雙水相法提取澳洲茶樹黃酮研究

畢榮璐+王加興+凌清華+熊智+劉祥義

摘 要：為優(yōu)化雙水相法提取澳洲茶樹中黃酮類化合物的條件，以澳洲茶樹葉的總黃酮提取率為評價指標，分別對雙水相的溶劑飽和程度、乙醇濃度、料液比、提取時間、提取溫度對黃酮提取率影響進行了探究。結果表明，雙水相提取優(yōu)化條件為溶劑飽和度磷酸二氫鉀∶乙醇1∶2（w/v），70%（v/v）乙醇，料液比1∶20（w/v），提取時間為90min，提取溫度90℃。提取率最高6.74%。雙水相提取澳洲茶樹黃酮提取率較高，且分相時間短，不存在有機溶劑殘留，易于工藝放大和連續(xù)操作，是一種理想的提取方法。

關鍵詞：澳洲茶樹；黃酮；提取；雙水相法

中圖分類號 S79 文獻標識碼 A 文章編號 1007-7731（2014）22-39-04

Study on Aqueous Two-phase Extraction of Flavonoids from Melaleuca ahemifolia

Bi Ronglu1 et al.

（1Southwest Forestry University，Kunming 650224，China）

Abstract：The study was based on the evaluation index of flavonoids from melaleuca ahemifolia Extraction efficiency，to optimizate method of Aqueous two-phase extraction of flavonoid compounds in Australia tea tree. The main research content including solvent saturated degree，ethanol concentration，solid-liquid ratio，extraction time，extraction temperature effect on flavonoids extraction yield of aqueous two-phase. The result showed that the conditions were ethanol 1∶2（w/v），70%（v/v）ethanol，material liquid than 1∶20（w/v），the extraction time was 90 min，extraction temperature 90℃，extraction efficiency rached to 6.74%. The rate of flavonoids is high by the method of aqueous two-phase，and the phase separation time is short，there is no organic solvent residue，easy to process scale and continuous operation，is an ideal extraction method.

Keywords：Melaleuca ahemifolia；Flavonoids；Extraction；Aqueous two-phase

澳洲茶樹又名互葉白千層（Melaleuca ahemifolia），是桃金娘科（Myrtaceae）、白千層屬（Melaleuca L.）植物，原產于澳洲，現我國廣東、廣西、云南等地均已廣泛種植。澳洲茶樹適應性強，生長迅速，具有一定的抗寒性，故可用于園林綠化，但該植物最主要的用途是提取澳洲茶樹油，俗稱“茶樹精油”。茶樹精油具有強力的消炎殺菌功效，并在心理療效、生理療效、皮膚療效等方面有一定的作用，現已廣泛用于日常生活的各個領域[1-3]。此外，澳洲茶樹葉中含有黃酮類化合物[4-5]，而黃酮類化合物具有多種多樣的生物活性和藥理作用，其對于心腦血管疾病及降低膽固醇、高血壓等都有很好的作用[6]。為避免澳洲茶樹枝葉提取精油后剩余部分被作為廢棄料處理，提高澳洲茶樹資源的利用率，本試驗以澳洲茶樹葉中總黃酮提取率為指標，分別對雙水相的溶劑飽和程度、乙醇濃度、料液比、提取時間、提取溫度對黃酮提取率的影響進行了研究，以期為澳洲茶樹葉資源的綜合利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料（1）澳洲茶樹樹葉，由云南森源化工有限公司提供。（2）主要儀器：DZF-6030B型真空干燥箱，購自上海恒科公司；JJ-2植物組織粉碎機，購自北京中興偉業(yè)儀器公司；HH-S型恒溫水浴箱，購自鄭州長城科工貿有限公司；722型可見光分光光度計，購自上海精密科學儀器公司；電子天平，購自梅特勒-托利多儀器上海有限公司。（3）主要試劑：蘆丁標準品98%，購自南京澤朗植提技術有限公司；磷酸二氫鉀、硝酸鋁、亞硝酸鈉、無水乙醇、石油醚、氫氧化鈉及鹽酸均為分析純，市售。

1.2 試驗方法

1.2.1 線性關系的考察[7-11] 準確稱取已于105℃干燥恒重的蘆丁標樣31.50mg，用70%乙醇溶解定容于100mL容量瓶，搖勻（0.315mg/mL）備用；分別取上述蘆丁溶液0、2.0mL、4.0mL、6.0mL、8.0mL于5只10mL容量瓶中，加入2mL亞硝酸鈉（5%），搖勻。放置6min后加入6mL硝酸鋁（10%），搖勻。6min后再加入20mL濃度為4%的氫氧化鈉，用蒸餾水稀釋至刻度，搖勻，10min后于波長510nm處測定吸光度值A，試劑為空白參比。記錄數據，繪制標準曲線，得到蘆丁溶液質量濃度C與吸光度值A的回歸方程式。

1.2.2 黃酮含量的測定 準確移取澳洲茶樹樣品待測液于容量瓶中進行顯色和吸光度A的測定，用回歸方程式計算得到待測液中黃酮的濃度C，然后按下式計算得到總黃酮含量：endprint

樣品的總黃酮含量（%）=（C×4）/M×100

式中：M為樣品質量（g）；C為樣品液的總黃酮濃度（mg/mL）。

1.2.3 儀器精密度試驗 準確移取標準品液（0.315mg/mL）2mL于50mL比色管中，加入2mL亞硝酸鈉（5%），搖勻。6min后加入6mL硝酸鋁（10%），搖勻。6min后再加入20mL濃度為（4%）的氫氧化鈉，用蒸餾水定容至刻度，搖勻。15min后于波長510nm處測定吸光度值A。連續(xù)測定6次，計算黃酮含量和相對標準偏差（RSD），考察儀器精密度。

1.2.4 顯色穩(wěn)定性試驗 準確移取待測液2mL于50mL比色管中，加入2mL亞硝酸鈉（5%），搖勻。放置6min后加入6mL硝酸鋁（10%），搖勻。6min后再加入20mL濃度為4%的氫氧化鈉，用蒸餾水定容至刻度，搖勻，15min后于波長510nm處測定吸光度值A。每隔1h測量1次，測量8次，計算黃酮含量和相對標準偏差（RSD），考察樣品液的顯色穩(wěn)定性。

1.2.5 單因素試驗

1.2.5.1 乙醇濃度對澳洲茶樹黃酮提取率的影響 準確稱取已預處理的澳洲茶樹樣品于圓底燒瓶中，料液比1∶20（w/v），磷酸二氫鉀飽和度為1∶2（w/v），改變乙醇濃度，于80℃水浴中回流提取2h，將提取液連同樣品一起轉移至100mL容量瓶中，定容。然后取上清液部分作為待測液，測定吸光度。

1.2.5.2 料液比對澳洲茶樹黃酮提取率的影響 準確稱取已預處理的澳洲茶樹樣品于圓底燒瓶中，在70%乙醇，磷酸二氫鉀飽和度為1∶2（w/v），改變料液比，于80℃水浴中回流提取2h，然后進行測定。

1.2.5.3 回流時間對澳洲茶樹黃酮提取率的影響 準確稱取已預處理的澳洲茶樹樣品于圓底燒瓶中，在70%乙醇，磷酸二氫鉀飽和度為1∶2（w/v），料液比1∶20（w/v），于80℃水浴中回流提取不同時間，然后進行測定。

1.2.5.4 雙水相飽和程度對澳洲茶樹黃酮提取率的影響 準確稱取已預處理的澳洲茶樹樣品于圓底燒瓶中，在70%乙醇，料液比1∶20（w/v），改變磷酸二氫鉀飽和度，于80℃水浴中回流提取2h，然后進行測定。

1.2.5.5 提取溫度對澳洲茶樹黃酮提取率的影響 準確稱取已預處理的澳洲茶樹樣品于圓底燒瓶中，在70%乙醇，料液比1∶20（w/v），磷酸二氫鉀飽和度為1∶2（w/v），于不同溫度水浴中回流提取2h，然后進行測定。

1.2.6 正交試驗 根據單因素試驗結果，在磷酸二氫鉀飽和度為1∶2（w/v）時，以乙醇濃度、料液比、回流時間、提取溫度為考察因素，澳洲茶樹總黃酮提取率為考察指標，設計L9（34）正交試驗表，各因素水平如表l所示。

1.2.7 最佳工藝條件驗證試驗 在最佳條件組合下進行5次平行驗證性試驗，以考察最佳條件的合理性和可靠性。

2 結果與分析

2.1 線性關系考察 以蘆丁對照品溶液濃度為橫坐標，吸光度值為縱坐標作圖，得到標準曲線。計算得線性回歸方程為：A=9.5278C+0.0041，R2=0.9994。試驗結果表明，當蘆丁質量濃度在0～50.4mg/L范圍內時，服從朗伯-比爾定理，因此試驗所得數據可靠。

2.2 儀器精密度試驗 儀器精密度試驗結果見表2。由表2可知，RSD為0.74%，表明儀器精密度良好。

2.3 顯色穩(wěn)定性試驗 顯色穩(wěn)定性試驗結果見表3。由表3可知，RSD為0.90%，表明樣品溶液在8h內顯色穩(wěn)定。

2.4 單因素試驗

2.4.1 不同乙醇濃度對澳洲茶樹黃酮提取率的影響 由圖1可知，當乙醇濃度在40%～60%時，黃酮類化合物得率和乙醇濃度成正比；當乙醇濃度大于60%（v/v）時，得率基本趨于穩(wěn)定。說明乙醇濃度增大有利黃酮化合物溶解，但過大不易達到濃度平衡，還浪費乙醇。因此，乙醇濃度控制在60%～80%（v/v）較好。

圖1 回流提取乙醇濃度對提取率的影響

2.4.2 不同料液比對澳洲茶樹黃酮提取率的影響 由圖2可知，當料液比在1∶10～l∶20時，得率和料液比成正比；當料液比大于1∶20時，得率基本保持不變。1∶10～l∶20前，提取劑量少，對化合物浸泡不充分，提取劑量在繼續(xù)增大只會造成浪費，所以料液比選擇范圍為1∶20～1∶35較好。

圖2 料液比對澳洲茶樹黃酮提取率的影響

2.4.3 不同回流時間對澳洲茶樹黃酮提取率的影響 由圖3可知，提取時間在30～50min速度較快，60min后變化不大。溶劑進入細胞內，黃酮類化合物再從細胞內溶解到細胞外，達到濃度平衡需要一定的時間，一般在達到平衡之前，浸提時間溶出成正比，但到溶解平衡以后，延長浸提時間對黃酮類化合物的溶出量影響不大，可能還會增加其它雜質的溶出量并且還浪費時間。綜合考慮，提取時間以60～90min為合適。

圖3 回流提取時間對提取率的影響

2.4.4 不同雙水相飽和度對澳洲茶樹黃酮提取率的影響 由圖4可知，飽和程度在1∶2.5～1∶5時得率變化較快，1∶2前變化不大。澳洲茶樹黃酮類化合物在提取液剛飽和時得率較高，但過飽和后溶劑量會減少，所能溶解的樣品就會減少，不利于提取并且還浪費資源。綜合考慮，飽和程度在1∶1.5～1∶2.5為宜。

圖4 雙水相提起飽和程度對得率的影響

2.4.5 不同提取溫度對澳洲茶樹黃酮提取率的影響 由圖5可知，提取溫度在30～70℃時得率提高速度較快，70℃后變化不大。澳洲茶樹黃酮類化合物從細胞內溶解到細胞外需要一定濃度的提取液，濃度低時化合物溶解不出來，但太高又不利于節(jié)約資源。綜合考慮，提取溫度以70～93℃為合適。

3 結論與討論

本次試驗采用雙水相法探索了乙醇濃度、料液比、回流時間、雙水相飽和度、回流提取溫度5個單因素對澳洲茶樹總黃酮提取率的影響，并進行了L9（34）正交試驗。通過極差分析得出，最佳提取工藝條件組合為雙水相飽和度磷酸二氫鉀∶乙醇1∶2（w/v），70%（v/v）乙醇，料液比1∶20（w/v），提取時間90min，浸提溫度90℃。最高得率6.74%。驗證試驗得率6.713%，證明該較優(yōu)條件可靠。雙水相提取不存在有機溶劑殘留，不會引起（下轉64頁）（上接41頁）生物活性取值失活或變性，易于工藝放大和連續(xù)操作，后續(xù)提純工序可直接進行，無需進行特殊處理[12]。但雙水相提取提取成本偏高，仍需要后續(xù)再進行進一步的研究完善。

參考文獻

[1]陳碧華，吳麗君，李乾振，等.互葉白千層研究進展[J].福建林業(yè)科技，2010，3（4）：177-182

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[11]Kazuyoshi Yanagihara，Akihiro Ito，Tetsuya Toge，et al.Antiproliferative effects of isoflavones on human cancer celllines established from the gastrointestinal tract[J].Cancer Research，1993，（53）：5815-5821.

[12]李偉，朱自強，梅樂和，等.雙水相萃取技術在藥物分離和提取中的應用[J].化工進展，1998（1）. （責編：張宏民）endprint

圖4 雙水相提起飽和程度對得率的影響

2.4.5 不同提取溫度對澳洲茶樹黃酮提取率的影響 由圖5可知，提取溫度在30～70℃時得率提高速度較快，70℃后變化不大。澳洲茶樹黃酮類化合物從細胞內溶解到細胞外需要一定濃度的提取液，濃度低時化合物溶解不出來，但太高又不利于節(jié)約資源。綜合考慮，提取溫度以70～93℃為合適。

3 結論與討論

本次試驗采用雙水相法探索了乙醇濃度、料液比、回流時間、雙水相飽和度、回流提取溫度5個單因素對澳洲茶樹總黃酮提取率的影響，并進行了L9（34）正交試驗。通過極差分析得出，最佳提取工藝條件組合為雙水相飽和度磷酸二氫鉀∶乙醇1∶2（w/v），70%（v/v）乙醇，料液比1∶20（w/v），提取時間90min，浸提溫度90℃。最高得率6.74%。驗證試驗得率6.713%，證明該較優(yōu)條件可靠。雙水相提取不存在有機溶劑殘留，不會引起（下轉64頁）（上接41頁）生物活性取值失活或變性，易于工藝放大和連續(xù)操作，后續(xù)提純工序可直接進行，無需進行特殊處理[12]。但雙水相提取提取成本偏高，仍需要后續(xù)再進行進一步的研究完善。

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[12]李偉，朱自強，梅樂和，等.雙水相萃取技術在藥物分離和提取中的應用[J].化工進展，1998（1）. （責編：張宏民）endprint

圖4 雙水相提起飽和程度對得率的影響

2.4.5 不同提取溫度對澳洲茶樹黃酮提取率的影響 由圖5可知，提取溫度在30～70℃時得率提高速度較快，70℃后變化不大。澳洲茶樹黃酮類化合物從細胞內溶解到細胞外需要一定濃度的提取液，濃度低時化合物溶解不出來，但太高又不利于節(jié)約資源。綜合考慮，提取溫度以70～93℃為合適。

3 結論與討論

本次試驗采用雙水相法探索了乙醇濃度、料液比、回流時間、雙水相飽和度、回流提取溫度5個單因素對澳洲茶樹總黃酮提取率的影響，并進行了L9（34）正交試驗。通過極差分析得出，最佳提取工藝條件組合為雙水相飽和度磷酸二氫鉀∶乙醇1∶2（w/v），70%（v/v）乙醇，料液比1∶20（w/v），提取時間90min，浸提溫度90℃。最高得率6.74%。驗證試驗得率6.713%，證明該較優(yōu)條件可靠。雙水相提取不存在有機溶劑殘留，不會引起（下轉64頁）（上接41頁）生物活性取值失活或變性，易于工藝放大和連續(xù)操作，后續(xù)提純工序可直接進行，無需進行特殊處理[12]。但雙水相提取提取成本偏高，仍需要后續(xù)再進行進一步的研究完善。

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[12]李偉，朱自強，梅樂和，等.雙水相萃取技術在藥物分離和提取中的應用[J].化工進展，1998（1）. （責編：張宏民）endprint