高效液相色譜 串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定農(nóng)田土壤中31種三嗪類除草劑殘留

王曉春+劉慶龍+楊永亮

摘 要 建立了高效液相色譜 三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜（HPLC MS/MS）同時檢測農(nóng)田土壤中31種三嗪類除草劑殘留的分析方法。土壤樣本經(jīng)加速溶劑萃取，Oasis MCX固相萃取柱凈化后，在多反應監(jiān)測（MRM）正離子電噴霧模式下進行HPLC MS/MS分析。色譜柱為Phenomenex Luna C18反相柱（150 mm × 2.0 mm × 3 μm），流動相為梯度變化的乙腈和0.1%甲酸溶液。檢出限（S/N≥3）為0.008～0.440 μg/L，在各自的考察濃度范圍內(nèi)線性關系良好（r≥0.996）；在0.40～40.0 μg/kg 添加水平內(nèi)，平均加標回收率為76.9%～102.0%，RSD為3.4%～10.3%。利用本方法對沈陽地區(qū)農(nóng)田表土的篩查發(fā)現(xiàn)，阿特拉津、西瑪津、撲草凈和脫乙基阿特拉津為該區(qū)域主要的三嗪類除草劑物種。

關鍵詞 高效液相色譜 串聯(lián)質(zhì)譜；農(nóng)田土壤；三嗪類除草劑

1 引 言

三嗪類除草劑是結構上以具有3個碳和3個氮對稱排列的六元環(huán)結構為母體的一類化合物，因此又被稱作均三氮苯類除草劑。自20世紀50年代被推出以來，其作為預防農(nóng)田雜草生長的高效除草劑在世界范圍內(nèi)廣泛使用，并在農(nóng)業(yè)上發(fā)揮了重要的作用。盡管近年來有新型除草劑逐漸取代三嗪類除草劑的趨勢，但三嗪類除草劑仍是我國所采用的大型品種系列，每年產(chǎn)量、用量均很大。該類除草劑具有一定的“三致”作用， Sanderson等[1]發(fā)現(xiàn)，阿特拉津等三嗪類除草劑能通過改變?nèi)梭w內(nèi)CYP19酶的活性而干擾和破壞生物體的內(nèi)分泌系統(tǒng)平衡， 引起包括癌癥在內(nèi)的一系列病癥。美國環(huán)保署將阿特拉津、西瑪津等列入優(yōu)先控制污染物名單，歐盟在2007年底全部停止了三嗪類除草劑在農(nóng)業(yè)中的使用。

三嗪類除草劑分子因其低水溶性，可形成獨立的非水相而極易吸附到土壤固相中， 加上特有的均三氮苯環(huán)結構能抵抗微生物的進攻， 因此不易被微生物所降解，雖然土壤自身的凈化作用可以減少三嗪類除草劑的污染程度，但如果進入土壤中的三嗪類除草劑含量在數(shù)量和速度上超過土壤的環(huán)境容量， 仍會導致土壤的污染，并隨著降水、淋溶和徑流的作用，引起地表水和地下水污染。因此，建立農(nóng)田土壤中三嗪類除草劑的快速、高效、準確的檢測方法是確保我國的農(nóng)田生態(tài)環(huán)境安全的前提和迫切任務之一。

目前，對三嗪類除草劑殘留檢測方法的研究主要集中在水體[2～5]、谷物[6～9]、水果[10]、體液[11]、底泥[12]和動物內(nèi)臟[13]等生態(tài)環(huán)境樣品，采用的方法包括氣相色譜法（GC）、高效液相色譜法（HPLC）、氣相色譜 質(zhì)譜聯(lián)用法（GC MS）、液相色譜 質(zhì)譜聯(lián)用法（HPLC MS）和液相色譜 串聯(lián)質(zhì)譜法（HPLC MS/MS）等，但涉及土壤中三嗪類除草劑的檢測多見于單殘留檢測或少量三嗪類除草劑品種的檢測[14～18]，而對土壤的多殘留檢測報道相對較少。本實驗建立了檢測農(nóng)田土壤中31種三嗪類除草劑殘留量的HPLC MS/MS方法。本方法簡單可靠， 靈敏度高， 能滿足土壤中三嗪類除草劑環(huán)境殘留監(jiān)控的需要。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

API4000高效液相色譜 三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜，配有電噴霧離子源和Analyst 1.4.2 工作站（美國AB SCIEX公司）； DIONEX 200型加速溶劑萃取儀；KL512/519J型氮吹儀（北京康林科技有限公司）；METLER TOLEDO AL204型電子天平（瑞士METLER公司）。 免疫親和柱（Oasis MCX固相萃取柱，3 mL/60 mg， Waters公司）。

甲醇和乙腈（Fisher Scientific公司）；甲酸（色譜純，百靈威公司）；實驗用水為Millipore高純水。

31種標準樣品（阿特拉津、西瑪津、另丁津、脫乙基另丁津、特丁津、環(huán)丙津、撲滅津、草達津、莠滅凈、敵草凈、嗪草酮、西草凈、蓋草津、異戊乙凈、撲草凈、特丁凈、殺草凈、疊氮津、西瑪通、莠去通、撲滅通、密草通、特丁通、苯嗪草酮、環(huán)嗪酮、草凈津、脫乙基阿特拉津、脫異丙基阿特拉津、脫乙基脫異丙基阿特拉津、吡唑草胺、異丙甲草胺）純度大于97%，購于Sigma Aldrich公司。

2.2 混合標準溶液的配制

分別稱取31種三嗪類除草劑標準品2.0 mg，置于棕色樣品瓶中，溶解于10 mL甲醇中，得到濃度為200 mg/L的單標儲備液。精密量取各單標儲備液40 μL，添加360 μL甲醇，配成為濃度為5 mg/L的混標溶液儲備液，置于4 ℃冰箱中保存。

標準曲線溶液的配制：取5 mg/L混標溶液儲備液適量，以甲醇進行逐級稀釋，得到濃度分別為0.1， 0.2， 0.5， 1.0， 2.0， 5.0， 10.0， 20.0， 50.0， 100.0和200.0 μg/L的梯度混合標準溶液。

2.3 樣品前處理

2.3.1 樣品的提取 土壤樣本放置于陰涼處自然晾干，粉碎后過40目篩。稱取10 g樣品，放入加速溶劑萃取儀22 mL固相萃取池中，以丙酮 二氯甲烷（1∶1，V/V）為萃取溶劑進行加速溶劑萃取。設定萃取溫度60 ℃，預熱時間5 min，靜態(tài)時間10 min，，萃取壓力為10.3 MPa，循環(huán)次數(shù)2次。吹掃時間90 s。提取液氮吹近干后，用1 mL 5%甲酸的二氯甲烷溶液復溶，待凈化。

2.3.2 樣品的凈化 依次用4 mL丙酮和2 mL二氯甲烷預淋洗Oasis MCX固相萃取小柱后，提取液上柱，再用1 mL5%甲酸的二氯甲烷溶液洗滌樣品瓶一次，洗液過固相萃取柱，棄去流出液；用2 mL二氯甲烷淋洗固相萃取柱，用吸耳球吹出柱內(nèi)殘留的液體。最后用4 mL 5%氨水乙腈溶液淋洗，用吸耳球吹出柱內(nèi)殘留液體，收集洗脫液并濃縮近干，用乙腈∶水（2∶3，V/V）溶液溶解殘渣并定容至2 mL，膜過濾，待測。

2.4 色譜與質(zhì)譜條件

2.4.1 液相色譜條件 色譜柱： Luna C18 柱（150 mm × 2.0 mm × 3 μm，美國Phenomenex 公司）；柱溫： 30 ℃；進樣量5 μL。 以0.1%甲酸溶液（A相）和乙腈（B相）流動相進行線性梯度洗脫，具體梯度洗脫條件見表1。

2.4.2 質(zhì)譜條件 離子源： 電噴霧離子源（ESI）， 掃描方式：正離子掃描；檢測方式：多反應監(jiān)測（MRM） 模式；離子噴射電壓（IS）：5200 V；霧化溫度（TEM）：550 ℃；源內(nèi)氣體1壓力（GS1）： 0.448 MPa； 氣體2壓力（GS2）： 0.345 MPa； 氣簾氣體壓力（Curtain Gas）： 0.103 MPa； 碰撞氣壓力（CAD）： 0.055 MPa； 其它質(zhì)譜參數(shù)見表2。

3 結果與討論

3.1 樣品前處理條件的優(yōu)化

根據(jù)文獻調(diào)研結果，土壤樣品可以采用索式提取、超聲萃取和加速溶劑萃取等方式進行提取，其中加速溶劑萃取技術由于操作簡便、綠色環(huán)保及有利于批量處理而得到廣泛應用。因此，本實驗采用加速溶劑萃取技術對土壤中三嗪類除草劑進行提取?？疾炝颂崛∪軇?、溫度、壓力等因素對提取效果的影響，發(fā)現(xiàn)當萃取溫度在60 ℃，萃取溶劑為丙酮 二氯甲烷（1∶1，V/V），萃取壓力為10.3 MPa，循環(huán)2次時提取效率最高。凈化程序上，分別考察了3種固相萃取柱Oasis MCX、Oasis HLB和Supelclean LC SCX的凈化效果，發(fā)現(xiàn)采用Oasis MCX固相萃取柱凈化時，基線平穩(wěn)且雜質(zhì)少，效果較好。因此本實驗采用Oasis MCX固相萃取柱對樣品進行凈化處理。

3.2 液相色譜和質(zhì)譜方法優(yōu)化

分別考察了Luna C18 柱（150 mm × 2.0 mm × 3 μm，美國Phenomenex公司）、Capcell Pak MG C18柱（100 mm × 2.0 mm × 3 μm，日本資生堂公司）和Symmetry C18（250 mm × 4.6 mm × 5 μm，美國Waters公司）對三嗪類除草劑的分析性能。研究表明，Symmetry C18柱待測物保留時間過長，不適合大批量樣品的快速測試，而Capcell Pak MG C18柱雖然可以在較短時間內(nèi)全部出峰完畢，但分離效果一般，且峰形不佳。在Luna C18 柱上，所有分析物在15 min前出峰，分離效果較其它兩根色譜柱要好，且在24 min時能實現(xiàn)柱子的再平衡，因此選擇Luna C18柱進行分析。為了達到最佳的色譜分離和良好的色譜峰形，考察了以甲醇 水、乙腈 水、乙腈 水（0.1%甲酸）和乙腈 水（0.05%甲酸）為流動相時的分離情況。發(fā)現(xiàn)以乙腈 水為流動相優(yōu)于甲醇 水的分離效果流動相，且當在水中加入0.1%甲酸時能改善大部分三嗪類除草劑的峰形，說明甲酸更有利于化合物的離子化，

3.3 線性關系與檢出限

在確定的最佳分析條件下，將不同濃度的混合標準溶液進行LC MS/MS分析，以待測物濃度為橫坐標，待測物峰面積為縱坐標，不加權最小二乘法進行回歸運算，求得31中三嗪類除草劑的線性回歸方程。結果表明：31種三嗪類除草劑在各自的濃度范圍內(nèi)線性關系良好（r>0.996），可以滿足定量分析的要求。以S/N≥3確定方法的檢出限為0.008～0.440 μg/L。31種三嗪類除草劑的線性關系、線性范圍和檢出限見表3。

3.4 回收率和精密度

取空白土壤樣品，分別制得濃度為0.4， 4.0和40.0 μg/kg添加水平的加標樣品，按照2.3節(jié)方法進行樣品提取和凈化處理，外標法定量計算，每個濃度水平重復測定6次，得到添加濃度水平為0.4～40.0 μg/kg時，各化合物的平均回收率在76.9%～102.0%之間，RSD為3.4%～10.3%，方法顯示了較好的回收率與精密度，滿足農(nóng)田土壤中三嗪類除草劑殘留檢測的要求，結果見表4。

3.5 樣品分析

利用所建立的HPLC MS/MS分析方法對沈陽周邊采集的36個農(nóng)田土壤樣本進行了檢測。

4 結 論

建立了一種能對農(nóng)田土壤中31種三嗪類除草劑同時快速分析的高效液相色譜 三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜分析方法。該方法能有效地消除土壤樣本中復雜基質(zhì)的干擾，保證了分析檢測的準確性；方法的靈敏度高，可以滿足實際樣品測試的需要。利用該方法對東北地區(qū)農(nóng)田土壤檢測結果表明：農(nóng)田中存在的主要三嗪類除草劑物種為阿特拉津、西瑪津、撲草凈和脫乙基阿特拉津。

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