脈沖電磁場誘導(dǎo)干細(xì)胞成骨分化機(jī)制的研究進(jìn)展

朱振浩等

[摘要] 骨質(zhì)疏松癥（OP）是嚴(yán)重威脅老年人健康的疾病之一。由于OP患者極易發(fā)生骨折并發(fā)癥，嚴(yán)重時可致患者殘疾，甚至死亡，因此尋找預(yù)防OP的方法已成為了當(dāng)前研究的一個熱點(diǎn)。近年來，脈沖電磁場技術(shù)在臨床預(yù)防OP中起著重要的作用，其中誘導(dǎo)干細(xì)胞的成骨分化是其中最重要的機(jī)制之一。由于人們對脈沖電磁場誘導(dǎo)干細(xì)胞成骨分化機(jī)制認(rèn)識還不深，本文對近年來脈沖電磁場誘導(dǎo)成骨分化的研究進(jìn)行歸類整理，主要從脈沖電磁場誘導(dǎo)成骨分化相關(guān)基因表達(dá)、調(diào)節(jié)干細(xì)胞周圍的微環(huán)境以及促進(jìn)相關(guān)信號通路傳導(dǎo)等方面的研究進(jìn)展作一綜述。弄清脈沖電磁場促進(jìn)干細(xì)胞成骨分化的具體機(jī)制對將來OP預(yù)防具有重要的指導(dǎo)意義。

[關(guān)鍵詞] 脈沖電磁場；干細(xì)胞；成骨分化

[中圖分類號] R687.3 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-7210（2014）11（a）-0149-04

Progress of mechanism of pulsed eletromagnetic fields to induce stem cells′osteogenesis differentiation

ZHU Zhenhao1 CHEN Jiale1 CHEN Zhihao1 WU Liqing1 SUN Jia2

1.The Second Clinical Medical College of Southern Medical University， Guangdong Province， Guangzhou 510282， China； 2.Department of Endocrinology， Zhujiang Hospital of Southern Medical University， Guangdong Province， Guangzhou 510282， China

[Abstract] Osteoporosis （OP） is one of the serious diseases greatly menacing the old. OP patients are likely to suffer from fracture， even disability and death， which makes the prevention of OP as to a research hot spot. Pulsed eletromagnetic fields plays an important role in the clinical treatment of fracture and the prevention of OP recently， among which the mechanism of inducing stem cells′osteogenesis differentiation is vital. As the general understanding of how pulsed eletromagnetic fields induces stem cells′osteogenesis differentiation is not so profound， this paper organizes and classifies the yearly recent researches of this topic， focusing on the gene expression of osteogenesis differentiation， the regulation of stem cells′microenvironment and the promotion of signal pathway. To clarify how pulsed eletromagnetic fields induces stem cells′osteogenesis differentiation will be of great guiding significance for OP prevention in the future.

[Key words] Pulsed eletromagnetic fields； Stem cells； Osteogenesis differentiation

骨質(zhì)疏松癥（osteoporosis，OP）是一種以低骨量以及骨組織微結(jié)構(gòu)破壞為特征的一種疾病，多發(fā)生于絕經(jīng)后女性和老年男性，一直是嚴(yán)重威脅老年人健康的疾病之一。隨著我國老齡化社會進(jìn)程的發(fā)展，OP患者也逐年增多；據(jù)調(diào)查，目前我國的OP患者多達(dá)5000萬人以上[1-3]。OP導(dǎo)致的骨脆性增加將大大增加了患者罹患骨折的風(fēng)險，因此，OP成為老年人致殘的重要因素之一。OP所致的骨折不僅給患者帶來了巨大的軀體和精神上的創(chuàng)傷，也給社會及患者家庭帶來了沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。目前，脈沖電磁場技術(shù)在臨床上的骨折治療以及骨質(zhì)疏松預(yù)防中起著重要的作用，其中誘導(dǎo)干細(xì)胞的成骨分化是其中最重要的機(jī)制之一。近年來，越來越多的研究表明，脈沖電磁場能夠通過多種方式參與干細(xì)胞的成骨分化，包括介導(dǎo)相關(guān)基因表達(dá)、調(diào)節(jié)干細(xì)胞周圍的微環(huán)境以及促進(jìn)相關(guān)信號通路傳導(dǎo)等。弄清脈沖電磁場促進(jìn)干細(xì)胞成骨分化的具體機(jī)制不僅能夠深化人們對于脈沖電磁場治療骨質(zhì)疏松及骨折的認(rèn)識，對將來骨質(zhì)疏松預(yù)防及骨折治療也具有重要的指導(dǎo)意義。本文就脈沖電磁場誘導(dǎo)干細(xì)胞成骨分化的具體機(jī)制作一綜述。

1 脈沖電磁場通過調(diào)節(jié)相關(guān)基因表達(dá)參與干細(xì)胞的成骨分化

隨著基因檢測技術(shù)水平的不斷提高，關(guān)于脈沖電磁場誘導(dǎo)干細(xì)胞成骨分化機(jī)制研究已經(jīng)從細(xì)胞學(xué)水平深入到基因水平。近年來，越來越多的研究表明脈沖電磁場能夠通過介導(dǎo)相關(guān)基因表達(dá)參與干細(xì)胞的成骨分化。Runx2/Cbfa1是成骨的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，其表達(dá)量的高低可以作為早期成骨分化程度的重要指標(biāo)：①上調(diào)成骨分化相關(guān)基因的表達(dá)；Tsai等[4]研究發(fā)現(xiàn)，與未經(jīng)處理的干細(xì)胞相比，經(jīng)外加脈沖電磁場照射的人間充質(zhì)干細(xì)胞表達(dá)的Runx2/Cbfa1及堿性磷酸酶（ALP）量增加，后兩者表達(dá)上調(diào)將有助于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞的分化。而在Wang等[5]實驗發(fā)現(xiàn)，除了上調(diào)Runx2/Cbfa1、ALP的表達(dá)，脈沖電磁場也能夠上調(diào)干細(xì)胞骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMP）-2、骨鈣素等成骨分化基因的表達(dá)。②下調(diào)干細(xì)胞向其他方向分化相關(guān)基因的表達(dá)；脂肪酶、神經(jīng)嵴標(biāo)志物AP-2、過氧化物酶增殖物激活受體（PPARγ）2是干細(xì)胞向脂肪細(xì)胞分化所表達(dá)的重要基因，能夠加速干細(xì)胞向脂肪細(xì)胞的分化。Yang等[6]利用脈沖電磁場（150 Hz，1 mT）處理大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)，干細(xì)胞明顯向成骨細(xì)胞方向分化。進(jìn)一步通過分析細(xì)胞mRNA發(fā)現(xiàn)，其表達(dá)的Runx2、ALP、BMP2等成骨分化基因上調(diào)，而表達(dá)的脂肪酶、AP-2、PPARγ 2等向脂肪細(xì)胞分化的基因下調(diào)。因此，脈沖電磁場一方面能夠促進(jìn)成骨分化基因表達(dá)，另一方面抑制其向其他方向分化基因的表達(dá)，從而起到誘導(dǎo)干細(xì)胞成骨分化的作用。因此，通過研究尋找最適合誘導(dǎo)干細(xì)胞成骨分化相關(guān)基因表達(dá)的場強(qiáng)和頻率，對于指導(dǎo)臨床治療骨質(zhì)疏松及骨折將具有重要的指導(dǎo)意義。

2 脈沖電磁場通過調(diào)節(jié)干細(xì)胞周圍的微環(huán)境促進(jìn)其成骨分化

干細(xì)胞的增值與分化依賴于其周圍特定的微環(huán)境改變，而成骨分化微環(huán)境涉及眾多生長因子以及相關(guān)蛋白的表達(dá)滴度的變化，如BMP、轉(zhuǎn)化生長因子（TGF）、白介素-11（IL-11）、胰島素樣生長因子-1（IGF-1）等。目前，越來越多的研究表明，脈沖電磁場能夠促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞周圍微環(huán)境改變和增加其對微環(huán)境低濃度生長因子的敏感性，從而促進(jìn)其向成骨細(xì)胞方向的分化：①調(diào)節(jié)干細(xì)胞周圍的微環(huán)境。Aaron等[7]通過復(fù)習(xí)以往的文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，脈沖電磁場能夠上調(diào)干細(xì)胞內(nèi)BMP、轉(zhuǎn)化生長因子（TGF）、白介素-11（IL-11）、胰島素樣生長因子-1（IGF-1）等細(xì)胞因子及蛋白的表達(dá)；后者在通過自分泌和旁分泌等途徑被分泌到細(xì)胞外，從而改變干細(xì)胞周圍的微環(huán)境，放大成骨分化信號效應(yīng)，進(jìn)而促進(jìn)更多干細(xì)胞向成骨細(xì)胞方向的分化。②增加干細(xì)胞對于微環(huán)境低濃度的生長因子的敏感性。Schwartz等[8]根據(jù)培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞條件的不同將其分為三個組，分別是：成骨介質(zhì)組、成骨介質(zhì)+脈沖電磁場組、成骨介質(zhì)+BMP+脈沖電磁場組；結(jié)果發(fā)現(xiàn)脈沖電磁場與BMP能夠協(xié)同增加干細(xì)胞表達(dá)的ALP以及骨鈣素，且脈沖電磁場能夠增加干細(xì)胞對于外源性BMP的敏感性，從而促進(jìn)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞的分化。因此，通過調(diào)節(jié)干細(xì)胞周圍的微環(huán)境以及增加其對于周圍低濃度生長因子的敏感性可能是脈沖電磁場促進(jìn)干細(xì)胞成骨分化的重要機(jī)制。而通過外源性的增加一種或多種生長因子，結(jié)合脈沖電磁場增加干細(xì)胞對生長因子的敏感性可能是未來預(yù)防骨質(zhì)疏松和治療骨折的一種策略。

3 脈沖電磁場通過調(diào)控相關(guān)的信號通路促進(jìn)干細(xì)胞成骨分化

干細(xì)胞的成骨分化涉及了眾多的信號通路傳導(dǎo)，包括環(huán)腺苷酸激活蛋白激酶A（cAMP-PKA）信號通路、細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK）信號通路等。目前，越來越多研究表明脈沖電磁場誘導(dǎo)干細(xì)胞分化成骨機(jī)制可能是通過影響相關(guān)的成骨分化信號傳導(dǎo)實現(xiàn)。但目前關(guān)于這方面的研究還沒有定論，很多學(xué)者都對脈沖電磁場誘導(dǎo)干細(xì)胞成骨分化的機(jī)制提出了多種假說。當(dāng)前普遍接受的有以下四條信號通道假說：

3.1 脈沖電磁場通過調(diào)控cAMP-PKA信號通路促進(jìn)干細(xì)胞成骨分化

作為促進(jìn)成骨分化最重要的信號通路之一，cAMP-PKA信號通路通過增加細(xì)胞內(nèi)磷酸化cAMP水平使蛋白酶A磷酸化，進(jìn)而激活下游相關(guān)的信號通路傳導(dǎo)，從而促進(jìn)成骨所需生長因子如IL-11、IGF-1、BMP-2等的表達(dá)，最終以自分泌或旁分泌的形式促進(jìn)干細(xì)胞的增殖分化[9]。近年來研究表明：脈沖電磁場可能是通過激活cAMP-PKA信號通路，從而促進(jìn)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞方向分化[10]。任凱等[11]采用頻率為50 HZ、場強(qiáng)為2 mT的電磁場刺激間充質(zhì)干細(xì)胞，結(jié)果顯示cAMP表達(dá)水平上調(diào)、成骨細(xì)胞分化程度增高。相關(guān)研究還證實：當(dāng)用蛋白激酶A（PKA）特異性抑制劑H89作用于經(jīng)脈沖電磁場處理的間充質(zhì)干細(xì)胞后，其ALP的表達(dá)量明顯降低，細(xì)胞成骨分化程度也明顯降低[9]。這說明脈沖電磁場可能是通過調(diào)控cAMP-PKA信號通路傳導(dǎo)從而促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化。相反，通過給予PKA抑制劑則能夠抑制脈沖電磁場對cAMP-PKA信號通路傳導(dǎo)的影響，從而抑制干細(xì)胞的成骨分化。研究還顯示：在脈沖電磁場照射干細(xì)胞的早期，成骨分化的標(biāo)志物ALP表達(dá)水平提高，鈣沉淀增加；但當(dāng)場強(qiáng)增大到一定程度之后干細(xì)胞的分化程度反而降低[12]。提示脈沖電磁場促進(jìn)干細(xì)胞成骨分化與場強(qiáng)有一定的關(guān)系。因此，選擇一個合適場強(qiáng)和頻率的脈沖電磁場對于其臨床應(yīng)用具有重要意義，有待人們更加深入的探索研究。

3.2 脈沖電磁場通過調(diào)控PI3蛋白激酶-Akt-mTOR信號通路促進(jìn)干細(xì)胞成骨分化

磷脂酰肌醇3-激酶（PI3Ks）信號是指PI3K和其下游分子蛋白激酶B（PKB或Akt）所組成的信號通路，與人類腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。近年研究表明PI3蛋白激酶-Akt-mTOR信號通路也參與干細(xì)胞增殖及其成骨分化等多種功能的調(diào)節(jié)。該通路通過PI3蛋白激酶使Akt磷酸化，進(jìn)而激活下游哺乳類動物雷帕霉素（mTOR）；mTOR的激活能夠通過核糖體激酶p70S6K和真核細(xì)胞啟動因子eIF4E結(jié)合蛋白（4E-BP-1）兩條不同的下游通路，分別控制特定亞組分mRNA的翻譯，進(jìn)而影響相關(guān)蛋白質(zhì)的合成，從而參與干細(xì)胞增殖及成骨分化調(diào)控。

目前，研究表明脈沖電磁場通過影響PI3k -Akt 信號通路傳導(dǎo)從而誘導(dǎo)干細(xì)胞的成骨分化。Schwartz等[8]通過觀察間充質(zhì)干細(xì)胞整個成骨分化過程發(fā)現(xiàn)，脈沖電磁場可能通過PI3k-Akt信號通路促進(jìn)BMP-2的分泌，進(jìn)而刺激Runx2基因表達(dá)，最終加速間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞的分化。相關(guān)研究還表明：Runx2基因的表達(dá)與Akt間有正反饋調(diào)節(jié)作用[13]。因此，脈沖電磁場可能通過不斷活化的Akt放大該信號通路的作用，最終促進(jìn)干細(xì)胞成骨分化。

目前，探索下游mTOR信號相關(guān)蛋白與成骨分化之間的關(guān)系是該領(lǐng)域一大研究熱點(diǎn)。Patterson等[14]發(fā)現(xiàn)脈沖電磁場能夠促進(jìn)mTOR蛋白的活化，進(jìn)而激活下游的p70S6激酶；后者活化核糖體蛋白S6，最終刺激BMP-4的合成與分泌，同時增加ALP和骨鈣素的水平，從而加速干細(xì)胞成骨分化。而通過外源性增加PI3的阻滯劑則能夠減弱上述信號的傳導(dǎo)過程。說明mTOR信號通路可能是PI3蛋白激酶-Akt信號通路的下游通路，其在干細(xì)胞成骨分化作用研究還相對較少，具體作用機(jī)制有待人們更加深入地研究。

3.3 脈沖電磁場通過調(diào)控ERK信號通路促進(jìn)干細(xì)胞成骨分化

作為細(xì)胞內(nèi)的重要組成信號通路，ERK信號通路能夠被受體酪氨酸激酶、G蛋白偶聯(lián)受體以及某些細(xì)胞因子所激活，其中又以受體酪氨酸激酶受體最為重要。受體酪氨酸激酶是一種跨膜蛋白，分為胞外及胞內(nèi)段兩部分。生長因子與受體酪氨酸激酶胞外段結(jié)合后使受體發(fā)生二聚體化，從而增加受體的酪氨酸激酶活性，進(jìn)而使受體本身酪氨酸殘基發(fā)生磷酸化，最終使胞內(nèi)段具有酪氨酸激酶的活性。后者能夠相繼磷酸化Raf、MEK等，最終激活ERK信號通路，從而啟動級聯(lián)反應(yīng)誘導(dǎo)細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)，進(jìn)而參與細(xì)胞生長、分化的調(diào)控。近年研究表明：脈沖電磁場能夠通過激活ERK信號通路從而促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化。在Song等[15]探索正弦脈沖電磁場對大鼠間充質(zhì)干細(xì)胞增殖、分化以及礦化作用的研究中發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過正弦脈沖電磁場照射（15 Hz，1 mT）后大鼠間充質(zhì)干細(xì)胞Cbfa 1/Runx2、骨唾液蛋白（BSP）、骨橋蛋白（OPN）表達(dá)上調(diào)，提高ALP活性及細(xì)胞鈣質(zhì)的沉積，從而促進(jìn)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞的分化。進(jìn)一步實驗發(fā)現(xiàn)，通過給予ERK信號通路的拮抗劑U0126能夠減弱正弦脈沖電磁場對于大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化作用。研究還顯示，通過實時定量PCR觀察到脈沖電磁場能夠促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞內(nèi)成骨分化相關(guān)標(biāo)志蛋白的表達(dá)。同時，Western blot的結(jié)果提示ERK信號通路比未經(jīng)脈沖電磁場處理的間充質(zhì)干細(xì)胞傳導(dǎo)活性增強(qiáng)。而利用ERK信號通路阻滯劑PD98059處理后能夠降低間充質(zhì)干細(xì)胞成骨蛋白表達(dá)，從而抑制干細(xì)胞的成骨分化[16]。據(jù)此推測，通過激活ERK信號通路可能是正弦脈沖電磁場促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的重要機(jī)制之一。

3.4 脈沖電磁場通過調(diào)控Wnt信號通路促進(jìn)干細(xì)胞成骨分化

Wnt信號通路是指由Wnt蛋白為信號分子所介導(dǎo)的級聯(lián)效應(yīng)，是近年來分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)以及腫瘤研究中的一大熱點(diǎn)，參與了細(xì)胞增殖、分化、凋亡和胚胎發(fā)育等生命活動的調(diào)控。Wnt信號傳導(dǎo)通路的信號傳遞最終取決于細(xì)胞胞漿中游離β-cat的濃度，其信號傳導(dǎo)過程涉及Fz、LRP5/6、Dsh、GSK-3β等分子，將信號從細(xì)胞外傳遞至細(xì)胞內(nèi)，進(jìn)而使游離β-cat濃度升高并進(jìn)入核內(nèi)，與核內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子淋巴細(xì)胞增強(qiáng)因子/T細(xì)胞因子（lymphocyte enhancer factor/T cell factor，LEF/TCF）結(jié)合，形成β-cat—LEF/TCF轉(zhuǎn)錄復(fù)合物，從而啟動Wnt信號通路下游靶基因的表達(dá)，從而參與干細(xì)胞的成骨分化[17-18]。近年的研究表明：Wnt信號通路是脈沖電磁場促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞的機(jī)制之一。最早關(guān)于Wnt信號通路與骨形成的研究是Zhou等[19]完成的，他們通過實時定量PCR發(fā)現(xiàn)經(jīng)脈沖電磁場照射的去卵巢大鼠的Wnt3a、LRP5、β-cat和Runx2表達(dá)上調(diào)，從而證實激活Wnt通路是脈沖電磁場防治去卵巢大鼠的骨質(zhì)疏松的機(jī)制。相關(guān)的研究還證實，除了增加骨量脈沖電磁場還通過激活Wnt信號通路調(diào)節(jié)去卵巢大鼠的骨微結(jié)構(gòu)和強(qiáng)度。而骨微結(jié)構(gòu)的重塑依賴骨吸收以及骨形成，而這兩個過程涉及骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化作用[20-23]。有學(xué)者利用脈沖電磁場體外照射干細(xì)胞2個星期，通過微陣列觀察BMP、TGF-β、Wnt信號通路發(fā)現(xiàn)：脈沖電磁場可能通過激活Wnt信號通路從而促進(jìn)成骨分化基因的表達(dá)、ALP的活性以及骨小結(jié)的形成。在進(jìn)一步的實驗中，通過脈沖電磁場預(yù)處理間充質(zhì)干細(xì)胞，使其向成骨細(xì)胞分化，從而構(gòu)建三維骨支架。后者在小鼠顱蓋骨缺損的模型中能夠加速缺損顱蓋骨中的骨形成。預(yù)示這種經(jīng)脈沖電磁場預(yù)處理的骨支架在將來骨折修復(fù)中可能具有廣闊的發(fā)展前景。

4 小結(jié)與展望

雖然脈沖電磁場具有操作簡便、適用范圍廣、無創(chuàng)和并發(fā)癥少等優(yōu)點(diǎn)，并且在臨床廣泛應(yīng)用于OP的預(yù)防和康復(fù)治療[10]。但仍有很多問題亟待解決，如：脈沖電磁場干細(xì)胞成骨效應(yīng)的最適場強(qiáng)、頻率及作用時間還存在著很多爭議[24]。目前越來越多的研究表明脈沖電磁場對于干細(xì)胞成骨分化有促進(jìn)作用，人們對于脈沖電磁場促進(jìn)成骨分化機(jī)制有了一定的認(rèn)識，但其具體機(jī)制仍有待更深入的研究。進(jìn)一步闡明脈沖電磁場促進(jìn)干細(xì)胞成骨分化機(jī)制，不僅有助于人們對成骨分化機(jī)制的了解，對將來聯(lián)合骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植和脈沖電磁場技術(shù)的臨床應(yīng)用也具有重要的指導(dǎo)意義。

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（收稿日期：2014-07-18 本文編輯：衛(wèi) 軻）