèi)代謝后轉(zhuǎn)化為E1和 E3，一般動(dòng)物肌肉中的平均自然濃度約為10ng/g［19］。本實(shí)驗(yàn)所收集樣品中檢測(cè)到的E2，E3含量均在天然濃度范圍內(nèi)，且未檢測(cè)到人工合成雌激素DES，可以排除飼養(yǎng)過(guò)程中人為添加雌激素的情況。

表4 4種雌激素在雞肝、雞肉、牛肉和雞蛋中的加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)Table 4 Spiked recoveries and RSD of 4 estrogens in chicken liver，chicken，beef and egg(n=6)

表5 樣品中4種雌激素含量測(cè)定Table 5 4 estrogens content in the animal products on market

3 結(jié)論

本研究利用實(shí)驗(yàn)室建立的在牛奶及酸奶中檢測(cè)雌激素含量的DSPE-LC-MS/MS分析方法對(duì)畜禽產(chǎn)品包括雞肉、雞肝、雞蛋、牛肉及豬肉中的4種雌激素進(jìn)行了檢測(cè)，取得了較為滿意的結(jié)果。該檢測(cè)手段采用DSPE前處理方法，操作簡(jiǎn)便、無(wú)需特殊設(shè)備，對(duì)于畜禽產(chǎn)品中雌激素的提取凈化效果較好，回收率較高，所得樣品經(jīng)液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用檢測(cè)靈敏度高、無(wú)明顯基質(zhì)效應(yīng)。該方法可用于畜禽產(chǎn)品中E1、E2、E3以及DES等雌激素的殘留檢測(cè)。

［1］Martin O V，Lester J N，Voulvoulis N，et al．Human Health and Endocrine Disruption:A Simple Multicriteria Framework for the Qualitative Assessment of End Point-Specific Risks in a Context of Scientific Uncertainty［J］．Toxicological Sciences，2007，98(2):332-347．

［2］Boyle E，Mmsonneuve E，Autier P．Update on cancer control in women［J］．InternationalJoumal of Gynecology，2000，70(2):263-303．

［3］Carlsen E，Giwercman A，Keiding N，et al．Evidence for decreasing qualities of semen during past 50 years［J］．British Medical Journal，1992，305:609-613．

［4］徐兩蒲，劉暉，王子敬．性早熟女童性激素水平測(cè)定分析［J］．福建醫(yī)藥雜志，2006，28(4):66-67．

［5］林奕芝，司徒潮滿，劉奮，等．GC-MS法測(cè)定肉中雌激素殘留量方法的研究［J］．中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2007，17(7):1165-1167．

［6］王玉飛，周凱，摯繼革．GC-MS-MS法同時(shí)測(cè)定海產(chǎn)品中4 種雌激素殘留［J］．中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2006，16(1):21-23．

［7］Norgil Damgaard，Main KM，Toppari J，et al．Impact of exposure to endocrine disrupters in utero and in childhood on adult reproduction［J］．Best Pract Res Clin Endocrinol Metab，2002，16(2):289-309．

［8］Lopez de Alda M J，Barcelo D．Determination of steroid sex hormones and related synthetic compounds considered as endocrine disrupters in water by liquid chromatography-diode array detection mass spectrometry［J］．Journal of Chromatography A，2000，892(1-2):391-406．

［9］李凱年，姜荃．國(guó)外對(duì)食品藥物殘留控制的發(fā)展趨勢(shì)［J］．世界農(nóng)業(yè)，2003(5):44-46．

［10］中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部，動(dòng)物性食品中獸藥最高殘留限量［S］．農(nóng)業(yè)部公告第235 號(hào)，2002．12

［11］孫俐，鄭文杰，唐丹舟．S/N1956-2007肉及肉制品中己烯雌酚殘留量的檢測(cè)方法-酶聯(lián)免疫法［S］．北京:中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2007．

［12］張翠英，李振國(guó)，徐金玲．LC-MS測(cè)定豬肉中己烯雌酚方法的研究［J］．中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2007，17(5):786-787．

［13］ZHOU Yi-qi，WANGZi-jian，JIA Ning．Formation of multiple trimethylsilyl derivatives in the derivatization of 17αethinylestradiolwith BSTFA or MSTFA followed by gas chromatography- mass spectrometry determination［J］ ．Environmental Sciences，2000，19:879-884．

［14］唐曉姝，張秋香，杜先鋒，等．DSPE-LC-MS/MS法測(cè)定牛奶及酸奶中雌激素［J］．食品工業(yè)科技，2013，34(6):53-56．

［15］Salvador A，Moretton C，Piram A．On-line solid-phase extraction with on-support derivatization for high-sensitivity liquid chromatography tandem mass spectrometry of estrogens in influent/effluent of wastewater treatment plants［J］．Journal of Chromatography，2007，1145:102-109．

［16］梁利妹，胡深，董文婷，等．反相高效液相色譜法對(duì)畜產(chǎn)品中三聚氰胺殘留的檢測(cè)［J］．湖北畜牧獸醫(yī)，2013，34(6):11-14．

［17］曹火仁，孫文梅，彭笑蓉，等．高效液相法測(cè)定畜產(chǎn)品中磺胺類藥物殘留量的研究［J］．四川畜牧獸醫(yī)，2008(6):23-24．

［18］劉祥國(guó)，黃顯會(huì)，盧陽(yáng)雯，等．羊肉中8種有機(jī)磷農(nóng)藥殘留的測(cè)定及基質(zhì)效應(yīng)［J］．中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，42(4):1478-1484．

［19］Lee HB，Peart TE．Determination of 4-nonylphenol in effluent and sludge from sewage treatment plants［J］．Analytical chemistry，1995，67(13):1976-1980．