三種蒿屬植物葉面腺體觀察及其揮發(fā)性物質(zhì)的SPME－GC－MS 分析

唐巧玉，付 偉，周毅峰，周大寨

(1．生物資源保護與利用湖北省重點實驗室( 湖北民族學(xué)院) ，湖北 恩施445000;2．湖北民族學(xué)院 生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，湖北 恩施445000)

蒿屬植物含有揮發(fā)油、黃酮、萜類等多種活性化合物，為常用的中藥材，具有抗菌消炎、降血壓、降血脂、調(diào)節(jié)免疫機能等藥理作用［1－3］，其中對蒿屬植物中的黃花蒿的相關(guān)研究最多．在蒿屬植物中，揮發(fā)油是一大類生物活性物質(zhì)，目前許多研究表明，植物揮發(fā)性物質(zhì)主要存在種子植物中和植物的腺毛、油管、分泌細(xì)胞、油室或樹脂道中，揮發(fā)性物質(zhì)可以通過腺毛體而揮發(fā)［4－5］．本文首先觀察了三種蒿屬植物葉面腺毛體數(shù)量，然后采用頂空固相微萃取法在室溫條件下利用萃取頭對艾蒿(Artemisia argyiH． Lév． et Vaniot)、黃花蒿(Artemisia annuaL．)和臭蒿(Artemisia hedinii)三種蒿屬植物揮發(fā)性物質(zhì)進行萃取，再采用氣相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(GS－MS)分析蒿屬植物揮發(fā)性物質(zhì)，比較三種蒿屬植物揮發(fā)性物質(zhì)的異同點，并將腺毛體數(shù)量與三種蒿屬植物葉片揮發(fā)性物質(zhì)聯(lián)系在一起，從而探討蒿屬植物的揮發(fā)性物質(zhì)成分、含量及其影響因素，為其在醫(yī)藥、工業(yè)、科研等方面的開發(fā)利用提供研究依據(jù)和理論指導(dǎo)，對開發(fā)利用我國豐富的蒿屬植物資源具有重要的現(xiàn)實意義和理論價值，使蒿屬植物生物資源的開發(fā)利用有一定經(jīng)濟和社會效益．

1 材料與方法

1．1 材料與設(shè)備

1．1．1 材料 黃花蒿(Artemisia annuaL．):實驗室盆栽;新鮮艾蒿(Artemisia argyiH． Lév． et Vaniot)和臭蒿(Artemisia hedinii):校內(nèi)(梨園)實習(xí)基地采摘．

1．1．2 設(shè)備 數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱(GZX－9420MBE，上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠);分析天平(ME204E/02，梅特勒－托利多有限公司);尼康Nikon AZ100 型體式熒光DIC 成像系統(tǒng)(上海衡浩儀器有限公司);Agilent 6890N/5975C 型氣相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國安捷倫公司);DBV/CAR/PDMS 50/30 μm 萃取頭(美國Supelco 公司)．

1．2 方法

1．2．1 體式熒光測定三種蒿屬植物的腺毛體密度 為了觀察艾蒿、臭蒿、黃花蒿三種蒿屬植物葉面腺毛體并加以比較分析，分別選取三種蒿屬植物生長較旺盛的葉片，輕輕去掉葉片上面的雜質(zhì)，進行壓片制片，在AZ100 型體式熒光DIC 成像系統(tǒng)下分別觀察葉上、中、下部位，并加以分析統(tǒng)計．

1．2．2 三種蒿屬植物揮發(fā)性物質(zhì)測定

1．2．2．1 取樣 分別選取艾蒿、臭蒿、黃花蒿三種蒿屬植物生長較旺盛的葉片，輕輕去掉葉片上面的雜質(zhì)并放入分析天平中進行稱重，并記錄數(shù)據(jù)．

1．2．2．2 頂空固相微萃?。?］將已稱取的蒿屬植物葉片加入到50 mL 試劑瓶中并稱取適量的無水氯化鈣加入其中，然后用8 層封口膜對試劑瓶瓶口進行密封，并用2 根橡皮筋將瓶口的封口扎緊，迅速插入已在進樣口(250℃)老化30min 的萃取桿，推出萃取頭，在常溫下萃取30 min．

1．2．2．3 GC－MS 測定［7－9］將已經(jīng)萃取完畢的萃取頭推回，將萃取桿迅速插入氣相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用儀的進樣口，推出萃取頭，解吸3 min，進行測定．測定時，氣相色譜條件:HP－5MS 石英毛細(xì)管柱(0．25 μm×0．25 mm×30 m)，載氣為氦氣，流速為1 mL/min，進樣口溫度為250℃，不分流進樣．程序升溫條件:40℃保持2 min，再以5℃/min 升溫至130℃，保持1 min;再以15℃/min 升溫至280℃，保持2 min．質(zhì)譜條件:離子源EI 源，電子能量70 eV，離子溫度230℃，四級桿溫度為150℃，倍增管電壓1．2 kV，掃描質(zhì)量范圍m/z 35～550．

2 結(jié)果與分析

2．1 三種蒿屬植物葉片腺體觀察

從艾蒿、臭蒿、黃花蒿三種蒿屬植物葉片正反面的顯微圖(圖1，放大倍數(shù)2×106倍)，可以清楚的觀察到，艾蒿葉片正面為深綠色，有白色腺點和少量白色短絨毛，葉片背面有大量的灰白色蛛絲狀密絨毛，并有白色腺點，腺毛體密度為32．5 個/cm2;臭蒿葉片正面為淺綠色，有白色腺點和絨毛，葉片背面有大量的白色腺毛狀短絨毛，并有許多白色腺點，腺毛體密度為24.3 個/cm2;黃花蒿葉片為暗綠色，但葉片正面比其葉片反面顏色較深，葉片兩面有短毛和橢圓形的氣孔．葉片正面和反面均布滿腺毛和非腺毛，腺毛呈橢圓形，T 形非腺毛位于葉脈附近．葉面均有大量有白色腺點，但葉片反面有白色腺點較正面多(葉片正面腺毛體密度為53.5 個/cm2，葉片反面腺毛體密度為47.6 個/cm2)．

2．2 三種蒿屬植物揮發(fā)性成分測定

將艾蒿、臭蒿、黃花蒿三種蒿屬植物揮發(fā)性物質(zhì)按照上述方法進行測定，對總離子流圖中的各峰經(jīng)過質(zhì)譜掃描后得質(zhì)譜圖(圖2～4)．為了更好進行直觀的比較，將三種蒿屬植物揮發(fā)性成分總離子流質(zhì)譜圖進行疊加，然后進行經(jīng)質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫檢索，并結(jié)合有關(guān)文獻從基峰、相對豐度等幾個方面進行直觀比較，確定了三種蒿屬植物揮發(fā)性成分的化學(xué)組成，其結(jié)果見圖5．

圖2 艾蒿揮發(fā)性物質(zhì)總離子圖譜Fig．2 Total ion flow superposition graph of Artemisia argyi H． Lév． et Vaniot volatile substances

圖3 臭蒿揮發(fā)性物質(zhì)總離子圖譜Fig．3 Total ion flow superposition graph of Artemisiahedinii volatile substances

圖4 黃花蒿揮發(fā)性物質(zhì)總離子圖譜Fig．4 Total ion flow superposition graph of Artemisia annua L． volatile substances

圖5 三種蒿屬植物揮發(fā)性物質(zhì)總離子流疊加圖Fig．5 Total ion flow superposition graph of three Artemisia volatile substances

經(jīng)固相微萃取法提取艾蒿、臭蒿和黃花蒿三種蒿屬植物的揮發(fā)性物質(zhì)，并用氣相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用法得總離子圖對其化學(xué)成分進行鑒定，將各自的總離子流圖譜進行分析，得出成分分析表，見表1．從三種蒿屬植物揮發(fā)性物質(zhì)成分含量分析表中可知三種蒿屬植物揮發(fā)性物質(zhì)的主要成分均為萜類化合物，但單萜類化合物與倍半萜類化合物的含量很大．艾蒿揮發(fā)性物質(zhì)中單萜類化合物占11．42%，倍半萜類化合物占83．83%;臭蒿揮發(fā)性物質(zhì)中單萜類化合物占13．25%，倍半萜類化合物占63．42%;黃花蒿揮發(fā)性物質(zhì)中單萜類化合物占35．93%，倍半萜類化合物占23．18%．三者均含有順－3－己烯酸乙酯、蒈烯、桉樹腦、大根香葉烯、β－石竹烯，但含量差別很大．艾蒿揮發(fā)性物質(zhì)還含有羅勒烯、2，6－二甲基－1，5，7－辛三烯－3－羥基、樟腦、β－欖香烯、丁香烯、桉葉稀、杜松烯、E－環(huán)氧法尼稀;臭蒿揮發(fā)性物質(zhì)還含有羥基脲、β－蒎稀、β－欖香烯、丁香烯;黃花蒿揮發(fā)性物質(zhì)還含有3－己烯－1－醇、2－辛烯－4－醇、5，5－二甲基－1－乙基－1，3－環(huán)戊二烯、鄰異丙基甲苯、莰烯、β－蒎稀、D－檸檬稀、π 法尼烯．艾蒿揮發(fā)性物質(zhì)與臭蒿揮發(fā)性物質(zhì)較多成分相同，但其含量不同．黃花蒿揮發(fā)性物質(zhì)與艾蒿和臭蒿揮發(fā)性物質(zhì)成分差異較大，只有極少成分相同且含量不同．

表1 三種蒿屬植物揮發(fā)性物質(zhì)成分含量分析Ta．1 Analysis volatile matter content of three Artemisia

3 結(jié)論

經(jīng)過對艾蒿、臭蒿、黃花蒿三種蒿屬植物葉片揮發(fā)性成分總離子流質(zhì)譜圖進行疊加，然后進行譜數(shù)據(jù)庫檢索，并結(jié)合有關(guān)文獻［10］從基峰、相對豐度等幾個方面進行直觀比較，艾蒿揮發(fā)性物質(zhì)占總檢出含量的99．81%，其葉片腺毛體密度居中;臭蒿揮發(fā)性物質(zhì)占總檢出量的98．56%，其葉片上腺毛體密度也最小;黃花蒿揮發(fā)性物質(zhì)占總檢出量的100%，其葉片上的腺毛體密度最大．可以得出這三種蒿屬植物揮發(fā)性物質(zhì)的種類和含量與其葉面上腺毛體的密度相關(guān)，本文尚不能確定三種蒿屬植物揮發(fā)性物質(zhì)與其葉面上腺毛體的密度的具體相關(guān)，還需要進一步試驗研究．

［1］ 江茂生，許文耀．艾蒿提取物對13種植物病原菌物的抑制作用［J］．福建農(nóng)林大學(xué)學(xué)報，2007，36(4):352－356．

［2］ 高志玲，陳艷，謝英輝．黃花蒿揮發(fā)油的體外抑菌活性研究［J］．食品科學(xué)，2010，31(19):209－211．

［3］ 劉芳．青蒿揮發(fā)油抗植物病原真菌活性的研究［J］．東北師范大學(xué)學(xué)報，2008，41(5):34－36．

［4］ 李燕，胡浩斌，鄭旭東，等．青蒿揮發(fā)油研究進展［J］．安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，39(7):3960－3961．

［5］ 張燕，張繼，姚健，等．新疆產(chǎn)黃花蒿揮發(fā)油成分研究［J］．西北師范大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版，2004，14(1):67－69．

［6］ 余正文，王伯初，楊占南，等．水蒸汽蒸餾法及頂空－固相微萃取法提取青蒿花揮發(fā)性成分比較分析［J］．光譜實驗室，2011，31(5):1276－1279．

［7］ 徐新建，宋海，薛國慶，等．青蒿揮發(fā)油化學(xué)成分的氣相色譜－質(zhì)譜分析［J］．時珍國醫(yī)國藥，2009，20(4):931－932．

［8］ 崔兆杰，邱琴，劉廷禮，等．青蒿揮發(fā)油化學(xué)成分的GC/MS 研究［J］．中成藥，2001，23(4):278－280．

［9］ 董巖，王新芳，魏興國．山東艾蒿揮發(fā)油化學(xué)成分的GC－MS 研究［J］．中成藥，2005，27(3):326－328．

［10］ 牟迪，黃蓉，肖凱倫，等．黃花蒿青蒿素含量與腺毛狀毛狀體密度相關(guān)性研究［J］．湖北民族學(xué)院學(xué)報:自然科學(xué)版，2014，32(3):262－265．