GluK2受體酪氨酸磷酸化突變體的構(gòu)建及其功能研究

朱秋菊 孫長城 王億 侯筱宇

(江蘇省腦病生物信息重點實驗室 徐州醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)研究中心,江蘇徐州 221002)

GluK2受體酪氨酸磷酸化突變體的構(gòu)建及其功能研究

朱秋菊 孫長城 王億 侯筱宇

(江蘇省腦病生物信息重點實驗室 徐州醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)研究中心,江蘇徐州 221002)

研究表明谷氨酸過度激活其受體是缺血性腦中風(fēng)腦損傷的關(guān)鍵,KA受體的GluK2亞基參與了腦缺血再灌注引起的神經(jīng)細胞的死亡。然而,對于KA 受體在缺血性腦中風(fēng)中的調(diào)節(jié)機制知之甚少。本室前期電生理膜片鉗研究結(jié)果表明Src激酶通過介導(dǎo)GluK2的酪氨酸磷酸化上調(diào)KA受體的功能。本課題擬在探索GluK2酪氨酸磷酸化的修飾方式及進一步研究酪氨酸磷酸化修飾GluK2受體功能的調(diào)節(jié)。

GluK2 酪氨酸磷酸化 Src激酶

缺血性腦損傷中，KA受體的持續(xù)激活與神經(jīng)功能紊亂以及喪失具有密切關(guān)系。KA受體在中樞神經(jīng)系統(tǒng)尤其是海馬區(qū)廣泛表達，是由不同亞基組成的四聚體離子型谷氨酸受體，包括GluK1，2，3;GluK4，5。其中，GluK1，2，3可形成同源功能性KA受體。GluK2基因敲除的小鼠對海人藻酸誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性有抵抗力[1]。我室前期研究表明腦缺血再灌注以及癲癇可以增加GluK2-PSD95-MLK3信號模塊的組裝繼而促進MLK3-JNK3信號通路的活化，最終導(dǎo)致神經(jīng)元的凋亡[2]。然而，關(guān)于KA受體GluK2亞基功能的具體調(diào)節(jié)機制尚不清楚。

可逆磷酸化是受體功能調(diào)節(jié)的重要方式之一。越來越多的證據(jù)表明酪氨酸磷酸化參與腦缺血后NMDA受體多種功能的調(diào)節(jié)。然而，關(guān)于酪氨酸磷酸化是否參與調(diào)節(jié)Kainate受體的功能尚未見報道。在哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，非受體酪氨酸蛋白激酶Src激酶家族包括不同的成員：Src，F(xiàn)yn，Yes，Lck和Lyn[3]。之前的研究表明：腦缺血后，在神經(jīng)系統(tǒng)大量表達的Src成員在缺血敏感區(qū)尤其是海馬區(qū)的活性顯著增強[4-7]。

本研究中采用定點突變體試劑盒獲得GluK2胞內(nèi)區(qū)域的酪氨酸位點突變體(Y587/590/844F)，用電生理方法檢測不同突變體受體功能的變化。結(jié)果表明，GluK2亞基的酪氨酸磷酸化位點主要位于胞內(nèi)區(qū)。

圖1 構(gòu)建的不同突變體的測序結(jié)果

圖2 構(gòu)建的不同突變體在HEK293細胞中的表達

圖3 磷酸化缺失型突變體顯著降低GluK2受體介導(dǎo)的全細胞電流,結(jié)果均表示為平均值±標準誤

1 實驗材料和方法

1.1 引物和抗體

引物由上海生工生物公司合成提供，兔多克隆抗體抗GluK2/3(06-309)購自Millipore生物公司，堿性磷酸酶AP標記的羊抗兔二抗購自Sigma生物公司。

1.2 GluK2磷酸化缺失突變體的構(gòu)建

根據(jù)文章報道的GluK2受體結(jié)構(gòu)[8]，細胞內(nèi)側(cè)區(qū)域存在三個酪氨酸位點，分別為Y587，Y590，Y844。根據(jù)GeneBank中GluK2(GenBank：Z11548.1)的序列分別設(shè)計在Y587，Y590，Y844對應(yīng)酪氨酸的附近設(shè)計一對上下游引物。以本實驗室保存的GluK2(Q型)的重組質(zhì)粒為模板，利用三個位點定點突變的引物以獲得對應(yīng)三個位點的突變體。Y587F上游引物序列為：

下游引物序列為：

Y590F上游引物序列為：

下游引物序列為：

Y844F上游引物序列為：

下游引物序列為：

Y587/590F上游引物序列為：

下游引物序列為：

以上述構(gòu)建成功的GluK2(Q型)Y844F的重組質(zhì)粒為模板，以Y587/590F雙位點突變體引物進行PCR擴增，構(gòu)建GluK2磷酸化缺失型突變體Y587/590/844F重組真核表達質(zhì)粒。

以Q型GluK2為模板，按照STRATAGENE 公司快速定點突變試劑盒的操作說明確定合適的實驗條件進行PCR反應(yīng)和質(zhì)粒轉(zhuǎn)化，按照常規(guī)的實驗方法進行質(zhì)粒的篩選，小制備獲得的質(zhì)粒經(jīng)金斯瑞生物公司測序鑒定

1.3 免疫印跡

按Lowry法進行蛋白質(zhì)含量測定。構(gòu)建的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染于HEK293細胞，收取的細胞樣品分裝及處理均在4℃條件下進行。含相同蛋白量的樣品中加入等體積 4×laemmli蛋白上樣緩沖液，置沸水浴中5 min變性處理。取等量的變性蛋白質(zhì)樣品(100μg)或IP處理后樣品，經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(polyacrylamide gel electrophoresis;PAGE)分離后，以濕轉(zhuǎn)法電轉(zhuǎn)移至NC膜上。將NC膜置封閉液中室溫孵育3 h后，加入一抗工作液，4℃孵育4 h或過夜，TBST洗膜(5min×3)后，加入AP標記的二抗的工作液，室溫孵育2小時，TBST洗膜(3min×5)，水洗。使用NBT/BCIP試劑盒，在新鮮配制的AP顯色液中顯色，流水洗滌終止反應(yīng)。

2 全細胞電壓鉗

電生理記錄方式采用全細胞電壓鉗模式，鉗制電壓為-60mV，細胞外液配方(mM)：NaCl 140，KCl 5，MgCl2 1，CaCl2 2，HEPES 10，glucose 10。電極內(nèi)液配方為(mM)：CsCl 140，CaCl2 0.5，MgCl2 2，EGTA 5，Na2ATP 3，HEPES 10。使用Axonpatch 700B放大器進行數(shù)據(jù)測量，Digidata 1322A數(shù)據(jù)采集器進行數(shù)據(jù)采集，Clampex和Clampfit軟件進行數(shù)據(jù)分析。

3 實驗結(jié)果

3.1 成功構(gòu)建GluK2(Q型)磷酸化缺失型突變體

為了研究GluK2(Q型)可能的磷酸化位點，本實驗構(gòu)建了GluK2受體胞區(qū)域序列中的3個酪氨酸位點的單點突變體(Y587F，Y590F，Y844F)以及三點突變體(Triple)。序列比對結(jié)果顯示，全自動測序的結(jié)果中，GluK2 Y587F與GeneBank中GluK2序列僅在1760處堿基的差異(A→T)，其余序列完全一致。GluK2 Y590F與GeneBank中GluK2序列僅在1769處堿基的差異(A→T)，其余序列完全一致GluK2 Y844F與GeneBank中GluK2序列僅在2531處堿基的差異(A→T)，其余序列完全一致。證明所構(gòu)建的GluK2(Q型)酪氨酸磷酸化缺陷型突變體Y587F、Y590F及Y844F序列均完全正確。

以上述構(gòu)建成功的GluK2(Q型)Y844F的重組質(zhì)粒為模板，以Y587/590F雙位點突變體引物進行PCR擴增，構(gòu)建GluK2磷酸化缺失型突變體Y587/590/844F重組真核表達質(zhì)粒。序列比對結(jié)果顯示， Y587/590/844F與GeneBank中GluK2序列在1760bp，1769bp和2531bp三個堿基存在差異，均為A→T。結(jié)果證明，本實驗成功構(gòu)建GluK2(Q型)酪氨酸磷酸化缺陷型突變體Y587/590/844F。

3.2 構(gòu)建的各種突變體在COS-7細胞中的表達

將上述構(gòu)建成功的各種GluK2(Q型)胞內(nèi)區(qū)域酪氨酸位點突變體的真核表達質(zhì)粒進行中量制備，中制備的質(zhì)粒采用PEI 轉(zhuǎn)染法進行COS-7細胞轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染24h收集細胞，制備的細胞樣品以抗GluK2的抗體進行免疫印跡檢測GluK2不同突變體的蛋白表達。結(jié)果顯示Fig.2，GluK2的各種突變體在轉(zhuǎn)染的COS-7細胞中得到很好的表達。結(jié)果表明，本實驗成功構(gòu)建的各種GluK2酪氨酸磷酸化缺失型突變體可用于GluK2功能調(diào)節(jié)的進一步研究。

3.3 Y587/590/844F降低GluK2(Q)同聚型受體電流增強

為了驗證GluK2亞基的酪氨酸磷酸化與GluK2同聚型受體功能之間的關(guān)系，將三個酪氨酸位點的突變體與活化的Src激酶(aSrc)共轉(zhuǎn)染于HEK293細胞，利用全細胞電壓鉗技術(shù)，記錄HEK293細胞上GluK2同聚型受體介導(dǎo)的電流，進一步探索GluK2同聚型受體功能與Src激酶介導(dǎo)的酪氨酸磷酸化反應(yīng)之間的關(guān)系。

結(jié)果顯示Fig.3，在Src激酶作用下，在Y587/590/844F轉(zhuǎn)染(8.29±1.12pA/pF，n=11)記錄到的電流密度小于野生型(wildtype，wt)組(46.95±5.91pA/pF，n=25)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P〈0.05)，實驗結(jié)果表明，Src激酶介導(dǎo)的GluK2(Q)酪氨酸磷酸化

對其受體功能的調(diào)節(jié)主要與其胞內(nèi)區(qū)域的酪氨酸位點有關(guān)。

4 討論

谷氨酸興奮毒是腦缺血引起神經(jīng)元功能損傷的重要機制。腦缺血引起各種谷氨酸受體主要包括NMDA 受體和海人藻酸受體的過度激活，最終引起神經(jīng)元死亡。對受體功能調(diào)節(jié)機制的研究在闡明腦缺血神經(jīng)元損傷機制的研究以及腦缺血中風(fēng)疾病的治療方面具有非常重要的意義。

報道稱離子通道型受體受到多種可逆共價修飾方式的調(diào)節(jié)。蛋白質(zhì)的酪氨酸磷酸化是調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)功能的重要方式之一[9]，已有研究報道腦缺血再灌注過程中Src家族激酶介導(dǎo)了NMDA受體、AMPA受體的酪氨酸磷酸化并能上調(diào)其功能[10，11]。關(guān)于Src家族激酶介導(dǎo)KA受體功能的調(diào)節(jié)尚未見報道。本文中成功構(gòu)建各種可能是Src介導(dǎo)KA受體GluK2亞基酪氨酸磷酸化位點的定點突變體，為研究Src激酶催化GluK2酪氨酸磷酸化及其對GluK2受體功能調(diào)節(jié)的具體過程提供了基礎(chǔ)。

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