Bax/Bcl—2在淋巴回流障礙大鼠腎組織中的表達(dá)

張?zhí)移G++++++李德祥+++++柳剛++++關(guān)廣聚

[摘要] 目的 探討阻斷腎淋巴循環(huán)對(duì)大鼠腎臟細(xì)胞Bax、Bcl-2表達(dá)的影響及與大鼠腎臟功能的關(guān)系。 方法 選取雄性Wistar大鼠48只，將其隨機(jī)分為模型組和對(duì)照組，各24只。各組大鼠分別于術(shù)后第1、7、14、28天各處死6只，留取腎組織標(biāo)本提取組織蛋白、mRNA和制作石蠟切片。運(yùn)用Real-time PCR、Western blot和免疫組織化學(xué)檢測(cè)Bax、Bcl-2在腎組織中的表達(dá)，并測(cè)定24 h尿蛋白和血肌酐水平。 結(jié)果 模型組大鼠的腎功能逐漸減退，隨著術(shù)后時(shí)間的延長(zhǎng)，腎功能損害逐漸加重。模型組大鼠的Bax表達(dá)明顯強(qiáng)于對(duì)照組，免疫組織化學(xué)顯示，Bax的表達(dá)主要在腎小管及腎間質(zhì)，遠(yuǎn)端小管的表達(dá)尤其明顯，相反，模型組大鼠的Bcl-2的表達(dá)明顯減弱。 結(jié)論 阻斷腎淋巴循環(huán)可導(dǎo)致大鼠腎功能及腎小管間質(zhì)的損害，并隨時(shí)間延長(zhǎng)而加重，腎細(xì)胞凋亡與此密切相關(guān)，其中Bax/Bcl-2途徑發(fā)揮了積極作用。

[關(guān)鍵詞] 淋巴循環(huán)；尿蛋白；血肌酐；Bax/Bcl-2

[中圖分類號(hào)] R692.6 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1674-4721（2014）11（a）-0004-05

國(guó)際腎病學(xué)會(huì)發(fā)布的最新權(quán)威數(shù)據(jù)表明，慢性腎臟病在成人中的發(fā)生率約為10%，年齡越大發(fā)病率越高。在慢性腎臟病的形成過(guò)程中，細(xì)胞凋亡在其中的作用越來(lái)越受到大家的矚目[1-2]。細(xì)胞凋亡又稱程序性的細(xì)胞死亡，一直是國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究的熱點(diǎn)。研究表明，凋亡可以導(dǎo)致腎臟細(xì)胞減少，導(dǎo)致腎臟功能障礙。在某些腎臟疾病模型中，如IgA腎病、紅斑狼瘡性腎炎等，腎小球硬化、腎臟功能的損害與腎小球細(xì)胞的凋亡密切相關(guān)。另外，腎小管及腎間質(zhì)細(xì)胞的凋亡也可導(dǎo)致腎囊腫和腎纖維化的發(fā)生[3]。有研究表明，在5/6腎切除大鼠模型中，腎小球的硬化和腎小管萎縮、消失與腎小球內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡密不可分[4]。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)，Bcl-2 家族是在細(xì)胞凋亡中有重要作用的一類蛋白質(zhì)，在細(xì)胞凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中發(fā)揮重要作用，而B(niǎo)cl-2 和Bax 分別是此家族中最有代表性的抑制凋亡和促進(jìn)凋亡基因[5]。本課題在損害腎淋巴循環(huán)基礎(chǔ)上研究凋亡是否參與了其中的發(fā)病過(guò)程，Bax/Bcl-2在此過(guò)程中的表達(dá)又如何？從而為臨床上慢性腎臟病的發(fā)生尋找新的證據(jù)。1 材料與方法1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組與模型制作雄性Wistar大鼠48只，體重180～200 g（山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供）。所有大鼠按照隨機(jī)原則分為兩組：對(duì)照組和模型組各24只。對(duì)照組大鼠經(jīng)3%水合氯醛（1 ml/100 g）腹腔麻醉，分離出腎臟后切除右腎，模型組大鼠在此基礎(chǔ)上再結(jié)扎左腎淋巴管，方法參考Wilcox等[6-7]，即在腎被膜下及腎實(shí)質(zhì)內(nèi)注射0.5 ml 2% Evans藍(lán)，顯示清楚淋巴管后在外科手術(shù)顯微鏡下用4號(hào)線結(jié)扎左腎腎門淋巴管，并結(jié)扎左腎上下極脂肪纖維組織以阻斷被膜下淋巴循環(huán)。各組大鼠分別于術(shù)后第1、7、14、28天各處死6只。1.2 標(biāo)本留取 所有大鼠于處死前1 d開(kāi)始留取24 h尿液，以測(cè)尿蛋白。處死過(guò)程中心臟取血測(cè)血肌酐。腎臟組織經(jīng)過(guò)充分灌洗后，分為兩部分，一部分用于免疫組織化學(xué)；另一部分用于Western blot和Real-time PCR。1.3 免疫組織化學(xué)檢測(cè)腎臟組織經(jīng)常規(guī)脫蠟、水化，然后切片，用3% H2O2封閉，再經(jīng)微波修復(fù)后滴加Ⅰ抗（Bax工作濃度為1∶50，Bcl-2工作濃度為1∶1000。 Biosciences Pharmingen USA），放于4 ℃冷藏過(guò)夜。加入Ⅱ抗山羊抗兔IgG抗體（購(gòu)自武漢博士德生物公司）。經(jīng)DAB顯色、蘇木素復(fù)染后，再按常規(guī)方法脫水、封片等，最后置于顯微鏡下觀察結(jié)果。所有實(shí)驗(yàn)均設(shè)陰性對(duì)照，以PBS代替Ⅰ抗。本實(shí)驗(yàn)中所用免疫組織化學(xué)試劑盒等購(gòu)自北京中杉生物公司。1.4 Western blot檢測(cè)過(guò)程根據(jù)組織總蛋白提取試劑盒（購(gòu)自申能博彩公司）說(shuō)明方法提取大鼠腎臟總蛋白，然后用BCA法測(cè)定組織蛋白濃度。經(jīng)過(guò)灌膠、電泳、轉(zhuǎn)膜、牛奶封閉等過(guò)程后，加Ⅰ抗（Ⅰ抗?jié)舛菳ax 1∶1000，Bcl-2 1∶1000，β-actin單抗1∶5000）4 ℃冷藏過(guò)夜。加Ⅱ抗（1∶2500），室溫放置1 h。然后根據(jù)ECL試劑盒（購(gòu)自 Santa Cruz公司）說(shuō)明在膠片上曝光及定影等，最后測(cè)定各蛋白帶的灰度值，所有目的蛋白帶的灰度值與與β-actin的灰度值進(jìn)行比較，其比值就是各目的蛋白表達(dá)的豐度。1.5 Real-time PCR的檢測(cè)過(guò)程取腎組織50 mg左右，按Trizol試劑盒（Invitrogen公司）說(shuō)明抽提mRNA。并反轉(zhuǎn)錄成cDNA（試劑盒TaKaRa公司）。采用ABI PRISM 7000 HT進(jìn)行Real-time PCR。引物序列（TaKaRa公司設(shè)計(jì)，上海生物化工有限公司合成）見(jiàn)表1。熒光Real-time PCR采取兩步法PCR程序：首先95℃預(yù)變性10 s，然后進(jìn)行PCR反應(yīng)，95℃ 5 s、60℃ 31 s，經(jīng)過(guò)40個(gè)循環(huán)。兩組間的比較應(yīng)用Folds=2-ΔΔCt公式[8]進(jìn)行分析。表1 引物序列1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 數(shù)據(jù)采用SPSS 11.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用方差檢驗(yàn)與單因素分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 2 結(jié)果2.1 兩組大鼠術(shù)后第1、7、14、28 天尿蛋白、血肌酐水平的比較 模型組大鼠的尿蛋白于術(shù)后第7天即出現(xiàn)明顯變化（P<0.05），手術(shù)時(shí)間越長(zhǎng)，腎功能損害越明顯。模型組術(shù)后第14、28天的尿蛋白水平與同組第7天比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。同樣，血肌酐水平變化類似于尿蛋白，模型組大鼠的血肌酐水平在術(shù)后第7天開(kāi)始出現(xiàn)明顯變化，與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），手術(shù)時(shí)間越長(zhǎng)，腎功能損害越明顯。模型組第14天的血肌酐水平與同組第7天比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）（表2）。表2 兩組大鼠術(shù)后第1、7、14、28 天尿蛋白、血肌酐水平的比較（x±s） 與同組第7天比較，*P<0.05；與對(duì)照組同時(shí)間比較，#P <0.05，▲P<0.01 2.2 兩組大鼠腎組織Bax、Bcl-2的表達(dá)（免疫組織化學(xué)）對(duì)照組大鼠腎組織Bax的表達(dá)非常微弱，而模型組大鼠腎組織的Bax表達(dá)非常顯著，主要的表達(dá)部位在腎小管及腎間質(zhì)，遠(yuǎn)端小管的表達(dá)尤其強(qiáng)烈。Bcl-2表達(dá)正好相反，對(duì)照組大鼠有明顯的Bcl-2表達(dá)，其主要部位也在腎小管和腎間質(zhì)，模型組大鼠Bcl-2的表達(dá)卻非常微弱（圖1）。圖1 兩組大鼠腎組織Bax、Bcl-2蛋白的表達(dá)（免疫組織化學(xué)×200）2.3 兩組大鼠腎組織Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)的比較（Western blot）Western blot分析更能說(shuō)明Bax、Bcl-2蛋白在兩組大鼠間的不同表達(dá)。阻斷腎淋巴循環(huán)后，模型組大鼠Bax蛋白的表達(dá)量明顯增加，這與免疫組織化學(xué)觀察到的現(xiàn)象基本吻合。在術(shù)后第14天，模型組大鼠Bax的蛋白量就達(dá)到頂峰（P<0.01），以后維持逐漸增高現(xiàn)象，而凋亡抑制蛋白Bcl-2的表達(dá)從術(shù)后第1天就出現(xiàn)下降趨勢(shì)，Bax/Bcl-2比值明顯增高。對(duì)照組 Bax的表達(dá)非常微弱，相反Bcl-2的表達(dá)明顯，與模型組正好相反。在整個(gè)術(shù)后過(guò)程中，對(duì)照組Bax、Bcl-2的表達(dá)基本無(wú)明顯變化（圖2）。2.4 兩組大鼠腎組織Bax、Bcl-2 mRNA表達(dá)的比較（Real-time PCR）Real-time PCR 從基因水平反映了兩組大鼠Bax、Bcl-2的表達(dá)情況。實(shí)驗(yàn)顯示，模型組大鼠Bax的 mRNA表達(dá)在所有時(shí)間段均呈顯著增高趨勢(shì)，其中高峰期在第7天，而B(niǎo)cl-2 mRNA表達(dá)卻呈明顯下降（P<0.05），隨著術(shù)后時(shí)間的延長(zhǎng)而呈穩(wěn)步下降的趨勢(shì)。模型組Bax/Bcl-2 mRNA比值于術(shù)后第14天達(dá)到高峰（P<0.01），與對(duì)照組比較明顯增高。相反，對(duì)照組不管是Bax還是Bcl-2 ，此兩者的表達(dá)基本無(wú)明顯變化（圖3）。3 討論無(wú)論健康或疾病狀態(tài)下，淋巴循環(huán)都有其重要的作用，遺憾的是，它的功能至今仍未清楚闡明，甚至被忽略。淋巴循環(huán)將間質(zhì)多余水分帶回血液，把抗原和免疫活性細(xì)胞帶到炎癥部位的淋巴結(jié)。傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為淋巴系統(tǒng)只是被動(dòng)的執(zhí)行這些功能，如今隨著淋巴分子機(jī)制進(jìn)一步研究發(fā)展，這種觀點(diǎn)正受到挑戰(zhàn)。近年來(lái)，器官功能障礙與其淋巴循環(huán)的關(guān)系逐漸成為研究熱點(diǎn)，但尚未達(dá)成共識(shí)。有報(bào)道稱，淋巴循環(huán)障礙對(duì)組織影響甚微[9]，但也有研究表明，阻斷腎臟的淋巴循環(huán)可以導(dǎo)致腎臟硬化[10]。本實(shí)驗(yàn)就針對(duì)腎臟淋巴循環(huán)和腎臟功能的關(guān)系進(jìn)行了再次探索與研究。結(jié)果表明，當(dāng)阻斷大鼠的腎臟淋巴循環(huán)后，大鼠的腎臟功能隨之出現(xiàn)變化。模型組大鼠的尿蛋白及血肌酐水平隨著術(shù)后時(shí)間的延長(zhǎng)而不斷升高。本實(shí)驗(yàn)中免疫組織化學(xué)結(jié)果提示，阻斷腎臟的淋巴循環(huán)，其影響最明顯的是腎小管及腎間質(zhì)，由此可見(jiàn)，淋巴循環(huán)障礙對(duì)腎功能的影響是明顯的，這就為臨床上原因不明的慢性腎臟病，尤其慢性腎小管及腎間質(zhì)病變提供了新的診斷思路。本研究結(jié)果提示，淋巴循環(huán)障礙不但損害腎臟功能，并且在此基礎(chǔ)上，有關(guān)于凋亡的相關(guān)基因Bax/Bcl-2的表達(dá)也出現(xiàn)明顯變化，這為探討腎臟損傷機(jī)制提供了新的線索。眾所周知，Bax/Bcl-2在凋亡中的重要作用，其與凋亡的關(guān)系一直是近年來(lái)研究的熱點(diǎn)[11-12]。Bcl-2 家族中Bax是促進(jìn)凋亡的重要蛋白，與此相反，Bcl-2卻是抑制細(xì)胞凋亡的蛋白，兩者的作用正好相反，因此兩者的比值變化往往決定凋亡的發(fā)生與否[13-15]。近年來(lái)的研究表明，腎細(xì)胞的凋亡與Bax/Bcl-2的比值密切相關(guān)。提高凋亡促進(jìn)因子Bax與凋亡抑制因子Bcl-2 的比值，對(duì)腎小管萎縮、腎纖維化樣的凋亡進(jìn)程有明顯的促進(jìn)作用[16]。本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果證實(shí)了這一點(diǎn)。Western blot從蛋白水平反映了模型組大鼠的Bax表達(dá)明顯增加，尤其在術(shù)后14 d就達(dá)到高峰。Real-time PCR從基因水平反映了模型組大鼠的Bax表達(dá)加強(qiáng)，并且在所有時(shí)間段均呈顯著增高趨勢(shì)，而與此形成明顯對(duì)比的是，Bcl-2表達(dá)均成下降趨勢(shì)。模型組大鼠的Bax/Bcl-2比值明顯增高。阻斷腎臟的淋巴循環(huán)可以引起腎功能減退，此結(jié)果與凋亡基因表達(dá)的失衡密切相關(guān)。由此可以推斷，腎臟細(xì)胞的凋亡是淋巴循環(huán)障礙導(dǎo)致腎功能衰退的重要原因之一。淋巴循環(huán)障礙對(duì)于腎臟的損害可能不僅限于此，本研究?jī)H揭示了Bax/Bcl-2途徑的變化，那么在腎淋巴循環(huán)障礙過(guò)程中，是否還存在其他病理機(jī)制，尚待進(jìn)一步研究、探索。[參考文獻(xiàn)][1] Kitamura H，Shimizu A，Masuda Y，et al.Apoptosis in glomerular endothelial cells during the development of glomerulosclerosis in the remnant kidney model[J].Exp Nephrol，1998，6（4）：328-336.[2] Zhang N，Cheng GY，Liu XZ，et al.Expression of Bcl-2 and NF-κB in brain tissue after acute renal ischemia-reperfusion in rats[J].Asian Pac J Trop Med，2014，7（5）：386-389. [3] 段惠軍，史永宏，張艷玲，等.腎切除大鼠殘腎細(xì)胞凋亡及凋亡相關(guān)基因的表達(dá)[J].中華物理醫(yī)學(xué)與康復(fù)雜志，2001，23（5）：309-311.[4] Nankivell BJ，Borrows RJ，F(xiàn)ung CL，et al.The natural history of chronic allograft nephropathy[J].N Engl J Med，2003， 349（24）：2326-2333.[5] Sabirzhanov B，Zhao Z，Stoica BA，et al.Downregulation of miR-23a and miR-27a following experimental traumatic brain injury induces neuronal cell death through activation of proapoptotic Bcl-2 proteins[J].J Neurosci，2014，34（30）：10055-10071. [6] Wilcox CS，Sterzel RB，Dunckel PT，et al.Renal interstitial pressure and sodium excretion during hilar lymphatic ligation[J].Am J Physiol，1984，247（2 Pt 2）：F344-F351.[7] Stolarczyk J，Carone FA.Effects of renal lymphatic occlusion and venous constriction on renal function[J].Am J Pathol，1975，78（2）： 285-296. [8] Kitamura H，Shimizu A，Masuda Y，et al.Apoptosis in glomerular endothelial cells during the development of glomerulosclerosis in the remnant kidney model[J].Exp Nephrol，1998，6（4）：328-336.[9] 孫旭海，郭延章，王秀中，等.破壞腎淋巴循環(huán)對(duì)犬自體移植腎組織學(xué)的影響[J].第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2003，24（10）：958-959.[10] Mironov AA，Eremin GA，Vasilenko VA，et al.Changes in kidney tissue elements after ligation of the lymphatic vessels.Role of disorders of lymph outflow after kidney transplantation[J].Arkh Anat Gistol Embriol，1980，79（10）：80-89.[11] Zagorodna O，Martin SM，Rutkowski DT，et al.2-deoxyglucose-induced toxicity is regulated by Bcl-2 family members and is enhanced by antagonizing Bcl-2 in lymphoma cell lines[J].Oncogene，2012，31（22）：2738-2749.[12] Sun Y，Lin Y，Li H，et al.2，5-Hexanedione induces human ovarian granulosa cell apoptosis through BCL-2，BAX，and CASPASE-3 signaling pathways[J].Arch Toxicol，2012，86（2）：205-215.[13] Lalier L，Cartron PF，Juin P，et al.Bax activation and mitochondrial insertion during apoptosis[J].Apoptosis，2007， 12（5）：887-896.[14] Gill MB，Perez-Polo JR.Bax shuttling after rotenone treatment of neuronal primary cultures：effects on cell death phenotypes[J].J Neurosci Res，2009，87（9）：2047-2065. [15] Lee do Y，Lee KS，Lee HJ，et al.Kynurenic acid attenuates MPP（+）-induced dopaminergic neuronal cell death via a Bax-mediated mitochondrial pathway[J].Eur J Cell Biol，2008，87（6）：389-397.[16] Rossé T，Olivier R， Monney L，et al.Bcl-2 prolongs cell survival after Bax-induced release of cytochrome c[J].Nature，1998，391（6666）： 496-499.（收稿日期：2014-08-26 本文編輯：許俊琴）

[摘要] 目的 探討阻斷腎淋巴循環(huán)對(duì)大鼠腎臟細(xì)胞Bax、Bcl-2表達(dá)的影響及與大鼠腎臟功能的關(guān)系。 方法 選取雄性Wistar大鼠48只，將其隨機(jī)分為模型組和對(duì)照組，各24只。各組大鼠分別于術(shù)后第1、7、14、28天各處死6只，留取腎組織標(biāo)本提取組織蛋白、mRNA和制作石蠟切片。運(yùn)用Real-time PCR、Western blot和免疫組織化學(xué)檢測(cè)Bax、Bcl-2在腎組織中的表達(dá)，并測(cè)定24 h尿蛋白和血肌酐水平。 結(jié)果 模型組大鼠的腎功能逐漸減退，隨著術(shù)后時(shí)間的延長(zhǎng)，腎功能損害逐漸加重。模型組大鼠的Bax表達(dá)明顯強(qiáng)于對(duì)照組，免疫組織化學(xué)顯示，Bax的表達(dá)主要在腎小管及腎間質(zhì)，遠(yuǎn)端小管的表達(dá)尤其明顯，相反，模型組大鼠的Bcl-2的表達(dá)明顯減弱。 結(jié)論 阻斷腎淋巴循環(huán)可導(dǎo)致大鼠腎功能及腎小管間質(zhì)的損害，并隨時(shí)間延長(zhǎng)而加重，腎細(xì)胞凋亡與此密切相關(guān)，其中Bax/Bcl-2途徑發(fā)揮了積極作用。

[關(guān)鍵詞] 淋巴循環(huán)；尿蛋白；血肌酐；Bax/Bcl-2

[中圖分類號(hào)] R692.6 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1674-4721（2014）11（a）-0004-05

國(guó)際腎病學(xué)會(huì)發(fā)布的最新權(quán)威數(shù)據(jù)表明，慢性腎臟病在成人中的發(fā)生率約為10%，年齡越大發(fā)病率越高。在慢性腎臟病的形成過(guò)程中，細(xì)胞凋亡在其中的作用越來(lái)越受到大家的矚目[1-2]。細(xì)胞凋亡又稱程序性的細(xì)胞死亡，一直是國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究的熱點(diǎn)。研究表明，凋亡可以導(dǎo)致腎臟細(xì)胞減少，導(dǎo)致腎臟功能障礙。在某些腎臟疾病模型中，如IgA腎病、紅斑狼瘡性腎炎等，腎小球硬化、腎臟功能的損害與腎小球細(xì)胞的凋亡密切相關(guān)。另外，腎小管及腎間質(zhì)細(xì)胞的凋亡也可導(dǎo)致腎囊腫和腎纖維化的發(fā)生[3]。有研究表明，在5/6腎切除大鼠模型中，腎小球的硬化和腎小管萎縮、消失與腎小球內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡密不可分[4]。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)，Bcl-2 家族是在細(xì)胞凋亡中有重要作用的一類蛋白質(zhì)，在細(xì)胞凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中發(fā)揮重要作用，而B(niǎo)cl-2 和Bax 分別是此家族中最有代表性的抑制凋亡和促進(jìn)凋亡基因[5]。本課題在損害腎淋巴循環(huán)基礎(chǔ)上研究凋亡是否參與了其中的發(fā)病過(guò)程，Bax/Bcl-2在此過(guò)程中的表達(dá)又如何？從而為臨床上慢性腎臟病的發(fā)生尋找新的證據(jù)。1 材料與方法1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組與模型制作雄性Wistar大鼠48只，體重180～200 g（山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供）。所有大鼠按照隨機(jī)原則分為兩組：對(duì)照組和模型組各24只。對(duì)照組大鼠經(jīng)3%水合氯醛（1 ml/100 g）腹腔麻醉，分離出腎臟后切除右腎，模型組大鼠在此基礎(chǔ)上再結(jié)扎左腎淋巴管，方法參考Wilcox等[6-7]，即在腎被膜下及腎實(shí)質(zhì)內(nèi)注射0.5 ml 2% Evans藍(lán)，顯示清楚淋巴管后在外科手術(shù)顯微鏡下用4號(hào)線結(jié)扎左腎腎門淋巴管，并結(jié)扎左腎上下極脂肪纖維組織以阻斷被膜下淋巴循環(huán)。各組大鼠分別于術(shù)后第1、7、14、28天各處死6只。1.2 標(biāo)本留取 所有大鼠于處死前1 d開(kāi)始留取24 h尿液，以測(cè)尿蛋白。處死過(guò)程中心臟取血測(cè)血肌酐。腎臟組織經(jīng)過(guò)充分灌洗后，分為兩部分，一部分用于免疫組織化學(xué)；另一部分用于Western blot和Real-time PCR。1.3 免疫組織化學(xué)檢測(cè)腎臟組織經(jīng)常規(guī)脫蠟、水化，然后切片，用3% H2O2封閉，再經(jīng)微波修復(fù)后滴加Ⅰ抗（Bax工作濃度為1∶50，Bcl-2工作濃度為1∶1000。 Biosciences Pharmingen USA），放于4 ℃冷藏過(guò)夜。加入Ⅱ抗山羊抗兔IgG抗體（購(gòu)自武漢博士德生物公司）。經(jīng)DAB顯色、蘇木素復(fù)染后，再按常規(guī)方法脫水、封片等，最后置于顯微鏡下觀察結(jié)果。所有實(shí)驗(yàn)均設(shè)陰性對(duì)照，以PBS代替Ⅰ抗。本實(shí)驗(yàn)中所用免疫組織化學(xué)試劑盒等購(gòu)自北京中杉生物公司。1.4 Western blot檢測(cè)過(guò)程根據(jù)組織總蛋白提取試劑盒（購(gòu)自申能博彩公司）說(shuō)明方法提取大鼠腎臟總蛋白，然后用BCA法測(cè)定組織蛋白濃度。經(jīng)過(guò)灌膠、電泳、轉(zhuǎn)膜、牛奶封閉等過(guò)程后，加Ⅰ抗（Ⅰ抗?jié)舛菳ax 1∶1000，Bcl-2 1∶1000，β-actin單抗1∶5000）4 ℃冷藏過(guò)夜。加Ⅱ抗（1∶2500），室溫放置1 h。然后根據(jù)ECL試劑盒（購(gòu)自 Santa Cruz公司）說(shuō)明在膠片上曝光及定影等，最后測(cè)定各蛋白帶的灰度值，所有目的蛋白帶的灰度值與與β-actin的灰度值進(jìn)行比較，其比值就是各目的蛋白表達(dá)的豐度。1.5 Real-time PCR的檢測(cè)過(guò)程取腎組織50 mg左右，按Trizol試劑盒（Invitrogen公司）說(shuō)明抽提mRNA。并反轉(zhuǎn)錄成cDNA（試劑盒TaKaRa公司）。采用ABI PRISM 7000 HT進(jìn)行Real-time PCR。引物序列（TaKaRa公司設(shè)計(jì)，上海生物化工有限公司合成）見(jiàn)表1。熒光Real-time PCR采取兩步法PCR程序：首先95℃預(yù)變性10 s，然后進(jìn)行PCR反應(yīng)，95℃ 5 s、60℃ 31 s，經(jīng)過(guò)40個(gè)循環(huán)。兩組間的比較應(yīng)用Folds=2-ΔΔCt公式[8]進(jìn)行分析。表1 引物序列1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 數(shù)據(jù)采用SPSS 11.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用方差檢驗(yàn)與單因素分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 2 結(jié)果2.1 兩組大鼠術(shù)后第1、7、14、28 天尿蛋白、血肌酐水平的比較 模型組大鼠的尿蛋白于術(shù)后第7天即出現(xiàn)明顯變化（P<0.05），手術(shù)時(shí)間越長(zhǎng)，腎功能損害越明顯。模型組術(shù)后第14、28天的尿蛋白水平與同組第7天比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。同樣，血肌酐水平變化類似于尿蛋白，模型組大鼠的血肌酐水平在術(shù)后第7天開(kāi)始出現(xiàn)明顯變化，與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），手術(shù)時(shí)間越長(zhǎng)，腎功能損害越明顯。模型組第14天的血肌酐水平與同組第7天比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）（表2）。表2 兩組大鼠術(shù)后第1、7、14、28 天尿蛋白、血肌酐水平的比較（x±s） 與同組第7天比較，*P<0.05；與對(duì)照組同時(shí)間比較，#P <0.05，▲P<0.01 2.2 兩組大鼠腎組織Bax、Bcl-2的表達(dá)（免疫組織化學(xué)）對(duì)照組大鼠腎組織Bax的表達(dá)非常微弱，而模型組大鼠腎組織的Bax表達(dá)非常顯著，主要的表達(dá)部位在腎小管及腎間質(zhì)，遠(yuǎn)端小管的表達(dá)尤其強(qiáng)烈。Bcl-2表達(dá)正好相反，對(duì)照組大鼠有明顯的Bcl-2表達(dá)，其主要部位也在腎小管和腎間質(zhì)，模型組大鼠Bcl-2的表達(dá)卻非常微弱（圖1）。圖1 兩組大鼠腎組織Bax、Bcl-2蛋白的表達(dá)（免疫組織化學(xué)×200）2.3 兩組大鼠腎組織Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)的比較（Western blot）Western blot分析更能說(shuō)明Bax、Bcl-2蛋白在兩組大鼠間的不同表達(dá)。阻斷腎淋巴循環(huán)后，模型組大鼠Bax蛋白的表達(dá)量明顯增加，這與免疫組織化學(xué)觀察到的現(xiàn)象基本吻合。在術(shù)后第14天，模型組大鼠Bax的蛋白量就達(dá)到頂峰（P<0.01），以后維持逐漸增高現(xiàn)象，而凋亡抑制蛋白Bcl-2的表達(dá)從術(shù)后第1天就出現(xiàn)下降趨勢(shì)，Bax/Bcl-2比值明顯增高。對(duì)照組 Bax的表達(dá)非常微弱，相反Bcl-2的表達(dá)明顯，與模型組正好相反。在整個(gè)術(shù)后過(guò)程中，對(duì)照組Bax、Bcl-2的表達(dá)基本無(wú)明顯變化（圖2）。2.4 兩組大鼠腎組織Bax、Bcl-2 mRNA表達(dá)的比較（Real-time PCR）Real-time PCR 從基因水平反映了兩組大鼠Bax、Bcl-2的表達(dá)情況。實(shí)驗(yàn)顯示，模型組大鼠Bax的 mRNA表達(dá)在所有時(shí)間段均呈顯著增高趨勢(shì)，其中高峰期在第7天，而B(niǎo)cl-2 mRNA表達(dá)卻呈明顯下降（P<0.05），隨著術(shù)后時(shí)間的延長(zhǎng)而呈穩(wěn)步下降的趨勢(shì)。模型組Bax/Bcl-2 mRNA比值于術(shù)后第14天達(dá)到高峰（P<0.01），與對(duì)照組比較明顯增高。相反，對(duì)照組不管是Bax還是Bcl-2 ，此兩者的表達(dá)基本無(wú)明顯變化（圖3）。3 討論無(wú)論健康或疾病狀態(tài)下，淋巴循環(huán)都有其重要的作用，遺憾的是，它的功能至今仍未清楚闡明，甚至被忽略。淋巴循環(huán)將間質(zhì)多余水分帶回血液，把抗原和免疫活性細(xì)胞帶到炎癥部位的淋巴結(jié)。傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為淋巴系統(tǒng)只是被動(dòng)的執(zhí)行這些功能，如今隨著淋巴分子機(jī)制進(jìn)一步研究發(fā)展，這種觀點(diǎn)正受到挑戰(zhàn)。近年來(lái)，器官功能障礙與其淋巴循環(huán)的關(guān)系逐漸成為研究熱點(diǎn)，但尚未達(dá)成共識(shí)。有報(bào)道稱，淋巴循環(huán)障礙對(duì)組織影響甚微[9]，但也有研究表明，阻斷腎臟的淋巴循環(huán)可以導(dǎo)致腎臟硬化[10]。本實(shí)驗(yàn)就針對(duì)腎臟淋巴循環(huán)和腎臟功能的關(guān)系進(jìn)行了再次探索與研究。結(jié)果表明，當(dāng)阻斷大鼠的腎臟淋巴循環(huán)后，大鼠的腎臟功能隨之出現(xiàn)變化。模型組大鼠的尿蛋白及血肌酐水平隨著術(shù)后時(shí)間的延長(zhǎng)而不斷升高。本實(shí)驗(yàn)中免疫組織化學(xué)結(jié)果提示，阻斷腎臟的淋巴循環(huán)，其影響最明顯的是腎小管及腎間質(zhì)，由此可見(jiàn)，淋巴循環(huán)障礙對(duì)腎功能的影響是明顯的，這就為臨床上原因不明的慢性腎臟病，尤其慢性腎小管及腎間質(zhì)病變提供了新的診斷思路。本研究結(jié)果提示，淋巴循環(huán)障礙不但損害腎臟功能，并且在此基礎(chǔ)上，有關(guān)于凋亡的相關(guān)基因Bax/Bcl-2的表達(dá)也出現(xiàn)明顯變化，這為探討腎臟損傷機(jī)制提供了新的線索。眾所周知，Bax/Bcl-2在凋亡中的重要作用，其與凋亡的關(guān)系一直是近年來(lái)研究的熱點(diǎn)[11-12]。Bcl-2 家族中Bax是促進(jìn)凋亡的重要蛋白，與此相反，Bcl-2卻是抑制細(xì)胞凋亡的蛋白，兩者的作用正好相反，因此兩者的比值變化往往決定凋亡的發(fā)生與否[13-15]。近年來(lái)的研究表明，腎細(xì)胞的凋亡與Bax/Bcl-2的比值密切相關(guān)。提高凋亡促進(jìn)因子Bax與凋亡抑制因子Bcl-2 的比值，對(duì)腎小管萎縮、腎纖維化樣的凋亡進(jìn)程有明顯的促進(jìn)作用[16]。本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果證實(shí)了這一點(diǎn)。Western blot從蛋白水平反映了模型組大鼠的Bax表達(dá)明顯增加，尤其在術(shù)后14 d就達(dá)到高峰。Real-time PCR從基因水平反映了模型組大鼠的Bax表達(dá)加強(qiáng)，并且在所有時(shí)間段均呈顯著增高趨勢(shì)，而與此形成明顯對(duì)比的是，Bcl-2表達(dá)均成下降趨勢(shì)。模型組大鼠的Bax/Bcl-2比值明顯增高。阻斷腎臟的淋巴循環(huán)可以引起腎功能減退，此結(jié)果與凋亡基因表達(dá)的失衡密切相關(guān)。由此可以推斷，腎臟細(xì)胞的凋亡是淋巴循環(huán)障礙導(dǎo)致腎功能衰退的重要原因之一。淋巴循環(huán)障礙對(duì)于腎臟的損害可能不僅限于此，本研究?jī)H揭示了Bax/Bcl-2途徑的變化，那么在腎淋巴循環(huán)障礙過(guò)程中，是否還存在其他病理機(jī)制，尚待進(jìn)一步研究、探索。[參考文獻(xiàn)][1] Kitamura H，Shimizu A，Masuda Y，et al.Apoptosis in glomerular endothelial cells during the development of glomerulosclerosis in the remnant kidney model[J].Exp Nephrol，1998，6（4）：328-336.[2] Zhang N，Cheng GY，Liu XZ，et al.Expression of Bcl-2 and NF-κB in brain tissue after acute renal ischemia-reperfusion 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[3] 段惠軍，史永宏，張艷玲，等.腎切除大鼠殘腎細(xì)胞凋亡及凋亡相關(guān)基因的表達(dá)[J].中華物理醫(yī)學(xué)與康復(fù)雜志，2001，23（5）：309-311.[4] Nankivell BJ，Borrows RJ，F(xiàn)ung CL，et al.The natural history of chronic allograft nephropathy[J].N Engl J Med，2003， 349（24）：2326-2333.[5] Sabirzhanov B，Zhao Z，Stoica BA，et al.Downregulation of miR-23a and miR-27a following experimental traumatic brain injury induces neuronal cell death through activation of proapoptotic Bcl-2 proteins[J].J Neurosci，2014，34（30）：10055-10071. [6] Wilcox CS，Sterzel RB，Dunckel PT，et al.Renal interstitial pressure and sodium excretion during hilar lymphatic ligation[J].Am J Physiol，1984，247（2 Pt 2）：F344-F351.[7] Stolarczyk J，Carone FA.Effects of renal lymphatic occlusion and venous constriction on renal function[J].Am J Pathol，1975，78（2）： 285-296. [8] Kitamura H，Shimizu A，Masuda Y，et al.Apoptosis in glomerular endothelial cells during the development of glomerulosclerosis in the remnant kidney model[J].Exp Nephrol，1998，6（4）：328-336.[9] 孫旭海，郭延章，王秀中，等.破壞腎淋巴循環(huán)對(duì)犬自體移植腎組織學(xué)的影響[J].第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2003，24（10）：958-959.[10] Mironov AA，Eremin GA，Vasilenko VA，et al.Changes in kidney tissue elements after ligation of the lymphatic vessels.Role of disorders of lymph outflow after kidney transplantation[J].Arkh Anat Gistol Embriol，1980，79（10）：80-89.[11] Zagorodna O，Martin SM，Rutkowski DT，et al.2-deoxyglucose-induced toxicity is regulated by Bcl-2 family members and is enhanced by antagonizing Bcl-2 in lymphoma cell lines[J].Oncogene，2012，31（22）：2738-2749.[12] Sun Y，Lin Y，Li H，et al.2，5-Hexanedione induces human ovarian granulosa cell apoptosis through BCL-2，BAX，and CASPASE-3 signaling pathways[J].Arch Toxicol，2012，86（2）：205-215.[13] Lalier L，Cartron PF，Juin P，et al.Bax activation and mitochondrial insertion during apoptosis[J].Apoptosis，2007， 12（5）：887-896.[14] Gill MB，Perez-Polo JR.Bax shuttling after rotenone treatment of neuronal primary cultures：effects on cell death phenotypes[J].J Neurosci Res，2009，87（9）：2047-2065. 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[摘要] 目的 探討阻斷腎淋巴循環(huán)對(duì)大鼠腎臟細(xì)胞Bax、Bcl-2表達(dá)的影響及與大鼠腎臟功能的關(guān)系。 方法 選取雄性Wistar大鼠48只，將其隨機(jī)分為模型組和對(duì)照組，各24只。各組大鼠分別于術(shù)后第1、7、14、28天各處死6只，留取腎組織標(biāo)本提取組織蛋白、mRNA和制作石蠟切片。運(yùn)用Real-time PCR、Western blot和免疫組織化學(xué)檢測(cè)Bax、Bcl-2在腎組織中的表達(dá)，并測(cè)定24 h尿蛋白和血肌酐水平。 結(jié)果 模型組大鼠的腎功能逐漸減退，隨著術(shù)后時(shí)間的延長(zhǎng)，腎功能損害逐漸加重。模型組大鼠的Bax表達(dá)明顯強(qiáng)于對(duì)照組，免疫組織化學(xué)顯示，Bax的表達(dá)主要在腎小管及腎間質(zhì)，遠(yuǎn)端小管的表達(dá)尤其明顯，相反，模型組大鼠的Bcl-2的表達(dá)明顯減弱。 結(jié)論 阻斷腎淋巴循環(huán)可導(dǎo)致大鼠腎功能及腎小管間質(zhì)的損害，并隨時(shí)間延長(zhǎng)而加重，腎細(xì)胞凋亡與此密切相關(guān)，其中Bax/Bcl-2途徑發(fā)揮了積極作用。

[關(guān)鍵詞] 淋巴循環(huán)；尿蛋白；血肌酐；Bax/Bcl-2

[中圖分類號(hào)] R692.6 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1674-4721（2014）11（a）-0004-05

國(guó)際腎病學(xué)會(huì)發(fā)布的最新權(quán)威數(shù)據(jù)表明，慢性腎臟病在成人中的發(fā)生率約為10%，年齡越大發(fā)病率越高。在慢性腎臟病的形成過(guò)程中，細(xì)胞凋亡在其中的作用越來(lái)越受到大家的矚目[1-2]。細(xì)胞凋亡又稱程序性的細(xì)胞死亡，一直是國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究的熱點(diǎn)。研究表明，凋亡可以導(dǎo)致腎臟細(xì)胞減少，導(dǎo)致腎臟功能障礙。在某些腎臟疾病模型中，如IgA腎病、紅斑狼瘡性腎炎等，腎小球硬化、腎臟功能的損害與腎小球細(xì)胞的凋亡密切相關(guān)。另外，腎小管及腎間質(zhì)細(xì)胞的凋亡也可導(dǎo)致腎囊腫和腎纖維化的發(fā)生[3]。有研究表明，在5/6腎切除大鼠模型中，腎小球的硬化和腎小管萎縮、消失與腎小球內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡密不可分[4]。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)，Bcl-2 家族是在細(xì)胞凋亡中有重要作用的一類蛋白質(zhì)，在細(xì)胞凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中發(fā)揮重要作用，而B(niǎo)cl-2 和Bax 分別是此家族中最有代表性的抑制凋亡和促進(jìn)凋亡基因[5]。本課題在損害腎淋巴循環(huán)基礎(chǔ)上研究凋亡是否參與了其中的發(fā)病過(guò)程，Bax/Bcl-2在此過(guò)程中的表達(dá)又如何？從而為臨床上慢性腎臟病的發(fā)生尋找新的證據(jù)。1 材料與方法1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組與模型制作雄性Wistar大鼠48只，體重180～200 g（山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供）。所有大鼠按照隨機(jī)原則分為兩組：對(duì)照組和模型組各24只。對(duì)照組大鼠經(jīng)3%水合氯醛（1 ml/100 g）腹腔麻醉，分離出腎臟后切除右腎，模型組大鼠在此基礎(chǔ)上再結(jié)扎左腎淋巴管，方法參考Wilcox等[6-7]，即在腎被膜下及腎實(shí)質(zhì)內(nèi)注射0.5 ml 2% Evans藍(lán)，顯示清楚淋巴管后在外科手術(shù)顯微鏡下用4號(hào)線結(jié)扎左腎腎門淋巴管，并結(jié)扎左腎上下極脂肪纖維組織以阻斷被膜下淋巴循環(huán)。各組大鼠分別于術(shù)后第1、7、14、28天各處死6只。1.2 標(biāo)本留取 所有大鼠于處死前1 d開(kāi)始留取24 h尿液，以測(cè)尿蛋白。處死過(guò)程中心臟取血測(cè)血肌酐。腎臟組織經(jīng)過(guò)充分灌洗后，分為兩部分，一部分用于免疫組織化學(xué)；另一部分用于Western blot和Real-time PCR。1.3 免疫組織化學(xué)檢測(cè)腎臟組織經(jīng)常規(guī)脫蠟、水化，然后切片，用3% H2O2封閉，再經(jīng)微波修復(fù)后滴加Ⅰ抗（Bax工作濃度為1∶50，Bcl-2工作濃度為1∶1000。 Biosciences Pharmingen USA），放于4 ℃冷藏過(guò)夜。加入Ⅱ抗山羊抗兔IgG抗體（購(gòu)自武漢博士德生物公司）。經(jīng)DAB顯色、蘇木素復(fù)染后，再按常規(guī)方法脫水、封片等，最后置于顯微鏡下觀察結(jié)果。所有實(shí)驗(yàn)均設(shè)陰性對(duì)照，以PBS代替Ⅰ抗。本實(shí)驗(yàn)中所用免疫組織化學(xué)試劑盒等購(gòu)自北京中杉生物公司。1.4 Western blot檢測(cè)過(guò)程根據(jù)組織總蛋白提取試劑盒（購(gòu)自申能博彩公司）說(shuō)明方法提取大鼠腎臟總蛋白，然后用BCA法測(cè)定組織蛋白濃度。經(jīng)過(guò)灌膠、電泳、轉(zhuǎn)膜、牛奶封閉等過(guò)程后，加Ⅰ抗（Ⅰ抗?jié)舛菳ax 1∶1000，Bcl-2 1∶1000，β-actin單抗1∶5000）4 ℃冷藏過(guò)夜。加Ⅱ抗（1∶2500），室溫放置1 h。然后根據(jù)ECL試劑盒（購(gòu)自 Santa Cruz公司）說(shuō)明在膠片上曝光及定影等，最后測(cè)定各蛋白帶的灰度值，所有目的蛋白帶的灰度值與與β-actin的灰度值進(jìn)行比較，其比值就是各目的蛋白表達(dá)的豐度。1.5 Real-time PCR的檢測(cè)過(guò)程取腎組織50 mg左右，按Trizol試劑盒（Invitrogen公司）說(shuō)明抽提mRNA。并反轉(zhuǎn)錄成cDNA（試劑盒TaKaRa公司）。采用ABI PRISM 7000 HT進(jìn)行Real-time PCR。引物序列（TaKaRa公司設(shè)計(jì)，上海生物化工有限公司合成）見(jiàn)表1。熒光Real-time PCR采取兩步法PCR程序：首先95℃預(yù)變性10 s，然后進(jìn)行PCR反應(yīng)，95℃ 5 s、60℃ 31 s，經(jīng)過(guò)40個(gè)循環(huán)。兩組間的比較應(yīng)用Folds=2-ΔΔCt公式[8]進(jìn)行分析。表1 引物序列1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 數(shù)據(jù)采用SPSS 11.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用方差檢驗(yàn)與單因素分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 2 結(jié)果2.1 兩組大鼠術(shù)后第1、7、14、28 天尿蛋白、血肌酐水平的比較 模型組大鼠的尿蛋白于術(shù)后第7天即出現(xiàn)明顯變化（P<0.05），手術(shù)時(shí)間越長(zhǎng)，腎功能損害越明顯。模型組術(shù)后第14、28天的尿蛋白水平與同組第7天比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。同樣，血肌酐水平變化類似于尿蛋白，模型組大鼠的血肌酐水平在術(shù)后第7天開(kāi)始出現(xiàn)明顯變化，與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），手術(shù)時(shí)間越長(zhǎng)，腎功能損害越明顯。模型組第14天的血肌酐水平與同組第7天比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）（表2）。表2 兩組大鼠術(shù)后第1、7、14、28 天尿蛋白、血肌酐水平的比較（x±s） 與同組第7天比較，*P<0.05；與對(duì)照組同時(shí)間比較，#P <0.05，▲P<0.01 2.2 兩組大鼠腎組織Bax、Bcl-2的表達(dá)（免疫組織化學(xué)）對(duì)照組大鼠腎組織Bax的表達(dá)非常微弱，而模型組大鼠腎組織的Bax表達(dá)非常顯著，主要的表達(dá)部位在腎小管及腎間質(zhì)，遠(yuǎn)端小管的表達(dá)尤其強(qiáng)烈。Bcl-2表達(dá)正好相反，對(duì)照組大鼠有明顯的Bcl-2表達(dá)，其主要部位也在腎小管和腎間質(zhì)，模型組大鼠Bcl-2的表達(dá)卻非常微弱（圖1）。圖1 兩組大鼠腎組織Bax、Bcl-2蛋白的表達(dá)（免疫組織化學(xué)×200）2.3 兩組大鼠腎組織Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)的比較（Western blot）Western blot分析更能說(shuō)明Bax、Bcl-2蛋白在兩組大鼠間的不同表達(dá)。阻斷腎淋巴循環(huán)后，模型組大鼠Bax蛋白的表達(dá)量明顯增加，這與免疫組織化學(xué)觀察到的現(xiàn)象基本吻合。在術(shù)后第14天，模型組大鼠Bax的蛋白量就達(dá)到頂峰（P<0.01），以后維持逐漸增高現(xiàn)象，而凋亡抑制蛋白Bcl-2的表達(dá)從術(shù)后第1天就出現(xiàn)下降趨勢(shì)，Bax/Bcl-2比值明顯增高。對(duì)照組 Bax的表達(dá)非常微弱，相反Bcl-2的表達(dá)明顯，與模型組正好相反。在整個(gè)術(shù)后過(guò)程中，對(duì)照組Bax、Bcl-2的表達(dá)基本無(wú)明顯變化（圖2）。2.4 兩組大鼠腎組織Bax、Bcl-2 mRNA表達(dá)的比較（Real-time PCR）Real-time PCR 從基因水平反映了兩組大鼠Bax、Bcl-2的表達(dá)情況。實(shí)驗(yàn)顯示，模型組大鼠Bax的 mRNA表達(dá)在所有時(shí)間段均呈顯著增高趨勢(shì)，其中高峰期在第7天，而B(niǎo)cl-2 mRNA表達(dá)卻呈明顯下降（P<0.05），隨著術(shù)后時(shí)間的延長(zhǎng)而呈穩(wěn)步下降的趨勢(shì)。模型組Bax/Bcl-2 mRNA比值于術(shù)后第14天達(dá)到高峰（P<0.01），與對(duì)照組比較明顯增高。相反，對(duì)照組不管是Bax還是Bcl-2 ，此兩者的表達(dá)基本無(wú)明顯變化（圖3）。3 討論無(wú)論健康或疾病狀態(tài)下，淋巴循環(huán)都有其重要的作用，遺憾的是，它的功能至今仍未清楚闡明，甚至被忽略。淋巴循環(huán)將間質(zhì)多余水分帶回血液，把抗原和免疫活性細(xì)胞帶到炎癥部位的淋巴結(jié)。傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為淋巴系統(tǒng)只是被動(dòng)的執(zhí)行這些功能，如今隨著淋巴分子機(jī)制進(jìn)一步研究發(fā)展，這種觀點(diǎn)正受到挑戰(zhàn)。近年來(lái)，器官功能障礙與其淋巴循環(huán)的關(guān)系逐漸成為研究熱點(diǎn)，但尚未達(dá)成共識(shí)。有報(bào)道稱，淋巴循環(huán)障礙對(duì)組織影響甚微[9]，但也有研究表明，阻斷腎臟的淋巴循環(huán)可以導(dǎo)致腎臟硬化[10]。本實(shí)驗(yàn)就針對(duì)腎臟淋巴循環(huán)和腎臟功能的關(guān)系進(jìn)行了再次探索與研究。結(jié)果表明，當(dāng)阻斷大鼠的腎臟淋巴循環(huán)后，大鼠的腎臟功能隨之出現(xiàn)變化。模型組大鼠的尿蛋白及血肌酐水平隨著術(shù)后時(shí)間的延長(zhǎng)而不斷升高。本實(shí)驗(yàn)中免疫組織化學(xué)結(jié)果提示，阻斷腎臟的淋巴循環(huán)，其影響最明顯的是腎小管及腎間質(zhì)，由此可見(jiàn)，淋巴循環(huán)障礙對(duì)腎功能的影響是明顯的，這就為臨床上原因不明的慢性腎臟病，尤其慢性腎小管及腎間質(zhì)病變提供了新的診斷思路。本研究結(jié)果提示，淋巴循環(huán)障礙不但損害腎臟功能，并且在此基礎(chǔ)上，有關(guān)于凋亡的相關(guān)基因Bax/Bcl-2的表達(dá)也出現(xiàn)明顯變化，這為探討腎臟損傷機(jī)制提供了新的線索。眾所周知，Bax/Bcl-2在凋亡中的重要作用，其與凋亡的關(guān)系一直是近年來(lái)研究的熱點(diǎn)[11-12]。Bcl-2 家族中Bax是促進(jìn)凋亡的重要蛋白，與此相反，Bcl-2卻是抑制細(xì)胞凋亡的蛋白，兩者的作用正好相反，因此兩者的比值變化往往決定凋亡的發(fā)生與否[13-15]。近年來(lái)的研究表明，腎細(xì)胞的凋亡與Bax/Bcl-2的比值密切相關(guān)。提高凋亡促進(jìn)因子Bax與凋亡抑制因子Bcl-2 的比值，對(duì)腎小管萎縮、腎纖維化樣的凋亡進(jìn)程有明顯的促進(jìn)作用[16]。本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果證實(shí)了這一點(diǎn)。Western blot從蛋白水平反映了模型組大鼠的Bax表達(dá)明顯增加，尤其在術(shù)后14 d就達(dá)到高峰。Real-time PCR從基因水平反映了模型組大鼠的Bax表達(dá)加強(qiáng)，并且在所有時(shí)間段均呈顯著增高趨勢(shì)，而與此形成明顯對(duì)比的是，Bcl-2表達(dá)均成下降趨勢(shì)。模型組大鼠的Bax/Bcl-2比值明顯增高。阻斷腎臟的淋巴循環(huán)可以引起腎功能減退，此結(jié)果與凋亡基因表達(dá)的失衡密切相關(guān)。由此可以推斷，腎臟細(xì)胞的凋亡是淋巴循環(huán)障礙導(dǎo)致腎功能衰退的重要原因之一。淋巴循環(huán)障礙對(duì)于腎臟的損害可能不僅限于此，本研究?jī)H揭示了Bax/Bcl-2途徑的變化，那么在腎淋巴循環(huán)障礙過(guò)程中，是否還存在其他病理機(jī)制，尚待進(jìn)一步研究、探索。[參考文獻(xiàn)][1] Kitamura H，Shimizu A，Masuda Y，et al.Apoptosis in glomerular endothelial cells during the development of glomerulosclerosis in the remnant kidney model[J].Exp Nephrol，1998，6（4）：328-336.[2] Zhang N，Cheng GY，Liu XZ，et al.Expression of Bcl-2 and NF-κB in brain tissue after acute renal ischemia-reperfusion 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