豇豆分子遺傳學(xué)研究進(jìn)展

潘磊 ，李依 ，余曉露 ，李佳楠 ，陳禪友

（1.江漢大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，武漢，430056；2.湖北省豆類(lèi)（蔬菜）植物工程技術(shù)研究中心）

豇豆[Vigna unguiculata（L.） Walp.]屬于豆科蝶形花亞科豇豆屬，為一年生草本植物，耐高溫干旱。豇豆是一種重要的豆類(lèi)作物，在世界范圍內(nèi)種植廣泛，主要種植區(qū)域位于熱帶和亞熱帶的35°N和30°S之間，包括亞洲、大洋洲、中東、歐洲南部、非洲、美國(guó)南部和中南美洲（圖1）。主產(chǎn)國(guó)為尼日利亞、尼日爾、埃塞俄比亞、突尼斯、中國(guó)、印度、菲律賓等。中國(guó)的豇豆種植面積常年維持在33萬(wàn)hm2以上，主要產(chǎn)區(qū)為河北、河南、江蘇、浙江、安徽、四川、重慶、湖北、湖南、廣西等?。ㄗ灾螀^(qū)）。

豇豆屬有3個(gè)栽培亞種，分別是：短豇豆（V.unguiculatassp.cylindrica）、 普 通 豇 豆 （V.unguiculatassp.unguiculata）和長(zhǎng)豇豆（V.unguiculatassp.sesquipedalis）。普通豇豆主要分布在非洲的撒哈拉地區(qū)；長(zhǎng)豇豆主要分布在中國(guó)和印度，而且中國(guó)是長(zhǎng)豇豆的次生起源中心和多樣性中心。豇豆可供食用的部位為嫩莢和種子，亞洲地區(qū)主要栽培以食用嫩莢為主的長(zhǎng)豇豆，而非洲地區(qū)主要栽培以食用種子為主的普通豇豆。根據(jù)聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織（Food and Agriculture Organization，F(xiàn)AO）的統(tǒng)計(jì)，全世界的豇豆種植面積一千多萬(wàn)公頃，種子常年產(chǎn)量約 600 萬(wàn) t（http://faostat3.fao.org/faostat-gateway/go/to/download/Q/QC/E）。由于豇豆富含多種人體所需的植物性蛋白質(zhì)以及膳食纖維，在人們的日常飲食和營(yíng)養(yǎng)保健中發(fā)揮了重要作用。豇豆除可供鮮食外，還可以進(jìn)行干制、腌制等產(chǎn)后加工，國(guó)內(nèi)外市場(chǎng)需求旺盛。

與水稻、小麥、大豆等作物相比，豇豆的分子遺傳學(xué)理論與應(yīng)用基礎(chǔ)研究比較滯后，被稱(chēng)為“孤兒作物”?？上驳氖?，隨著現(xiàn)代生物學(xué)理論與技術(shù)的不斷發(fā)展進(jìn)步，近年來(lái)豇豆DNA分子水平上的研究愈來(lái)愈成為學(xué)者們關(guān)注的焦點(diǎn)和熱點(diǎn)。下面本文分述豇豆分子遺傳相關(guān)的研究進(jìn)展。

圖1 世界豇豆種植分布主要區(qū)域

1 豇豆的基因庫(kù)資源

1.1 豇豆種質(zhì)資源概況

豇豆是二倍體植物（2n=2x=22），基因組大小約為587 Mb[1]；其栽培亞種之一長(zhǎng)豇豆（V.unguiculatassp.sesquipedalis）的核型為 10m+1sm[2]。

當(dāng)前，在世界范圍內(nèi)的豇豆種質(zhì)資源的搜集和保存等研究方面已經(jīng)卓有成效（表1）。位于尼日利亞的國(guó)際熱帶農(nóng)業(yè)研究所（International Institute for Tropical Agriculture，IITA；http://old.iita.org）建立了世界上最大的豇豆種質(zhì)資源庫(kù)，搜集保存了來(lái)自89個(gè)國(guó)家和地區(qū)的1 507份野生豇豆和15 003份豇豆栽培種，其中對(duì)逾12 000份進(jìn)行了28個(gè)農(nóng)藝性狀的評(píng)價(jià)，并構(gòu)建了核型種質(zhì)資源庫(kù)，共篩選出1 701份地方品種、225份改良的栽培種（包括品種、品系或株系）和130份代表性種質(zhì)材料[3]。美國(guó)農(nóng)業(yè)部（United States Department of Agriculture，USDA；http://www.ars-grin.gov）保存了世界各地搜集的6 845份豇豆種質(zhì)資源。位于我國(guó)臺(tái)灣省的亞洲蔬菜研究開(kāi)發(fā)中心（The Asian Vegetable Research and Development Center，AVRDC；http://avrdc.org/）保存了1 572份豇豆資源；中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院（Academy of Agricultural Sciences，CAAS）國(guó)家農(nóng)作物種質(zhì)資源保存中心（http://icgr.caas.net.cn/）保存有1 202份不同類(lèi)型的豇豆種質(zhì)材料。

1.2 豇豆及其相關(guān)的基因組數(shù)據(jù)庫(kù)資源

已建立了豇豆分子生物學(xué)方面的專(zhuān)業(yè)數(shù)據(jù)庫(kù)資源，且豆科中其他種屬的植物基因組學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)資源也可借鑒與利用（表2）。當(dāng)前，豇豆的數(shù)據(jù)庫(kù)主要有4個(gè)，包括NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)（http://archive-dtd.ncbi.nlm.nih.gov/），豇豆 EST 數(shù)據(jù)庫(kù) HarvEST（http://www.harvest-web.org/）、豇豆甲基化位點(diǎn)相關(guān)的數(shù)據(jù)庫(kù)CGKB（http://cowpeagenomics.med.virginia.edu/CGKB）和豇豆物理圖譜數(shù)據(jù)庫(kù)Physical Map of Cowpea（http://phymap.ucdavis.edu/cowpea/）。此外，豆科模式植物大豆 （Glycine max）、蒺藜苜 蓿（Medicago truncatula）等建立的基因組學(xué)相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)資源，亦可作為豇豆基因組學(xué)研究的重要參考。

表1 世界范圍內(nèi)豇豆種質(zhì)資源庫(kù)概況

2 豇豆的DNA分子標(biāo)記研究

2.1 豇豆DNA分子標(biāo)記的發(fā)掘

當(dāng)前，DNA分子標(biāo)記已經(jīng)廣泛應(yīng)用于植物種質(zhì)資源和作物遺傳育種研究。DNA分子標(biāo)記是遺傳標(biāo)記的一種，是基因組上存在核酸變異的特異性DNA序列，能夠反映個(gè)體或種群之間基因組中存在的某些差異。與形態(tài)標(biāo)記、細(xì)胞標(biāo)記和生化標(biāo)記相比較而言，DNA分子標(biāo)記存在諸多優(yōu)點(diǎn)：①具有較高的遺傳多態(tài)性；②直接以DNA的形式呈現(xiàn)，不受環(huán)境條件、發(fā)育時(shí)期的影響，也沒(méi)組織器官特異性；③分布于整個(gè)基因組，而且數(shù)量多；④許多分子標(biāo)記表現(xiàn)為共顯性，能夠區(qū)分基因型中的雜合子；⑤一般表現(xiàn)為選擇中性；⑥經(jīng)濟(jì)方便而且易于檢測(cè)分析。

在豇豆的分子標(biāo)記研究中，大多采用基于PCR（Polymerase chain reaction，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）的DNA分子標(biāo)記。利用顯性分子標(biāo)記，如RAPD、ISSR等，已經(jīng)篩選獲得一批重復(fù)性好、穩(wěn)定可靠的分子標(biāo)記引物[4，5]。近年來(lái)，SSR和SNP等共顯性分子標(biāo)記的應(yīng)用備受青睞。Muchero等[6]2009年首次報(bào)道了基于EST序列的1 375個(gè)SNP位點(diǎn)。Li等[7]2001年率先開(kāi)發(fā)出27個(gè)SSR標(biāo)記應(yīng)用于豇豆研究。Gupta等[8]2010年從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)（http://archive-dtd.ncbi.nlm.nih.gov/）的豇豆unigenes序列中設(shè)計(jì)篩選出102個(gè)SSR標(biāo)記。類(lèi)似的研究中，Xu等[9]2010年則從豇豆基因組數(shù)據(jù)庫(kù)HarvEST（http://www.harvest-web.org/）和 CGKB（http://cowpeagenomics.med.virginia.edu/CGKB）中發(fā)掘出172個(gè)多態(tài)性豇豆SSR分子標(biāo)記（45個(gè)EST-SSR標(biāo)記和127個(gè)gSSR標(biāo)記）。

表2 豇豆及豆科植物基因組數(shù)據(jù)庫(kù)資源

2.2 豇豆種質(zhì)資源的DNA分子標(biāo)記應(yīng)用研究

探究豇豆種質(zhì)資源DNA水平的遺傳變異，特別是對(duì)野生資源和栽培種遺傳多樣性現(xiàn)狀與親緣關(guān)系的研究，是開(kāi)展豇豆分子遺傳改良及其應(yīng)用研究的基礎(chǔ)。因此，世界豇豆分布區(qū)的國(guó)家和地區(qū)對(duì)豇豆種質(zhì)資源開(kāi)展了不同分子標(biāo)記方面的研究。

①豇豆野生資源的分子標(biāo)記研究 一般認(rèn)為豇豆起源于非洲，因?yàn)橐吧乖诜侵薜貐^(qū)分布廣泛，但是，豇豆在非洲的起源地點(diǎn)具體位于何處尚不清楚，學(xué)者們采用不同DNA分子標(biāo)記進(jìn)行了研究，認(rèn)為非洲東部地區(qū)是野生豇豆起源地，而非洲南部地區(qū)可能是野生豇豆的多樣性中心。Coulibaly等[10]2002年采用AFLP分子標(biāo)記分析了117份豇豆材料，發(fā)現(xiàn)非洲地區(qū)野生豇豆比栽培豇豆的多樣性水平高，推測(cè)非洲東部地區(qū)可能是野生豇豆的起源地。與此類(lèi)似的研究中，Ba等[11]2004年通過(guò)對(duì)來(lái)自非洲東部、西部和南部地區(qū)的栽培豇豆和野生豇豆進(jìn)行RAPD分子標(biāo)記分析，也推測(cè)非洲東部可能是野生豇豆的起源地。Ogunkanmi等[12]2008年基于SSR分子標(biāo)記分析非洲野生豇豆的遺傳多樣性，揭示出非洲南部地區(qū)野生豇豆的PIC（Polymorphic information content，多態(tài)信息含量）較高，推測(cè)非洲南部地區(qū)可能是野生豇豆的多樣性中心。

②豇豆品種資源的分子標(biāo)記研究 在豇豆品種資源的研究上，采用DNA分子標(biāo)記技術(shù)探究了中國(guó)、泰國(guó)等國(guó)家的豇豆品種間的遺傳多樣性水平和遺傳關(guān)系。徐雁鴻等[13]2007年對(duì)來(lái)自中國(guó)等亞洲國(guó)家和部分非洲地區(qū)的316份豇豆品種進(jìn)行SSR分子標(biāo)記分析，發(fā)現(xiàn)中國(guó)豇豆品種比外來(lái)品種的遺傳多樣性水平低，在中國(guó)的豇豆品種遺傳分布不均，廣西和湖北等省份的豇豆具有較高遺傳多樣性，而安徽、吉林、黑龍江和山西等省的則較低；而且基于RAPD分子標(biāo)記的分析結(jié)果表明，我國(guó)不同豇豆品種之間遺傳差異較大[4]。在泰國(guó)長(zhǎng)豇豆遺傳關(guān)系的研究中，通過(guò)綜合農(nóng)藝表型、SSR和ISSR分子標(biāo)記等進(jìn)行聚類(lèi)分析，能夠有效區(qū)分不同的豇豆材料[14]。

在豇豆地方品種的DNA分子標(biāo)記研究中，非洲和亞洲地區(qū)的地方品種比較受關(guān)注，并且在DNA分子標(biāo)記種類(lèi)的選擇上進(jìn)行了比較分析。Tosti等[15]2002年發(fā)現(xiàn)在豇豆地方品種檢測(cè)效率方面，AFLP比RAPD技術(shù)揭示的多樣性指數(shù)更高，尤其是在分析遺傳背景較狹窄的材料中，AFLP技術(shù)更加有效。在AFLP分子標(biāo)記研究方面，劉永華等[16]于2007年構(gòu)建了一套優(yōu)化的豇豆AFLP分析技術(shù)體系。Fang等[17]2007年采用6個(gè)AFLP分子標(biāo)記引物組合分析了來(lái)自非洲、亞洲和南美地區(qū)的27個(gè)豇豆地方品種，揭示出這些材料具有較高的遺傳相似性，亞洲和美洲的豇豆可能有共同的起源，而與來(lái)自西非的材料不同。此外，在豇豆地方品種的RAPD分子標(biāo)記研究中，研究者發(fā)現(xiàn)馬拉維豇豆地方品種的RAPD標(biāo)記聚類(lèi)結(jié)果與其形態(tài)特征之間并不一致[18]；而基于RAPD分子標(biāo)記揭示出貝寧地區(qū)豇豆之間存在較大的遺傳差異[19]。豇豆地方品種的SSR分子標(biāo)記研究中，Badiane等[20]2012年利用44個(gè)EST-SSR分子標(biāo)記將塞內(nèi)加爾的22個(gè)豇豆地方品種聚類(lèi)到一起。Lee等[21]2009年則采用6個(gè)SSR分子標(biāo)記分析了492份韓國(guó)豇豆地方品種，揭示出較高的遺傳多樣性水平。

③豇豆種質(zhì)材料的分子標(biāo)記研究 除了豇豆野生種、品種、地方品種外，對(duì)不同國(guó)家地區(qū)的不同豇豆種質(zhì)材料也開(kāi)展了DNA分子標(biāo)記的研究。Malviya等[22]2012年采用18個(gè)RAPD標(biāo)記將10份印度豇豆材料分為2個(gè)類(lèi)群；類(lèi)似的研究中，Gajera等[23]2014年發(fā)現(xiàn)，基于RAPD和ISSR這兩種分子標(biāo)記能較好地將豇豆品種材料與優(yōu)良基因型材料進(jìn)行聚類(lèi)區(qū)分。Gillaspie等[24]2005年的研究表明，采用3個(gè)AFLP引物組合和10對(duì)SSR引物能有效鑒定出豇豆亞種之間遺傳關(guān)系較近的材料和雜合個(gè)體。Asare等[25]2010年采用SSR分子標(biāo)記評(píng)估了來(lái)自加納國(guó)內(nèi)9個(gè)地區(qū)的141份豇豆材料，可以聚類(lèi)為5個(gè)類(lèi)群，每個(gè)類(lèi)群與其地理來(lái)源存在一定的相關(guān)性。Sawadogo等[26]2010年通過(guò)SSR分子標(biāo)記篩選出豇豆對(duì)寄生雜草（Striga gesnerioides）的抗性材料和敏感型材料。此外，魯忠富等[27]2010年從研究長(zhǎng)豇豆的SSR引物中篩選出10對(duì)診斷性引物，建立了基于SSR分子標(biāo)記技術(shù)的長(zhǎng)豇豆種子純度快速鑒定方法。

近年來(lái)，以測(cè)序?yàn)榛A(chǔ)的SNP分子標(biāo)記也逐漸應(yīng)用于豇豆研究中。Xu等[28]2012年采用1 127個(gè)基于EST序列的SNP標(biāo)記，分析了包含有長(zhǎng)豇豆和普通豇豆的99份核心材料，結(jié)果表明，多態(tài)性SNP的比例相對(duì)較低（39%），平均每個(gè)位點(diǎn)1.33個(gè)SNP，Bayesian群體結(jié)構(gòu)分析揭示出2個(gè)亞群，大體上分別與SV亞群（Standard vegetable type）和NSV亞群（Non-standard vegetable type）一致；LD（r2）較高，且LD在亞群SV中比在亞群NSV中持續(xù)得更長(zhǎng)，而LD衰減在2個(gè)亞群中均較快，LD衰減在不同染色體中存在差別，最長(zhǎng)的是最短的約5倍。該研究首次進(jìn)行了豇豆群體遺傳結(jié)構(gòu)分析，并證明了基于豇豆SNP的全基因組關(guān)聯(lián)分析可以對(duì)復(fù)雜性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)作圖。

綜上所述，不同類(lèi)型DNA分子標(biāo)記已經(jīng)在豇豆種質(zhì)資源研究中成功應(yīng)用（表3），而且以基于PCR技術(shù)的DNA分子標(biāo)記居多，近年來(lái)基于測(cè)序的SNP分子標(biāo)記也越來(lái)越受到青睞。在基于DNA分子標(biāo)記的研究中，認(rèn)為非洲東部地區(qū)是野生豇豆起源地，而非洲南部地區(qū)可能是野生豇豆的多樣性中心，為豇豆的起源和遺傳多樣性中心問(wèn)題提供了分子依據(jù)。DNA分子標(biāo)記能有效揭示豇豆品種、地方品種等現(xiàn)存豇豆種質(zhì)資源中蘊(yùn)含較為豐富的遺傳變異，而且不同地區(qū)豇豆種質(zhì)資源的遺傳多樣性水平不均一，存在地區(qū)差異，通過(guò)聚類(lèi)可以揭示豇豆個(gè)體之間的遺傳關(guān)系，通常情況下，基于分子標(biāo)記的聚類(lèi)與性狀特征之間沒(méi)有一致性，Schut等[29]認(rèn)為其原因可能是所觀測(cè)的性狀、性狀的遺傳變異、性狀相關(guān)的基因數(shù)量等偏少，也可能是基因的上位相互作用。

表3 豇豆研究中采用的幾種主要分子標(biāo)記

表4 成功構(gòu)建的豇豆遺傳連鎖圖譜

2.3 豇豆分子遺傳圖譜研究進(jìn)展

豇豆中分子遺傳圖譜方面的研究雖然起步較晚，但是近年來(lái)發(fā)展迅速，已經(jīng)成功構(gòu)建了多個(gè)高密度連鎖遺傳圖（表4），為豇豆的分子遺傳學(xué)研究奠定了良好的基礎(chǔ)。

Ouédraogo等[30]2002年采用133個(gè) RAPD、36個(gè)RFLP和267個(gè)AFLP標(biāo)記，利用F2群體，構(gòu)建了包含11個(gè)連鎖群的豇豆遺傳圖譜，總長(zhǎng)2 670.0 cM。2009年，豇豆中第一張高密度SNP連鎖遺傳圖譜成功構(gòu)建[6]，此遺傳圖譜將928個(gè)SNP標(biāo)記整合到11個(gè)連鎖群上，覆蓋了680.0 cM，平均0.73 cM 1個(gè)SNP標(biāo)記；同時(shí)，在與豆科模式植物的大豆和蒺藜苜蓿進(jìn)行基因組同線(xiàn)性分析時(shí)發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)豇豆與大豆和蒺藜苜蓿在連鎖遺傳圖上的共線(xiàn)性比率分別為85%和82%。在國(guó)內(nèi)的研究中，Xu等[31]2011年利用長(zhǎng)豇豆雜交組合（ZN016×ZJ282），構(gòu)建了 1個(gè)覆蓋11個(gè)連鎖群的375個(gè)標(biāo)記位點(diǎn)（其中有191個(gè)SNP標(biāo)記和184個(gè)SSR標(biāo)記），覆蓋基因組745.0 cM，每個(gè)標(biāo)記平均為1.98 cM。Lucas等[32]2011年采用基于EST序列的SNP，對(duì)13個(gè)群體的1 293個(gè)個(gè)體用Illumina 1536 GoldenGate Assay分析時(shí)，構(gòu)建了基于 1 107個(gè) SNP的 11個(gè)連鎖群（680.0 cM），并將其與大豆基因組進(jìn)行了共線(xiàn)性比較分析，揭示兩者基因組上存在較高的同源性。Kongjaimun等[33]2012年從豇豆屬的紅豆（V.angularis）和綠豆（V.radiata）基因組中開(kāi)發(fā)SSR標(biāo)記，利用長(zhǎng)豇豆JP81610和野豇豆（V.unguiculatasubsp.unguiculatavar.spontanea）種質(zhì)TVnu457的雜交后代，構(gòu)建了包含226個(gè)SSR標(biāo)記在11個(gè)連鎖群上覆蓋852.4 cM的連鎖圖譜，每個(gè)標(biāo)記間平均3.96 cM。

3 豇豆中功能基因的發(fā)掘與鑒定研究

功能基因的發(fā)掘與鑒定是進(jìn)行分子遺傳改良的前提和基礎(chǔ)。與水稻、玉米、小麥和棉花等農(nóng)作物相比較而言，豇豆功能基因的發(fā)掘與鑒定研究十分薄弱，包括與高溫干旱等非生物逆境抗性相關(guān)的基因，與抗炭腐?。ㄇo枯病）、根腐病、枯萎病等生物逆境相關(guān)的基因，以及與葉片、豆莢、花期等生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)的基因的研究。

3.1 豇豆轉(zhuǎn)基因研究

由于當(dāng)前豇豆轉(zhuǎn)基因體系尚不成熟，對(duì)于細(xì)菌轉(zhuǎn)化體系、電轉(zhuǎn)化體系和基因槍等不同轉(zhuǎn)基因手段的選擇，目標(biāo)組織的遴選等轉(zhuǎn)基因技術(shù)體系中的關(guān)鍵問(wèn)題仍需不斷深入研究（表5）。近些年，豇豆中已經(jīng)開(kāi)展nptII基因、CPMV基因、gus基因、hpt基因、αAI-1基因、Cry1Ab基因和Atahas基因等轉(zhuǎn)基因研究[34～50]；最近還報(bào)道了一種利用6-磷酸甘露糖異構(gòu)酶基因作選擇標(biāo)記篩選轉(zhuǎn)基因豇豆的方法[51]。

3.2 耐旱、耐熱相關(guān)基因研究

在耐旱相關(guān)基因的研究中，F(xiàn)ranca等[52]2008年通過(guò)克隆表達(dá)豇豆耐旱相關(guān)基因PAP（Phosphatidic acid phosphatase，磷脂酸磷酸酶）的2個(gè)cDNA（Vu-PAP alpha和 VuPAP beta），對(duì) VuPAP alpha啟動(dòng)子的生物信息學(xué)分析，鑒定出了一些與干旱相關(guān)的調(diào)節(jié)元件。另外，采用深度測(cè)序分析豇豆干旱脅迫下表達(dá)的miRNA，鑒定出44個(gè)與干旱相關(guān)的miRNA，其中30個(gè)在干旱中是上調(diào)作用，14個(gè)為下調(diào)作用[53]。Mondal等[54]2014年克隆了豇豆中的β碳酸酐酶基因VuCA1，該基因的表達(dá)具有明顯的組織差異性，在花蕾、莖稈和根部表達(dá)較弱，而在葉片中表達(dá)較強(qiáng)，且在葉片中的基因表達(dá)水平因干旱和鹽脅迫而上升。

表5 豇豆中轉(zhuǎn)基因研究發(fā)展概況

在對(duì)豇豆耐旱性相關(guān)基因的QTL定位中，發(fā)掘了一些相關(guān)的QTL位點(diǎn)。采用AFLP分子標(biāo)記，對(duì)豇豆耐旱型與敏感型的重組自交系群體進(jìn)行QTL分析，揭示出與苗期干旱耐性和成熟性相關(guān)的12個(gè)QTL[55]；進(jìn)一步的研究中，發(fā)現(xiàn)了7個(gè)AFLP標(biāo)記位于干旱或非生物脅迫誘導(dǎo)相關(guān)的同源區(qū)EST[56]。Lucas等[57]基于SNP分子標(biāo)記，發(fā)掘出與豇豆耐熱相關(guān)的5個(gè)QTL位點(diǎn)Cht-1～Cht-5（表6）。

表6 豇豆中QTL作圖研究

3.3 豇豆抗蟲(chóng)、抗病相關(guān)基因的研究

在豇豆抗蟲(chóng)相關(guān)基因的研究方面，豇豆胰蛋白酶抑制劑（Cowpea trypsin inhibitor，CpTI）基因具有抗蟲(chóng)譜廣而且昆蟲(chóng)不易對(duì)其產(chǎn)生耐受性等特點(diǎn)，Hilder等[58]1987年首先獲得轉(zhuǎn)cpti基因的抗蟲(chóng)煙草植株；目前，已經(jīng)應(yīng)用在水稻、棉花、紅薯、油棕等多種作物中[59～64]。

Muchero等[65]2011年在豇豆中將抗炭腐病相關(guān)的9個(gè) QTL（Mac-1～Mac-9）位點(diǎn)，定位到 5個(gè)連鎖群 LG2、LG3、LG5、LG6、LG11 上。Pottorff等[66]2012年發(fā)現(xiàn)位于連鎖群LG6上的1個(gè)QTL位點(diǎn)Fot3-1與抗鐮刀菌根腐病相關(guān)。Pottorff等[67]2014年分析出豇豆中與抗鐮刀霉菌枯萎病相關(guān)的2個(gè)QTL位點(diǎn)，F(xiàn)ot4-1和Fot4-2，分別定位到豇豆通用連鎖遺傳圖的 LG5和 LG3上（表6）。

3.4 豇豆發(fā)育相關(guān)基因的研究

豇豆發(fā)育相關(guān)的功能基因研究鮮見(jiàn)報(bào)道，主要涉及戟形葉片、莢長(zhǎng)、花期、結(jié)莢、豆莢柔嫩度和可溶性固形物總量、始花時(shí)間、盛花時(shí)間、種皮顏色等相關(guān)基因的QTL研究。

Pandey等[68]2004年研究發(fā)現(xiàn)，豇豆中退化的托葉（Rudimentary stipules，RS）由顯性基因控制，隱性基因控制著葉狀葉托（FS）表型。Pottorff等[69]2012年采用SNP標(biāo)記，將1個(gè)與豇豆戟狀葉片相關(guān)的QTL位點(diǎn)（即Hls基因位點(diǎn)），定位于豇豆第4號(hào)連鎖群上，而且發(fā)現(xiàn)1個(gè)與Hls基因區(qū)域共分離的連鎖標(biāo)記SNP 1_0349，序列比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，Hls候選基因與擬南芥 EZA1/SWINGER（AT4G02020.1）基因同源性高（表6）。

此外，現(xiàn)有的研究表明，籽粒大小、豆莢大小、莖稈大小和葉片大小等馴化相關(guān)基因的QTL主要位于連鎖群LG7[70]。莢長(zhǎng)相關(guān)的7個(gè)QTL[33]，始花期相關(guān)的1個(gè)QTL位點(diǎn)Qfld.zaas-11，始花節(jié)位相關(guān)的1個(gè)QTL位點(diǎn)Qnff.zaas-11，單株結(jié)莢數(shù)相關(guān)的1個(gè)QTL位點(diǎn)Qpn.zaas-3，葉片衰老相關(guān)的一個(gè)QTL位點(diǎn)Qls.zaas-11[71]，豆莢柔嫩度相關(guān)的3個(gè)QTL位點(diǎn)Psn7.1，Psn8.1，Psn11.1，可溶性固形物總量相關(guān)的2個(gè)QTL位點(diǎn)Psw1.1和Psw3.1[72]，始花時(shí)間相關(guān) 的 5 個(gè) QTL 位 點(diǎn)qfot1.1、qfot1.2、qfot1.3、qfot2、qfot10，盛花時(shí)間相關(guān)的3個(gè)QTL位點(diǎn)qdtf1、qdtf2、qdtf7[73]；豇豆種皮褐變相關(guān)的3個(gè)QTL位點(diǎn)Hbs-1、Hbs-2和Hbs-3[74]（表6），上述研究報(bào)道的 QTL位點(diǎn)中，部分位點(diǎn)已經(jīng)整合到豇豆通用遺傳圖譜[7]，包括Hls基因位點(diǎn)，F(xiàn)ot3-1基因位點(diǎn)，Mac-1～Mac-9基因位點(diǎn)，F(xiàn)ot4-1～Fot4-2基因位點(diǎn)，Hbs-1～Hbs-3（圖2）。

4 豇豆的分子進(jìn)化研究

在豇豆的起源、進(jìn)化與分類(lèi)等的研究中，已經(jīng)獲得一些分子生物學(xué)證據(jù)，較多開(kāi)展了基于ITS（Internal transcribed spacer，內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)）、IGS（Intergenic spacer，基因間隔區(qū)）等序列變異的系統(tǒng)發(fā)生學(xué)研究，不論是在豇豆屬的層次，或是在種屬之內(nèi)，ITS和IGS序列長(zhǎng)度都存在較大遺傳變異，多態(tài)性位點(diǎn)較多，能有效用于豇豆分子鑒定和遺傳系譜分析。

在豇豆屬的分類(lèi)水平上，Goel等[75]測(cè)序比較了豇豆屬29個(gè)物種和菜豆屬9個(gè)物種的rDNA基因中ITS序列（18S-26S rDNA重復(fù)區(qū)），發(fā)現(xiàn)在豇豆屬和菜豆屬中的ITS序列存在差別，ITS1在豇豆屬中的長(zhǎng)度在 187～243 bp，而在菜豆屬中為217～290 bp；ITS2在豇豆屬中的長(zhǎng)度變化為187～219 bp，而在菜豆屬中為225～243 bp；進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，ITS譜系圖與基于形態(tài)學(xué)、生物化學(xué)、細(xì)胞學(xué)和孢粉學(xué)的分類(lèi)基本一致，而且這些ITS序列可以用于區(qū)分V.mungo、V.radiata、V.umbellata和V.unguiculata的野生種。

在探究豇豆亞屬各物種間的系統(tǒng)發(fā)生學(xué)關(guān)系的研究中，Vijaykumar等[76]2010年基于rRNA基因的ITS區(qū)域，發(fā)現(xiàn)356個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)中的80%為簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)，通過(guò)鄰接法（Neighbor joining）和最大簡(jiǎn)約法（Maximum parsimony）進(jìn)行遺傳發(fā)育系統(tǒng)關(guān)系重構(gòu)，可以將豇豆亞屬的57個(gè)豇豆材料（屬于15個(gè)種）聚類(lèi)到5個(gè)主要分支。之后，Vijaykumar等[77]于2011年又分析了豇豆亞屬不同種的豇豆rDNA基因間隔區(qū)（IGS）序列，結(jié)果表明，5S IGS在長(zhǎng)度（189～237 bp）和序列（58%多態(tài)性位點(diǎn)）上存在極大變異，而且大多數(shù)的豇豆種都有一種單一類(lèi)型的5S rRNA重復(fù)單元，但是V.unguiculata和V.reticulata之間是例外，因?yàn)樗鼈冎g表現(xiàn)出多種5S rRNA類(lèi)型。此外，Doi等[78]研究了豇豆亞屬Ceratotropis的系統(tǒng)發(fā)生學(xué)關(guān)系，比較了rDNA ITS與葉綠體DNA的atpB-rbcL基因間隔區(qū)，2種序列都約 700 bp，rDNA-ITS比atpB-rbcL的多態(tài)性位點(diǎn)多，是atpB-rbcL簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)（Parsimony-informative sites）的5倍，atpB-rbcL間隔區(qū)更適于對(duì)豇豆屬在物種水平上進(jìn)行分析；基于rDNA-ITS聚類(lèi)的3個(gè)類(lèi)群，基本與豇豆亞屬Aconitifoliae、Angulares和Ceratotropis相對(duì)應(yīng)。

5 結(jié)語(yǔ)

圖2 部分性狀在豇豆通用遺傳圖譜上的QTL定位

當(dāng)前，被稱(chēng)為“孤兒作物”的豇豆其分子遺傳學(xué)研究發(fā)展迅速，極大地促進(jìn)了豇豆的理論與應(yīng)用基礎(chǔ)研究。在全球范圍內(nèi)已經(jīng)建立了類(lèi)型豐富的豇豆種質(zhì)資源庫(kù)，總份數(shù)超過(guò)2.5萬(wàn)份，而且豇豆及一些豆科模式植物中已建立了專(zhuān)業(yè)數(shù)據(jù)庫(kù)資源，為豇豆的基礎(chǔ)理論與應(yīng)用研究奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)；通過(guò)DNA分子標(biāo)記技術(shù)的應(yīng)用，世界豇豆資源的遺傳多樣性總體水平較高，但是存在地域性差異；在豇豆分子連鎖遺傳圖譜研究方面，以往多采用AFLP和SSR分子標(biāo)記，近年來(lái)基于測(cè)序的SNP分子標(biāo)記越來(lái)越受青睞，雖然標(biāo)記數(shù)量較少，不足2 000個(gè)分子標(biāo)記[67]，圖譜標(biāo)記密度不高，但是有效地加深了對(duì)目標(biāo)性狀的基因定位研究；當(dāng)前，豇豆中僅開(kāi)展了少數(shù)目的基因的轉(zhuǎn)基因研究（nptII、CPMV、gus、hpt、αAI-1、Cry1Ab和Atahas等基因），獲得了轉(zhuǎn)基因的愈傷組織或者單株，但是豇豆的轉(zhuǎn)基因體系仍不完善，尚未廣泛應(yīng)用，需要構(gòu)建高效穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因體系；此外，豇豆的分子進(jìn)化研究為傳統(tǒng)的起源、進(jìn)化與分類(lèi)等提供了分子水平的佐證。

盡管在豇豆的分子遺傳學(xué)研究方面取得了上述進(jìn)展，加深了豇豆的分子基礎(chǔ)理論與應(yīng)用研究，但是仍然有許多問(wèn)題值得我們持續(xù)關(guān)注，尤其是在現(xiàn)代生物技術(shù)大發(fā)展的背景下，豇豆分子水平的研究面臨新的機(jī)遇與挑戰(zhàn)：①雖然已在世界范圍內(nèi)開(kāi)展豇豆種質(zhì)資源的交流與合作研究，實(shí)現(xiàn)了豇豆資源的合理有效利用，進(jìn)行了豇豆種質(zhì)創(chuàng)新和遺傳改良，但是由于我國(guó)豇豆種質(zhì)資源的收集、鑒定和評(píng)價(jià)等研究發(fā)展緩慢，在國(guó)家種質(zhì)資源庫(kù)中的豇豆數(shù)量偏少，亟待充實(shí)更新，且需要建立健全豇豆公共數(shù)據(jù)庫(kù)；②豇豆DNA分子標(biāo)記需要大量的開(kāi)發(fā)及應(yīng)用，尤其是高密度分子遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建，與生物逆境（蟲(chóng)害、病害等）、非生物逆境（高溫、干旱、鹽堿、濕澇等）以及與正常發(fā)育相關(guān)的功能基因鑒定與發(fā)掘；③完善豇豆的轉(zhuǎn)基因系統(tǒng)，通過(guò)豇豆的轉(zhuǎn)基因研究，闡明豇豆基因的功能與作用；④隨著基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白組學(xué)和代謝組學(xué)等蓬勃發(fā)展，“組學(xué)”將在多個(gè)層次上拓寬和加深豇豆的分子遺傳機(jī)理闡釋。

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