長(zhǎng)波紫外線對(duì)皮膚成纖維細(xì)胞表達(dá)和分泌組織蛋白酶G的影響

許慶芳 侯巍 賴維 鄭躍 劉晨 陸春

長(zhǎng)波紫外線對(duì)皮膚成纖維細(xì)胞表達(dá)和分泌組織蛋白酶G的影響

許慶芳 侯巍 賴維 鄭躍 劉晨 陸春

目的研究長(zhǎng)波紫外線(UVA)照射對(duì)皮膚成纖維細(xì)胞組織蛋白酶G(CatG)表達(dá)和分泌的影響。方法原代培養(yǎng)的皮膚成纖維細(xì)胞來(lái)自兒童包皮,10代以內(nèi)的細(xì)胞行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。①以10 J/cm2UVA照射皮膚成纖維細(xì)胞,24、48、72 h后提取照射組和對(duì)照組細(xì)胞蛋白和mRNA,并收集細(xì)胞上清液;②分別以10、20、30 J/cm2UVA照射皮膚成纖維細(xì)胞,24 h后收集細(xì)胞和上清液。用RT-PCR和Western印跡分別檢測(cè)各組細(xì)胞CatG mRNA及蛋白的表達(dá),ELISA檢測(cè)細(xì)胞上清液CatG的含量。結(jié)果 10 J/cm2UVA照射后24、48、72 h,照射組細(xì)胞CatG mRNA表達(dá)分別為0.376±0.014、0.308±0.022和0.296±0.032,對(duì)照組分別為0.183±0.003、0.185±0.005、0.182±0.004;照射組細(xì)胞CatG蛋白灰度值分別為1.80±0.12、1.41±0.17和1.27±0.09,對(duì)照組分別為0.96±0.06、0.95±0.22、1.00±0.14;照射組細(xì)胞CatG mRNA、蛋白表達(dá)及細(xì)胞上清液CatG含量較相應(yīng)的對(duì)照組升高(均P＜0.05),且以照射后24 h表達(dá)最高。10、20、30 J/cm2UVA照射后24 h,皮膚成纖維細(xì)胞CatG mRNA表達(dá)分別為對(duì)照組的1.90、2.51、3.04倍,細(xì)胞CatG蛋白表達(dá)分別為對(duì)照組的1.88、3.97、4.72倍,細(xì)胞上清液CatG含量分別為對(duì)照組的1.36、1.50、1.66倍,均隨UVA劑量的升高而增加,其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P＜0.01)。結(jié)論急性UVA照射促進(jìn)皮膚成纖維細(xì)胞表達(dá)和分泌CatG。

成纖維細(xì)胞;組織蛋白酶類;紫外線;細(xì)胞衰老

有研究表明,組織蛋白酶G(cathepsin G,CatG)在光損傷皮膚和皮膚成纖維細(xì)胞中表達(dá)升高,可能通過(guò)降解真皮細(xì)胞外基質(zhì)參與光損傷發(fā)生[1]。長(zhǎng)波紫外線(UVA)可引起皮膚光損傷,但目前還未見(jiàn)UVA照射對(duì)皮膚成纖維細(xì)胞表達(dá)和分泌CatG影響的研究。本研究在體外用不同劑量UVA照射皮膚成纖維細(xì)胞,研究成纖維細(xì)胞CatG表達(dá)和分泌隨UVA劑量及照射后時(shí)間變化的規(guī)律,探討其在光損傷中的作用及機(jī)制。

材料與方法

一、材料

1.皮膚成纖維細(xì)胞組織來(lái)源:健康人皮膚組織來(lái)自于中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院泌尿外科健康兒童包皮環(huán)切術(shù)后的包皮組織,所選人群年齡5～9歲,平均6歲。本研究經(jīng)過(guò)中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(編號(hào):中大附三醫(yī)倫[2010]2-22號(hào)),患者父母知情同意并簽署知情同意書(shū)。

2.試劑和儀器:DMEM(Dulbeccos modified eagle media)高糖培養(yǎng)基、胰酶、胎牛血清、磷酸鹽緩沖液(PBS)、青鏈霉素為美國(guó)Gibco公司產(chǎn)品。一抗兔抗人CatG IgG抗體由美國(guó)Abcam公司生產(chǎn),內(nèi)參兔抗人GAPDH多克隆IgG抗體、二抗HRP羊抗兔IgG為美國(guó)Cell signaling technology公司產(chǎn)品。BCA蛋白定量試劑盒(美國(guó)Pierce公司)、ECL顯色試劑盒(美國(guó)Millpore公司)、預(yù)染Marker(加拿大Mbi fermentas公司)、總RNA提取試劑Trizol(美國(guó)Invitrogen公司)。Prime-script RT master mix逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和Sybrpremix ex taqTM試劑盒為日本Takara公司產(chǎn)品。CatG ELISA檢測(cè)試劑盒為美國(guó)Biovision公司產(chǎn)品。UVA紫外線輻射儀(Sigmass-03A,燈管為Philips UVA TL10RS,波長(zhǎng)320～400 nm)、UVA照射計(jì)(Sigma ss-03,2012年3月6日標(biāo)定)均為上海希格瑪高科技有限公司產(chǎn)品;酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(美國(guó)Biotek公司);CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo scientific公司);Abi prism 7500型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀。

二、方法

1.原代皮膚成纖維細(xì)胞培養(yǎng):取兒童包皮,參照文獻(xiàn)[2]分離培養(yǎng)皮膚成纖維細(xì)胞,第3代細(xì)胞凍存。細(xì)胞復(fù)蘇后10代以內(nèi)的細(xì)胞行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.UVA照射方法:將3～10代的成纖維細(xì)胞按1×106接種于6 cm的細(xì)胞培養(yǎng)皿,24 h后從培養(yǎng)箱取出,吸棄培養(yǎng)液,PBS洗2次后,每皿加入2 ml PBS。然后把培養(yǎng)皿置于UVA紫外線輻射儀下,距離紫外線光源約15 cm。用UVA照射檢測(cè)儀測(cè)得的平均照射功率為13 mW/cm2,分別照射769、1 538、2 307 s,使照射1次的UVA劑量分別達(dá)10、20、30 J/cm2。對(duì)照組細(xì)胞加入PBS后置于超凈臺(tái)避光。照射后立即吸棄PBS溶液,加入新鮮培養(yǎng)液,置于95%濕度、5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

3.皮膚成纖維細(xì)胞及其培養(yǎng)液在10 J/cm2UVA照射后3 d CatG的變化:實(shí)驗(yàn)分UVA照射組和無(wú)照射對(duì)照組。將成纖維細(xì)胞按上述方法予10 J/cm2UVA照射1次。在照射后24、48、72 h提取細(xì)胞RNA和蛋白及收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液。

4.不同UVA劑量對(duì)皮膚成纖維細(xì)胞及其培養(yǎng)液CatG表達(dá)的影響:實(shí)驗(yàn)設(shè) 10、20、30 J/cm2UVA照射組和無(wú)照射對(duì)照組。將成纖維細(xì)胞按上述方法分別予10、20、30 J/cm2UVA照射1次。在照射后24 h提取細(xì)胞RNA和蛋白及收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液。

5.RT-PCR檢測(cè)皮膚成纖維細(xì)胞中CatG mRNA表達(dá):按照Trizol試劑盒的方法提取各組細(xì)胞總RNA。按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)配制逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系,總體積20 μl,然后37℃下反轉(zhuǎn)錄15 min,85℃5 s使反轉(zhuǎn)錄酶失活,即獲得cDNA,置-20℃冰箱中保存。采用染料法(SYBR GreenⅠ)進(jìn)行相對(duì)定量分析。PCR反應(yīng)體系共20 μl,包括SYBR? Premix Ex TaqTMⅡ 10 μl,ROXDyeⅡ 0.4 μl, 雙蒸水 6 μl,上游和下游引物各 0.8 μl和 cDNA 2 μl。兩步法實(shí)時(shí)定量PCR:95℃5 s,1個(gè)循環(huán);95℃5 s,60℃30 s,40個(gè)循環(huán)。CatG上游引物序列5′-TCCAGAGTCCA GCAGGTCAGAG-3′,下游引物序列 5′-CTGGATGG TCCGCTGATTATATTG-3′,擴(kuò)增片段長(zhǎng)度200 bp。GAPDH上游引物序列5′-GCACCGTCAAGGCTGA GAAC-3′，下游引物序列 5′-TGGTGAAGACGCCAGT GGA-3′,擴(kuò)增片段長(zhǎng)度138 bp。在實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上讀取擴(kuò)增曲線、熔解曲線和Ct值。重復(fù)3次實(shí)驗(yàn),結(jié)果取平均值,用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因和內(nèi)參基因的表達(dá)相對(duì)值。

6.Western印跡檢測(cè)皮膚成纖維細(xì)胞中CatG蛋白表達(dá):提取各組細(xì)胞總蛋白-80℃保存。BCA法蛋白定量?？偟鞍捉?jīng)10%SDS-PAGE分離后,電轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。一抗兔抗人CatG-IgG(1∶500),內(nèi)參兔抗人GAPDH-IgG(1∶4 000),4℃孵育過(guò)夜,TBST液洗膜,加入HRP羊抗兔IgG(1∶1 000)37℃孵育1 h,TBST液洗膜,ECL顯色。以目的蛋白條帶灰度值與內(nèi)參條帶灰度值的比值作為該目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

表1 10 J/cm2UVA照射后24 h、48 h、72 h皮膚成纖維細(xì)胞及其上清液中CatG表達(dá)(±s)

表1 10 J/cm2UVA照射后24 h、48 h、72 h皮膚成纖維細(xì)胞及其上清液中CatG表達(dá)(±s)

注:n=3

組別 細(xì)胞CatG mRNA(2-ΔΔCt) 細(xì)胞CatG蛋白(相對(duì)表達(dá)量) 上清液CatG(ng/L)24 h 48 h 72 h 24 h 48 h 72 h 24 h 48 h 72 h對(duì)照組 0.183±0.003 0.185±0.005 0.182±0.004 0.96±0.06 0.95±0.22 1.00±0.14 122.45±6.46 124.17±6.15 121.72±3.17 UVA組 0.376±0.014 0.308±0.022 0.296±0.032 1.80±0.12 1.41±0.17 1.27±0.09 161.35±7.55 141.76±2.95 139.63±3.04 t值 24.08 9.39 6.18 10.62 2.86 2.85 6.78 4.46 7.06 P值 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05

7.ELISA檢測(cè)皮膚成纖維細(xì)胞CatG分泌水平:以無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)經(jīng)UVA照射的細(xì)胞及對(duì)照細(xì)胞,在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)收集細(xì)胞上清液,離心后-80℃保存?zhèn)溆谩０凑誆LISA操作程序加樣品、標(biāo)準(zhǔn)品、一抗、酶標(biāo)抗體、底物、終止液,然后在450 nm處測(cè)吸光度(A)。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,根據(jù)各樣品的A值計(jì)算出CatG濃度。

結(jié) 果

一、10 J/cm2UVA照射后不同時(shí)間皮膚成纖維細(xì)胞表達(dá)及分泌CatG的變化

10 J/cm2UVA 照射后 24、48、72 h,皮膚成纖維細(xì)胞CatG mRNA表達(dá)均較相應(yīng)對(duì)照組升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。照射后24、48、72 h組CatG mRNA表達(dá)水平比較,F=10.18,P＜0.05,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;LSD檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn),24 h UVA組CatG mRNA表達(dá)均顯著高于48 h和72 h UVA組(P＜0.05),但48 h與72 h UVA組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05),以24 h UVA組CatG mRNA表達(dá)最高。見(jiàn)表1。

10 J/cm2UVA 照射后 24、48、72 h,照射組細(xì)胞CatG蛋白表達(dá)分別較相應(yīng)對(duì)照組升高1.88、1.48、1.27倍,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。照射后24、48、72 h組CatG蛋白灰度值比較,F=12.74,P＜0.05);LSD檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn),24 h與48 h組間(P＜0.05)、24 h與72 h組間(P＜0.05)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,但48 h與72 h組間(P＞0.05)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,以24 h組CatG蛋白表達(dá)最高。見(jiàn)表1,圖1。

10 J/cm2UVA 照射后 24、48、72 h,照射組成纖維細(xì)胞培養(yǎng)上清液中CatG表達(dá)均分別較相應(yīng)對(duì)照組升高(P＜0.05)。照射后24、48、72 h組表達(dá)水平比較,F=26.51,P＜0.05,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;LSD分析發(fā)現(xiàn),以照射后24 h組最高。見(jiàn)表1。

圖1 10 J/cm2UVA照射后24、48、72 h皮膚成纖維細(xì)胞CatG蛋白表達(dá)電泳圖 1、3、5:分別為24、48、72 h未照光對(duì)照組;2、4、6:分別為 24、48、72 h 照射組

二、不同劑量UVA照射后24 h皮膚成纖維細(xì)胞表達(dá)及分泌CatG的變化

10、20、30 J/cm2UVA 照射后 24 h,皮膚成纖維細(xì)胞中CatG mRNA表達(dá)分別為無(wú)照射對(duì)照組的1.90、2.51、3.04倍,均較對(duì)照組升高,并隨 UVA 劑量增加而升高,經(jīng)ANOVA及LSD分析,其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001);CatG蛋白分別較對(duì)照組升高1.88、3.97、4.72倍,也隨UVA劑量增加而升高,其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。見(jiàn)表2,圖2。

表2 UVA呈劑量依賴性地促進(jìn)皮膚成纖維細(xì)胞及其上清液CatG的表達(dá)(±s)

表2 UVA呈劑量依賴性地促進(jìn)皮膚成纖維細(xì)胞及其上清液CatG的表達(dá)(±s)

注:n=3

組別 細(xì)胞CatG mRNA(2-ΔΔCt)上清液CatG(ng/L)對(duì)照組 0.259±0.003 0.69±0.07 120.56±4.76 10 J/cm2UVA組 0.492±0.002 1.30±0.02 163.69±5.22 20 J/cm2UVA組 0.651±0.001 2.74±0.04 181.04±5.11 30 J/cm2UVA組 0.788±0.002 3.26±0.08 200.31±7.65 F值 9264.54 436.97 103.30 P值細(xì)胞CatG蛋白(相對(duì)表達(dá)量)＜0.01 ＜0.01 ＜0.01

圖2 不同劑量UVA照射后24 h皮膚成纖維細(xì)胞CatG蛋白表達(dá)電泳圖 1:未照光對(duì)照組;2～4:分別為10、20、30 J/cm2UVA照光組

10、20、30 J/cm2UVA 照射組細(xì)胞培養(yǎng)上清液CatG含量分別較無(wú)照射對(duì)照組升高1.36、1.50、1.66倍(均P＜0.001)。不同UVA劑量組之間相比差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01),細(xì)胞培養(yǎng)上清液CatG含量隨UVA劑量的增加而升高。見(jiàn)表2。

討 論

有研究表明,蛋白酶是導(dǎo)致皮膚光損傷多種發(fā)病機(jī)制的共同環(huán)節(jié),在光損傷發(fā)病機(jī)制中起重要作用[3]。目前蛋白酶研究主要集中于基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)家族[4]。新近一些研究發(fā)現(xiàn),除MMP與皮膚光損傷機(jī)制有關(guān)外,其他許多酶,如溶酶體組織蛋白酶、中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶、溶菌酶、中性粒細(xì)胞蛋白酶抑制劑(Elafin)及α1抗胰蛋白酶等也參與皮膚光損傷發(fā)生[5]。

組織蛋白酶G屬于組織蛋白酶家族的絲氨酸亞型,具有分解多種正常真皮連接成分(如Ⅰ型膠原纖維、層黏連蛋白、蛋白聚糖、纖維連接素)的生物功能[6]。CatG可能通過(guò)降解真皮細(xì)胞外基質(zhì)參與光損傷[7]。Son等[8]外用CatG抑制劑于無(wú)毛雌性大鼠皮膚,結(jié)果其可增加UVB誘導(dǎo)大鼠光老化皮膚膠原含量。本研究以10 J/cm2UVA照射體外培養(yǎng)的皮膚成纖維細(xì)胞,在照射后24、48、72 h照射組細(xì)胞CatG mRNA、蛋白表達(dá)和上清液CatG含量均顯著高于相應(yīng)無(wú)照射對(duì)照組,且以照射后24 h最高,表明UVA從基因和蛋白水平刺激皮膚成纖維細(xì)胞CatG表達(dá),并促進(jìn)細(xì)胞分泌CatG,照射后24 h,成纖維細(xì)胞表達(dá)和分泌的CatG可能開(kāi)始下降。我們?cè)俜謩e以10、20、30 J/cm2UVA照射細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)UVA呈劑量依賴性地刺激皮膚成纖維細(xì)胞表達(dá)和分泌CatG。我們的前期研究[1]也發(fā)現(xiàn),光老化皮膚及皮膚成纖維細(xì)胞CatG mRNA和蛋白表達(dá)均較未老化對(duì)照組升高。Cavarra等[9]發(fā)現(xiàn),UVA而非UVB可上調(diào)來(lái)源于暴光、非暴光部位的皮膚成纖維細(xì)胞CatG的活性。因此,UVA不僅能促進(jìn)皮膚成纖維表達(dá)MMP,還刺激其表達(dá)、分泌CatG。

UVA通過(guò)降低皮膚成纖維細(xì)胞表面TβRⅡ表達(dá)下調(diào)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(TGF-β)/Smad信號(hào)通路[10],而其產(chǎn)生的活性氧簇(ROS)激活皮膚成纖維細(xì)胞的3條信號(hào)通路:磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K-AKT)通路、NF-κB通路及MAPK通路[11]。UVA是否通過(guò)這些通路上調(diào)皮膚成纖維細(xì)胞CatG表達(dá)與分泌目前還不清楚。我們的研究已揭示,組織蛋白酶K在UVA照射后3 d體外培養(yǎng)皮膚成纖維細(xì)胞中表達(dá)升高[2],在光老化皮膚及皮膚成纖維細(xì)胞中表達(dá)卻降低[1],然而CatG在這兩者中均升高,表明UVA調(diào)控皮膚成纖維細(xì)胞組織蛋白酶K、G表達(dá)的機(jī)制不同。Son等[12]報(bào)道,CatG可通過(guò)分解真皮基質(zhì)中的纖維連接素刺激皮膚成纖維細(xì)胞MMP的表達(dá),并促進(jìn)MMP前體轉(zhuǎn)化為活性形式。那么其他的酶是否調(diào)控CatG表達(dá)或UVA是否通過(guò)調(diào)控其他酶進(jìn)而影響CatG表達(dá),均有待研究。

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2014-03-18)

(本文編輯:顏艷)

Effect of ultraviolet A radiation on the expression and secretion of cathepsin G by human dermal fibroblasts

Xu Qingfang*，Hou Wei，Lai Wei，Zheng Yue，Liu Chen，Lu Chun.*Department of Dermatology，Third Affiliated Hospital，Sun Yat-sen University，Guangzhou 510630，China

Lai Wei，Email:drlaiwei@163.com

ObjectiveTo investigate the effect of ultraviolet A(UVA)radiation on the expression and secretion of cathepsin G(CatG)by human dermal fibroblasts.MethodsDermal fibroblasts were isolated from the foreskins of boys，and subjected to primary culture and subculture.After 10 or less passages，the fibroblasts were collected and divided into several groups to be irradiated with 10 J/cm2UVA followed by 24，48 and 72 hours of additional culture，or be irradiated with 10，20 and 30 J/cm2UVA followed by 24 hours of additional culture，with those receiving no treatment serving as the control group.Subsequently，cells and culture supernatant were collected，real time PCR and Western blot were performed to detect the expressions of CatG mRNA and protein respectively in these cells，and enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA)was conducted to measure the expression of CatG protein in the culture supernatant of these cells.ResultsCompared with the control group，the fibroblasts irradiated with 10 J/cm2UVA showed a significant increase at 24，48 and 72 hours in the expressions of CatG mRNA(0.376± 0.014 vs.0.183± 0.003，0.308 ± 0.022 vs.0.185± 0.005，0.296± 0.032 vs.0.182± 0.004，respectively，allP＜0.05)and protein(1.80±0.12 vs.0.96±0.06，1.41±0.17 vs.0.95±0.22，1.27±0.09 vs.1.00±0.14，respectively，allP＜0.05)，as well as in the supernatant level of CatG protein((161.35±7.55)vs.(122.45±6.46)ng/L，(141.76 ± 2.95)vs.(124.17 ± 6.15)ng/L，(139.63 ± 3.04)vs.(121.72 ± 3.17)ng/L，respectively，allP＜0.05)，with the strongest increase observed at 24 hours.At 24 hours after 10，20 and 30 J/cm2of UVA radiation，the expression of CatG mRNA in irradiated fibroblasts was 1.90，2.51 and 3.04 times respectively(allP＜ 0.05)，the expression of CatG protein was 1.88，3.97 and 4.72 times respectively(P＜ 0.05)，and the supernatant level of CatG protein was 1.36，1.50 and 1.66 times respectively(P＜ 0.05)，that in the control group，and there was an increasing trend in all the above three parameters with increasing dose of UVA.ConclusionAcute UVA radiation can promote the expression and secretion of CatG by human dermal fibroblasts.

Fibroblasts;Cathepsins;Ultraviolet rays;Cell aging

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2014.12.012

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(81171523);廣東省2012年第一批產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究與開(kāi)發(fā)資金計(jì)劃項(xiàng)目(2012B031800057);廣東省自然科學(xué)基金(10151008901000117);2011年CAD-資生堂DQ基金

510630廣州,中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院皮膚科(許慶芳、賴維、鄭躍、劉晨、陸春);新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院皮膚科(侯巍)

賴維,Email:drlaiwei@163.com