金屬離子對(duì)重組大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)α—環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的影響

羅宇笛　李嘯　張江　石小丹

摘 要：本文研究了金屬離子對(duì)α-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶發(fā)酵生產(chǎn)的影響。首先，采用單因素分析確定幾種微量元素的最佳產(chǎn)酶濃度；其次，通過(guò)兩水平析因試驗(yàn)確定了關(guān)鍵的影響因子及其最大響應(yīng)區(qū)域，其分別是MgSO4·7H2O，F(xiàn)eSO4·7H2O，MnSO4·H2O；最后，通過(guò) Box-Benhnken中心組合試驗(yàn)建立數(shù)學(xué)模型，并采用響應(yīng)面分析法獲得了微量元素的最優(yōu)配比參數(shù)為：MgSO4·7H2O 10.94 mmol·L-1，F(xiàn)eSO4·7H2O 6.48 mmol·L-1，MnSO4·H2O 0.51 mmol·L-1， CaCl2·5H2O 3 mmol·L-1。與對(duì)照組相比，酶活提高了1.4倍。

關(guān)鍵詞：大腸桿菌；α-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶；金屬離子；響應(yīng)面設(shè)計(jì)

中圖分類(lèi)號(hào)：Q93-335 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2014.12.003

α-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶（α-Cyclodextrin Glycosyltransferase，簡(jiǎn)稱(chēng)α-CGT酶，EC 2.4.1.19）是糖基水解酶α-淀粉酶家族（家族13）中的重要成員，是微生物所產(chǎn)的胞外酶，能夠催化4種反應(yīng)——歧化反應(yīng)、環(huán)化反應(yīng)、偶合反應(yīng)和水解反應(yīng)[1-3]。

天然的CGT酶大部分來(lái)自嗜熱脂肪芽孢桿菌、嗜堿脂肪芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌和軟化芽孢桿菌，而構(gòu)建的基因工程菌為大腸桿菌[4]?；蚬こ叹谏L(zhǎng)和產(chǎn)酶過(guò)程中需要無(wú)機(jī)鹽維持細(xì)胞的滲透壓，并合成核酸等物質(zhì)；一些微量元素如鈣、鐵、鋅對(duì)酶活性中心或輔酶的生成以及酶激活劑的作用有著重要影響[5-8]。本研究采用單因素實(shí)驗(yàn)、兩水平析因?qū)嶒?yàn)、中心組合設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面分析法探討了金屬離子對(duì)α-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶發(fā)酵生產(chǎn)的影響，并得到優(yōu)化的配比，為α-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的生產(chǎn)具有一定的指導(dǎo)意義。

1 材料和方法

1.1 材 料

1.1.1 菌種 重組大腸桿菌 E.coli BL21（DE3），由安琪酵母股份有限公司提供。

1.1.2 試劑 酵母浸出物 （FM818，簡(jiǎn)稱(chēng)YE）由安琪酵母股份有限公司生產(chǎn)；酵母蛋白胨由安琪酵母股份有限公司生產(chǎn)；其他試劑均為分析純AR。

1.1.3 培養(yǎng)基 斜面培養(yǎng)基（g·L-1）：甘油 10.0，牛骨蛋白胨 9.0，酵母浸出物（FM818） 10.0， K2HPO4 16.4，KH2PO4 2.3，MgSO4·7H2O 0.5，瓊脂粉16。

液體培養(yǎng)基（g·L-1）：甘油 10.0，牛骨蛋白胨 9.0，酵母浸出物（FM818） 10.0，K2HPO4 16.4，KH2PO4 2.3，MgSO4·7H2O 0.5。

1.2 方 法

1.2.1 種子培養(yǎng) 將斜面菌樣接入裝有50 mL液體培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，制備2瓶，在37 ℃和200 r·min-1 搖床上培養(yǎng)8 h。

1.2.2 發(fā)酵培養(yǎng) 將5 mL種子瓶菌樣接入裝有100 mL液體培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，制備6瓶，在30 ℃和180 r·min-1搖床上培養(yǎng)40 h。

1.2.3 菌體生物量的測(cè)定 采用分光光度計(jì)測(cè)定發(fā)酵液在600 nm波長(zhǎng)處的吸光度OD600。

1.2.4 周質(zhì)空間中α-CGT酶的制備 取一定量菌體的發(fā)酵液于4 ℃、6 000 r·min-1下離心10 min，倒去上清液。用蒸餾水洗滌細(xì)胞沉淀2遍，離心（同上）后取2 g左右菌體細(xì)胞，按照比例1： 10（m/v）加入對(duì)應(yīng)體積的Tris-EDTA緩沖液混合均勻。細(xì)胞懸液使用超聲波細(xì)胞破碎儀進(jìn)行破碎后，于4 ℃、4 000 r·min-1下離心5 min，所得上清液為周質(zhì)空間中α-CGTase酶活測(cè)定液。

1.2.5 α-CGT酶環(huán)化活力的測(cè)定 甲基橙法測(cè)定環(huán)化活性：取離心后并適當(dāng)稀釋的發(fā)酵上清液100 μL，加入裝有900 μL預(yù)先用50 mmol·L-1的磷酸緩沖液（pH值6.0）配制的1%（W/V）麥芽糊精溶液的試管中，在40 ℃下反應(yīng)10 min后，加入1.0 mL濃度為1.0 mol·L-1的鹽酸終止反應(yīng)，再加入1.0 mL的用50 mmol·L-1的磷酸緩沖液配制的0.1 mmol·L-1甲基橙溶液，20 ℃下保溫15 min，在508 nm處測(cè)定吸光度。對(duì)應(yīng)α-環(huán)糊精標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算出環(huán)糊精濃度，一個(gè)酶活單位（U）定義為在上述條件下每分鐘生成1 μmol的α-環(huán)糊精所需的酶量[9-10]。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

從10種微量元素中初步篩選出Mg2+、Fe2+、Mn2+、Ca2+這4種顯著因素，分別以不同濃度加入發(fā)酵培養(yǎng)基中，以空白為對(duì)照，測(cè)定酶活，結(jié)果如表1所示。

從表1可以看出，4種金屬離子在較低濃度情況下都對(duì)酶活有一定的提高作用，同時(shí)，在所設(shè)計(jì)的離子濃度梯度中，均發(fā)現(xiàn)了峰值。為了得出這4種金屬離子的最佳配比濃度，需要做進(jìn)一步的試驗(yàn)。

2.2 兩水平析因?qū)嶒?yàn)及結(jié)果

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，利用Design Expert Software（Stat-Ease Inc.， Minneapolis， MN， USA， Version 8.0）軟件設(shè)計(jì)24-2 兩水平部分析因試驗(yàn)（FFD），考察MgSO4·7H2O（X1）、CaCl2·5H2O（X2）、FeSO4·7H2O（X3）、MnSO4·H2O（X4）4個(gè)因素對(duì)基因重組大腸桿菌生長(zhǎng)和產(chǎn)酶的影響以及各因素之間的交互作用，以確定影響產(chǎn)酶的顯著因素。各因素規(guī)范值與實(shí)際值的設(shè)定水平及試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

3

根據(jù)回歸分析結(jié)果（表3），得到線(xiàn)性回歸方程，其中包括FFD試驗(yàn)所有項(xiàng)，如下：