野艾蒿抑菌成分提取工藝的研究

陳海燕，陳曉平

(1．長春科技學院，吉林長春130600;2．吉林農(nóng)業(yè)大學，吉林長春130118)

艾蒿(Artemisia argyi Levl．et Vant)，又稱灸草，為菊科屬多年生草本植物，在全國分布較廣［1］。迄今為止，艾蒿在我國至少有3000多年的應用歷史，如用于制作艾葉酒、艾葉糕點等。

現(xiàn)代研究表明，艾蒿中的化學成分主要集中在莖、葉兩部分，主要有揮發(fā)油類、黃酮類、桉葉烷類、三萜類和微量化學元素［2-4］等。艾蒿的活性成分具有抗菌和抗病毒成分，其中主要起抑菌作用的物質(zhì)有黃酮、揮發(fā)油和三萜類［5-7］。艾蒿的水浸液對革蘭氏陽性嗜氣菌具有抗菌作用［8-9］。江茂生［10］等研究了艾蒿提取物對植物病原菌的抑制活性，結(jié)果表明艾蒿具有開發(fā)為新型植物源農(nóng)藥的潛力。馬爍等［11-13］以艾蒿中黃酮類物質(zhì)為研究對象，探索黃酮類物質(zhì)對大腸桿菌，金黃色葡萄球菌、黑曲霉和白曲霉的抑制情況。確定了艾蒿中黃酮物質(zhì)對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌抑制較強，但并沒有給出確切數(shù)據(jù)。

本研究以大腸桿菌為指示菌，以艾蒿提取物抑菌圈直徑為響應值，對超聲波輔助乙醇提取法的主要工藝參數(shù)進行優(yōu)化以期獲得最佳提取工藝，旨在探索高效提取艾蒿抑制物質(zhì)的條件。高效提取這些抑菌物質(zhì)可用于食品中果蔬及其制品的殺菌，也為進一步研發(fā)艾蒿功能性食品，保健產(chǎn)品提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

艾蒿(Artemisia argyi L) 雙陽湖水庫;大腸桿菌(Escherichia coli) 長春科技學院食品微生物實驗室;無水乙醇、乙酸乙酯、丙酮 均為分析純。

微型植物粉碎機 天津泰斯特儀器設備有限公司;電熱恒溫鼓風干燥箱 上海精科儀器有限公司;電子天平 上海精科儀器有限公司;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 南京科爾儀器設備有限公司;超凈工作臺 天津永利達實驗室設備有限公司;生化培養(yǎng)箱 上海精科儀器有限公司;超聲波發(fā)生器 上海冠特超聲儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1．2．1 原料預處理 艾蒿在未開花時采收，取新鮮的艾蒿，除去雜質(zhì)，置于干燥箱中在60℃的條件下烘干，再用粉碎機粉碎，過100目篩制成植物干粉，并置于0℃的低溫下密封保存?zhèn)溆谩?/p>

1．2．2 艾蒿抑菌成分生物活性的研究 以大腸桿菌為指示菌，用瓊脂孔穴擴散法［14］來評價艾蒿抗菌成分對大腸桿菌的抑菌效果。判定標準［15］:抑菌圈直徑≥10mm者被判為有抑菌作用，抑菌圈直徑 ＜10mm者被判為無抑菌作用，3次重復實驗均有抑菌作用，才可判為實驗結(jié)果有效。陰性對照組應無抑菌圈產(chǎn)生，否則實驗無效。

1．2．3 單因素實驗

1．2．3．1 超 聲 功 率 對 艾 蒿 提 取 液 抑 菌 效 果 的 影響 準確稱取10g艾蒿粉，超聲功率分別為100、200、300、400、500W，料液比為 1∶20，超聲時間為20min，乙醇濃度為60%，浸提溫度為60℃，浸提時間為8h，抽濾后將濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后定容至25mL。以大腸桿菌為指示菌［16-18］進行抑菌實驗，記錄抑菌圈直徑大小，實驗重復三次。

1．2．3．2 超 聲 時 間 對 艾 蒿 提 取 液 抑 菌 效 果 的 影響 準確稱取10g艾蒿粉，超聲時間分別為10、20、30、40、50min，料液比為 1∶20，超聲功率為 300W，乙醇濃度為60%，浸提溫度為60℃，浸提時間為8 h，方法同 1．2．3．1。

1．2．3．3 乙 醇 濃 度 對 艾 蒿 提 取 液 抑 菌 效 果 的 影響 準確稱取10g艾蒿粉，乙醇濃度分別為40%、50%、60%、70%、80%，料液比為 1∶20，超聲功率為300W，超聲時間為20min，浸提溫度為60℃，浸提時間為 8h，方法同 1．2．3．1。

1．2．3．4 乙醇浸提溫度對艾蒿提取液抑菌效果的影響 準確稱取10g艾蒿粉，浸提溫度分別為50、60、70、80、90℃，料液比為1∶20，超聲功率為 300W，超聲時間為20min，乙醇濃度為60%，浸提時間為8h，方法同 1．2．3．1。

1．2．3．5 乙醇浸提時間對艾蒿提取液抑菌效果的影響 準確稱取10g艾蒿粉，浸提時間分別為2、4、6、8、10h，料液比為1∶20，超聲功率為300W，超聲時間為20min，乙醇濃度為60%，浸提溫度為60℃，方法同1．2．3．1。

1．2．3．6 料液比對艾蒿提取液抑菌效果的影響 準確稱取 10g 艾蒿粉，料液比分別為 1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30，超聲功率為 300W，超聲時間為 20min，乙醇濃度為60%，浸提溫度為60℃，浸提時間為8h，方法同 1．2．3．1。

1．2．4 最佳提取工藝的優(yōu)選 根據(jù)中心組合(Box-Behnken)實驗設計原理，通過四因素三水平的響應面分析方法。通過單因素實驗結(jié)果綜合分析，確定料液比為1∶15，乙醇浸提時間6h，從而選取超聲功率(A)、超聲時間(B)、乙醇濃度(C)、浸提溫度(D)作為考察變量，抑菌圈直徑(Y)為響應值，通過Design-Expert 7．0設計軟件進行多元回歸分析。實驗設計因素水平見表1。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素實驗

2．1．1 超聲功率對艾蒿提取液抑菌效果的影響 超聲功率對艾蒿提取液抑菌效果的影響結(jié)果見圖1。

表1 中心組合實驗方案Table 1 Factors and levels of RAS test

圖1 超聲功率對艾蒿提取物抑菌效果的影響Fig．1 Effect of ultrasonic power on bacteria inhibiting result

由圖1可知，隨著超聲功率增大，艾蒿抑菌能力先增加后減少，超聲功率為200W時艾蒿抑菌成分浸出最多。隨著超聲功率繼續(xù)增加，艾蒿抑菌成分浸出又逐漸減少，導致這種結(jié)果原因可能是當超聲功率較大時，部分艾蒿抑菌成分發(fā)生分解，從而導致抑菌效果降低。

2．1．2 超聲時間對艾蒿提取液抑菌效果的影響 超聲時間對艾蒿提取液抑菌效果的影響結(jié)果見圖2。

圖2 超聲時間對艾蒿提取物抑菌效果的影響Fig．2 Effect of ultrasonic time on bacteria inhibiting result

由圖2可知，隨著超聲時間的延長，艾蒿抑菌物質(zhì)浸出隨之增多。當超聲時間達到30min時艾蒿抑菌物質(zhì)浸出達到最大值，所以選取超聲時間30min作為響應面水平值。

2．1．3 乙醇濃度對艾蒿提取液抑菌效果的影響 乙醇濃度對艾蒿提取液抑菌效果的影響結(jié)果見圖3。

由圖3可知，隨著乙醇濃度增大，抑菌物質(zhì)浸出隨之增多，當乙醇濃度達到60%時，抑菌物質(zhì)浸出達到最大值，抑菌效果最好，所以選取乙醇濃度60%左右作為響應面水平值。

2．1．4 浸提溫度對艾蒿提取液抑菌效果的影響 浸提溫度對艾蒿提取液抑菌效果的影響結(jié)果見圖4。

圖3 乙醇濃度對艾蒿提取物抑菌效果的影響Fig．3 Effect of ethanol concentration on bacteria inhibiting result

圖4 乙醇浸提溫度對艾蒿提取物抑菌效果的影響Fig．4 Effect of ethanol extraction temperature on bacteria inhibiting result

由圖4可知，浸提溫度在50～70℃范圍內(nèi)，隨著溫度升高，抑菌效果隨之增強，當溫度達到70℃時，抑菌效果最好，之后，隨著溫度繼續(xù)升高，抑菌效果反而下降，所以選取浸提溫度70℃左右作為響應面水平值。

2．1．5 浸提時間對艾蒿提取液抑菌效果的影響 浸提時間對艾蒿提取液抑菌效果的影響結(jié)果見圖5。

圖5 乙醇浸提時間對艾蒿提取物抑菌效果的影響Fig．5 Effect of ethanol extraction time on bacteria inhibiting result

由圖5可知，隨著時間增長，抑菌效果隨之增強，浸提時間為6h時艾蒿提取物的抑菌效果最好，6h后隨著時間繼續(xù)增長，浸提物浸出不明顯，這說明提取時間達到6h時抑菌成分已經(jīng)充分溶出。因此，綜合考慮在響應面實驗設計中選取浸提時間為6h。

2．1．6 料液比對艾蒿提取液抑菌效果的影響 料液比對艾蒿提取液抑菌效果的影響結(jié)果見圖6。

圖6 料液比對艾蒿提取物抑菌效果的影響Fig．6 Effect of ratio of liquid material on bacteria inhibiting result

由圖6可知，隨著料液比逐漸增大，艾蒿抑菌效果隨之增強，當料液比為1∶15時，抑菌效果最佳，當料液比繼續(xù)增加時，抑菌圈直徑基本沒有增加。在響應面實驗設計中選取料液比為1∶15。

2.2 回歸模型的建立及顯著性檢驗

按照Box-Behnken實驗方案進行四因素三水平實驗，結(jié)果見表2。將所得的實驗數(shù)據(jù)采用響應面Design Expert7．0軟件進行多元回歸擬合，得到以抑菌圈直徑(cm)對超聲功率(W)、超聲時間(min)、乙醇濃度(%)、浸提溫度(℃)的二次多項回歸方程為:Y=2．60+0．27A+0．24B+0．19C+0．18D+0．14AB-0．097AC-0．010AD-5．000 × 10-3BC+0．098BD+0．025CD-0．23A2-0．33B2-0．28C2-0．36D2

表2 響應面實驗設計及結(jié)果Table 2 Program and results of RSM test

表3 響應面實驗方差分析Table 3 Variance analysis for the developed regression model

式中:Y-抑菌圈直徑(cm)，A-超聲功率(W)，B-超聲時間(min)，C-乙醇濃度(%)，D-浸提溫度(℃)。

為檢驗方程的有效性，對超聲波提取艾蒿抑菌成分的數(shù)學模型進行方差分析，結(jié)果如表3所示。

由表3可以看出，一次項回歸模型均達到極顯著水平(p＜0．01)，說明超聲功率、超聲時間、乙醇濃度和浸提溫度對艾蒿抑菌成分提取有極顯著影響，表明回歸方程與實際情況吻合較好，實驗誤差小。所以可用該回歸方程代替實驗真實點對實驗結(jié)果進行分析。交互項AB達到極顯著水平(p＜0．01)，說明超聲功率和超聲時間交互項對艾蒿抑菌成分提取有極顯著影響，交互項AC、BD達到顯著水平(p＜0．05)，說明超聲功率和乙醇濃度交互項、超聲時間和浸提溫度對艾蒿抑菌成分提取有顯著影響。二次項A2、B2、C2、D2均達到極顯著水平(p ＜ 0．01)?；貧w模型中 A、B、C、D、AB、AC、BD、A2、B2、C2、D2作用顯著。由各變量顯著性檢驗F值的大小，可以得出艾蒿抑菌成分提取的各影響因素按大小依次排序為:超聲功率、超聲時間、乙醇濃度、浸提溫度。

2.3 響應面及等高線分析結(jié)果

利用Design Expert7．0軟件，根據(jù)回歸方程分析作響應曲面見圖7、圖8、圖9、圖10。

如圖7所示，超聲功率與超聲時間的曲面均較陡，說明超聲功率與超聲時間對抑菌圈直徑的大小有極顯著的影響。等高線趨近于橢圓形，說明超聲功率與超聲時間的交互項對抑菌圈直徑的大小有極顯著的影響。

圖7 超聲功率與超聲時間對艾蒿抑菌物質(zhì)提取的影響的響應面圖Fig．7 Response surface showing the effects of ultrasonic power and ultrasonic time on the Artemisia argyi antibacterial ingredient

如圖8所示，超聲功率與乙醇濃度的曲面明顯的較陡，呈二次關系，說明超聲功率與乙醇濃度對抑菌圈直徑的大小有極顯著的影響。等高線趨于橢圓形，表示這兩個因素的交互項也對抑菌圈直徑有顯著的影響。

如圖9所示，超聲功率的曲面較陡，呈二次關系，對抑菌圈直徑的大小影響較大，等高線呈圓形說明兩因素的交互項影響不顯著。

圖8 超聲功率與乙醇濃度對艾蒿抑菌物質(zhì)提取的影響的響應面圖Fig．8 Response surface showing the effects of ultrasonic power and ethanol concentration on the Artemisia argyi antibacterial ingredient

圖9 超聲功率與浸提溫度對艾蒿抑菌物質(zhì)提取的影響的響應面圖Fig．9 Response surface showing the effects of ultrasonic power and extraction temperature on the Artemisia argyi antibacterial ingredient

如圖10所示，超聲時間與浸提溫度的曲面均較陡，呈二次關系，說明超聲時間與浸提溫度對抑菌圈直徑的大小有顯著的影響。與此同時等高線趨于橢圓形，表示這兩個因素的交互項也對抑菌圈直徑有顯著的影響。

圖10 超聲時間與浸提溫度對艾蒿抑菌物質(zhì)提取的影響的響應面圖Fig．10 Response surface showing the effects of ultrasonic time and extraction temperature on the Artemisia argyi antibacterial ingredient

2.4 超聲波提取法響應面優(yōu)化結(jié)果

經(jīng)響應面7．0軟件的數(shù)值優(yōu)化與二次回歸模型的數(shù)據(jù)分析，本研究提取艾蒿抑菌成分的最佳工藝參數(shù)為:超聲時間為 35．62min、超聲功率為 269．74 W、浸提溫度為73．27℃、乙醇濃度為51．18%，大腸桿菌抑菌圈直徑預測值為2．78cm。

2.5 野生艾蒿抑菌成分最佳提取條件的確定和驗證實驗

結(jié)合實際操作的數(shù)據(jù)真實性，并驗證預測結(jié)果，在最佳提取工藝條件下:超聲時間35min、超聲功率270W、浸提溫度73℃、乙醇濃度51%重復實驗3次，結(jié)果艾蒿提取液抑菌圈直徑為2．62cm。與預測值2．78cm相對誤差為6．11%，說明該分析結(jié)果與實際操作結(jié)果擬合良好，充分驗證所建模型正確性，說明響應面法適用于對野生艾蒿抗菌物質(zhì)的超聲提取工藝參數(shù)優(yōu)化及回歸分析。

3 結(jié)論

超聲波輔助乙醇提取法的最佳工藝條件為:超聲功率270W、超聲時間35min、乙醇濃度51%、浸提溫度73℃、乙醇浸提時間6h、料液比1∶15，該條件下，獲得的艾蒿抗菌成分抑菌圈直徑為2．62 cm。

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