固相萃取-超高效液相色譜法測(cè)定水中四環(huán)素類(lèi)抗生素

方小丹，柯建明，陳振賀，李燁

（北京市環(huán)境保護(hù)科學(xué)研究院/國(guó)家城市環(huán)境污染控制工程技術(shù)研究中心，北京 100037）

長(zhǎng)期以來(lái)，抗生素被大量地用于人類(lèi)和動(dòng)物細(xì)菌性感染疾病的治療，同時(shí)也被作為促生長(zhǎng)劑和飼料添加劑以亞治療劑量添加于動(dòng)物飼料中，在集約化畜牧業(yè)和養(yǎng)殖業(yè)中應(yīng)用廣泛[1,2]。然而，絕大部分抗生素不能完全被機(jī)體吸收利用，攝入人體和動(dòng)物體內(nèi)未被代謝的抗生素會(huì)經(jīng)不同途徑進(jìn)入環(huán)境，對(duì)水體、沉積物和土壤等環(huán)境介質(zhì)造成污染[3~5]。盡管抗生素的半衰期較短，可通過(guò)水解、光解與微生物降解等途徑被分解，但由于其使用頻率高、使用量大，導(dǎo)致其在環(huán)境中仍然表現(xiàn)出“假持久性”現(xiàn)象[6]。環(huán)境中殘留的抗生素加速了抗生素抗性菌株的產(chǎn)生與傳播[7]，對(duì)人類(lèi)健康與生態(tài)環(huán)境安全造成了極大威脅。近年來(lái)，固相萃取技術(shù)被廣泛用于水體中四環(huán)素類(lèi)抗生素的預(yù)處理過(guò)程中[8]，同時(shí)，高效液相色譜技術(shù)的發(fā)展也為四環(huán)素類(lèi)抗生素的研究提供了更先進(jìn)的檢測(cè)方法[9]。目前，環(huán)境水體中四環(huán)素類(lèi)抗生素的檢測(cè)方法主要包括高效液相色譜與紫外聯(lián)用（HPLC-UV）[10]、液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用（LC-MS）[11]、高效液相色譜與串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用（HPLC-MS/MS）[12]、及超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（UPLCMS/MS）[13]等。高效液相色譜法分析時(shí)間長(zhǎng)，溶劑消耗量大，質(zhì)譜法儀器設(shè)備昂貴。超高效液相與二極管陣列檢測(cè)器（UPLC-DAD），能夠克服高效液相色譜法的缺陷，同時(shí)儀器成本較低。本研究采用固相萃取-超高效液相色譜法測(cè)定水中的四環(huán)素類(lèi)抗生素，分析時(shí)間短，成本低，是環(huán)境水體中四環(huán)素類(lèi)抗生素測(cè)定的通用方法。

1 材料與方法

1.1 儀器

安捷倫1290 Infinity 超高效液相色譜儀，配有DAD檢測(cè)器；安捷倫Elipse Plus C18 RRHD色譜柱（1.8 μm，2.1×50 mm）；十二位固相萃取裝置(美國(guó)Supelco公司)；氮吹儀（北京帥恩科技有限責(zé)任公司）。

1.2 試劑

甲醇、乙腈（色譜純，F(xiàn)isher公司）；超純水（電阻率≥18.2 MΩ·cm)；四環(huán)素、金霉素、土霉素和強(qiáng)力霉素固體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（Dr. Ehrenstorfer GmbH）；一水合檸檬酸（分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）、乙二胺四乙酸二鈉（分析純，天津光復(fù)科技發(fā)展有限公司）。采用減重法稱(chēng)量四種四環(huán)素類(lèi)抗生素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，用甲醇（含0.1%甲酸）配制成1000 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，置于棕色瓶?jī)?nèi)保存于-20℃。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

水樣的富集：使空白水樣通過(guò)0.45 μm水系濾膜（上海安譜科學(xué)儀器有限公司），濾去雜質(zhì)，以免阻塞固相萃取小柱。準(zhǔn)確量取過(guò)濾后水樣500 mL，加入四環(huán)素類(lèi)抗生素的標(biāo)準(zhǔn)溶液，同時(shí)加入0.2 g乙二胺四乙酸二鈉，去除干擾離子。HLB小柱(6 mL/500 mg，Waters公司)預(yù)先用6 mL甲醇活化，6 mL超純水平衡，使水樣以不大于10 mL/min的速率通過(guò)HLB小柱。水樣富集完成后，以6mL超純水洗去殘留離子。減壓抽干5分鐘，以6 mL甲醇洗脫目標(biāo)物，氮吹至近干，用初始流動(dòng)相比例的溶液定容至1mL。

色譜條件：采用梯度洗脫程序（表1），A相為0.01mol/L檸檬酸溶液，B相為乙腈，C相為甲醇。流速為0.4 mL/min，柱溫28℃。DAD檢測(cè)器的吸收波長(zhǎng)為350 nm，進(jìn)樣量為10 μL。

表1 UPLC梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution program of UPLC

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

2.1 色譜條件優(yōu)化

首先，選用Agilent C18反相色譜柱，選用文獻(xiàn)報(bào)道含0.1%甲酸的水溶液和乙腈作為流動(dòng)相[14]，對(duì)四種四環(huán)素類(lèi)抗生素進(jìn)行分離，金霉素和強(qiáng)力霉素的色譜峰重疊；改變流動(dòng)相的梯度，仍不能使二者分離（圖1-a）。然后，改用檸檬酸水溶液（0.01 mol/L）和乙腈作為流動(dòng)相時(shí)，二者的分離度明顯提高。同時(shí)，初始流動(dòng)相比例對(duì)于土霉素和四環(huán)素的分離有很大影響：當(dāng)檸檬酸溶液以90%比例起始時(shí)，四種抗生素出峰時(shí)間在3min之后，土霉素出現(xiàn)肩峰，金霉素和強(qiáng)力霉素的峰有前沿趨勢(shì)；當(dāng)檸檬酸溶液以78%比例起始時(shí)，土霉素和四環(huán)素之間的分離度下降（圖1-b）；當(dāng)檸檬酸溶液以80%比例起始時(shí)，土霉素和四環(huán)素的分離度為3.30，基本達(dá)到基線(xiàn)分離，能夠滿(mǎn)足定性定量分析的要求（圖1-c）。因此，確定以80%檸檬酸溶液、10%乙腈、10%甲醇的作為流動(dòng)相的起始比例。通常高效液相色譜的分離時(shí)間約在20min左右[15]，本方法在4.5分鐘內(nèi)可以完成四種四環(huán)素類(lèi)抗生素的分離，分析時(shí)間大大縮短。

表2 UPLC方法與常見(jiàn)HPLC方法的比較Table 2 Comparison of UPLC method developed with traditional HPLC methods

表2為常用高效液相色譜法與本研究的UPLC方法之間比較。該方法分析時(shí)間短、有機(jī)溶劑消耗少，可見(jiàn)該方法具有非常高的分析效率。

2.2 工作曲線(xiàn)、方法檢出限和測(cè)定下限

根據(jù)環(huán)境水樣的含量分布選擇合適的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)線(xiàn)性范圍，分別設(shè)定50, 100, 200, 500, 1000, 2000, 5000 μg/L濃度制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，由表1可以看出，四種四環(huán)素類(lèi)抗生素的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程線(xiàn)性關(guān)系良好（r2> 0.999）。測(cè)定12份濃度為1.0 μg/L的加標(biāo)水樣，并按照公式1計(jì)算方法檢出限MDL。

k—置信因子為3；s—峰面積的標(biāo)準(zhǔn)偏差；c—樣品濃度（μg/L）； —峰面積平均值

表3 四種抗生素的工作曲線(xiàn)、方法檢出限及測(cè)定下限Table 3 Calibration curves, method detection and minimum quantitative detection limits

圖1 四種四環(huán)素類(lèi)抗生素的色譜圖Figure 1 Chromatograms of 4 tetracycline antibiotics

表4 水中四種四環(huán)素類(lèi)抗生素的回收率（n=3）Table 4 Recoveries of 4 tetracycline antibiotics in water samples (n=3)

從表3可看出四種四環(huán)素類(lèi)抗生素的方法檢出限在0.36~0.88μg/L之間，與HPLC-MS方法的方法檢出限（0.10 μg/L）相當(dāng)[4]。以公式1中k取10來(lái)計(jì)算方法的測(cè)定下限[16]，則該方法的測(cè)定下限為1.20~2.95μg/L。

2.3 不同加標(biāo)水平下四環(huán)素類(lèi)抗生素回收情況

于500 mL空白水樣中加入四種四環(huán)素抗生素的標(biāo)準(zhǔn)溶液，添加濃度分別為1.0，5.0，9.0 μg/L。加標(biāo)水樣按照1.3的方法進(jìn)行回收實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，低、中、高濃度下四種四環(huán)素抗生素的回收率分別為56.0%~86.3%、68.0%~78.5%、73.8%~80.4%（表4）。

3 結(jié)論

本研究采用固相萃取方法對(duì)環(huán)境水樣進(jìn)行富集和凈化，結(jié)合超高效液相方法對(duì)水樣中四種四環(huán)素抗生素進(jìn)行分析，建立了固相萃取-超高效液相色譜法測(cè)定水中四環(huán)素類(lèi)抗生素的基本方法。四種抗生素的線(xiàn)性關(guān)系良好（r2> 0.999），能夠滿(mǎn)足水體中抗生素測(cè)定的基本要求。低中高三個(gè)濃度加標(biāo)回收率分別為56.0%-86.3%，6 8.0%-7 8.5%，7 3.8%-80.4%。土霉素、四環(huán)素、金霉素和強(qiáng)力霉素的檢出限分別為0.71，0.36，0.47，0.88 μg/L，與HPLC-MS方法相當(dāng)。該方法重現(xiàn)性較好，操作簡(jiǎn)單，分析時(shí)間短，可用于高通量水體樣品中四環(huán)素類(lèi)抗生素的測(cè)定。

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