梅毒螺旋體重組蛋白Tp0965的表達(dá)與鑒定

周秀萍　楊長順　牛淑會(huì)　李樹平　陽大慶　付祥　曾鐵兵

【摘要】 目的：研究梅毒螺旋體（Tp）重組蛋白Tp0965（rTp0965）的表達(dá)并鑒定其免疫反應(yīng)性，為進(jìn)一步探討其在梅毒血清學(xué)診斷與疫苗中的應(yīng)用價(jià)值奠定基礎(chǔ)。方法：構(gòu)建Tp0965原核表達(dá)重組體pET-28a（+）/Tp0965，誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化宿主菌表達(dá)重組蛋白，Ni-NTA親和層析法純化蛋白，Western blot鑒定其免疫反應(yīng)性。結(jié)果：成功構(gòu)建了原核表達(dá)重組體pET-28a（+）/Tp0965，經(jīng)誘導(dǎo)高效表達(dá)了一分子量約為43 KDa的可溶性重組蛋白，純化蛋白純度>95%；Western blot顯示該純化蛋白能被梅毒患者血清特異性識(shí)別。結(jié)論：高效表達(dá)了可溶性rTp0965，該重組抗原有良好的免疫反應(yīng)性。

【關(guān)鍵詞】 梅毒； 梅毒螺旋體； Tp0965； 重組抗原

近幾年我國梅毒發(fā)病率已居各類性傳播疾病（STDs）首位，尤其是胎傳梅毒和男-男同性伴艾滋病性梅毒呈顯著上升趨勢(shì)[1-2]。早期診斷和研發(fā)有效疫苗對(duì)防治梅毒具有重要意義。隨著梅毒螺旋體（Treponema pallidum，Tp）全基因組的解析，一些具有診斷和免疫保護(hù)價(jià)值的重組抗原陸續(xù)被表達(dá)和評(píng)價(jià)，然而迄今未發(fā)現(xiàn)能檢測(cè)出臨床各期梅毒的抗體的診斷抗原和能誘導(dǎo)完全保護(hù)作用的疫苗分子[3-7]。Tp0965是近年來發(fā)現(xiàn)的一種假想蛋白，其天然蛋白與梅毒患者血清有較好的免疫反應(yīng)性，具有潛在的免疫診斷和免疫保護(hù)價(jià)值[8-9]。本研究克隆表達(dá)了Tp0965并鑒定其免疫反應(yīng)性，為深入評(píng)價(jià)其免疫診斷和保護(hù)作用奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

1.1.1 菌株和質(zhì)粒 Tp（Nichols）梅毒菌株、pET-28a（+）質(zhì)粒及宿主菌均為南華大學(xué)病原生物學(xué)研究所保存。

1.1.2 試劑和試劑盒 基因組DNA純化提取試劑盒（QIAamp DNA Mini Kit）、Ni-NTA親和層析柱為德國Qiegen公司產(chǎn)品；限制性核酸內(nèi)切酶NdeⅠ和BamHⅠ、T4連接酶為NEB（北京）有限公司產(chǎn)品；PCR產(chǎn)物回收試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒為美國AxyPrep公司產(chǎn)品；DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)、蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)購自天根生化科技（北京）有限公司；HRP標(biāo)記羊抗人IgG（二抗）、DNA高保真聚合酶為大連寶生物公司產(chǎn)品；增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法（ECL）蛋白印跡法檢測(cè)試劑盒為PIERCE公司產(chǎn)品。

1.1.3 臨床血清 梅毒陽性血清（經(jīng)TPPA確診梅毒患者血清）、梅毒陰性血清（健康人血清）由懷化第一人民醫(yī)院檢驗(yàn)科提供。

1.2 方法

1.2.1 Tp0965基因擴(kuò)增 從GenBank獲取Tp0965基因序列，設(shè)計(jì)引物：上游引物F：GGAA TTC CAT ATG ATG ACC ACA GCA CAG AAA CT（斜體為NdeⅠ酶切位點(diǎn)序列）、下游引物R：CG GGA TCC TTT CCT CGC TGC ACT TTG G（斜體為BamHⅠ酶切位點(diǎn)序列）。按說明書以基因組DNA純化提取試劑盒提取Tp基因組DNA，以其為模板，PCR擴(kuò)增Tp0965全長基因。PCR反應(yīng)體系：10×PCR Buffer 2.5 ?L、50 fmol/L引物各0.125 ?L、2.5 mmol/L dNTPs、DNA高保真聚合酶0.5 U、模板1 ?L，加水至25 ?L。擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性40 s、64 ℃退火30 s、72 ℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)，72 ℃再延伸10 min。試劑盒回收PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。

1.2.2 重組表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建與鑒定 分別以NdeⅠ和BamHⅠ雙酶切PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與質(zhì)粒pET-28a（+）、純化，T4連接酶連接。將構(gòu)建的pET-28a（+）/Tp0965轉(zhuǎn)化E.coli BL21（DE3），篩選陽性克隆，經(jīng)酶切及測(cè)序（上海Invitrogen公司）鑒定，獲得重組工程菌。

1.2.3 誘導(dǎo)表達(dá) 重組菌接種于LB培養(yǎng)基培養(yǎng)，30 ℃下以終濃度1.0 mmol/L IPTG誘導(dǎo)表達(dá)4 h。煮沸法提取全菌蛋白，SDS-PAGE分析條帶中目的蛋白的相對(duì)含量。

1.2.4 重組蛋白表達(dá)形式鑒定 冰浴超聲細(xì)菌裂解液裂解的破碎菌體，差速離心以去除殘留全菌，4 ℃、14 000 rpm離心20 min，收集上清和沉淀（包涵體），SDS-PAGE分析蛋白表達(dá)形式。

1.2.5 重組蛋白純化 最佳優(yōu)化條件下大量誘導(dǎo)表達(dá)重組菌，裂解菌體經(jīng)超聲破碎，離心收集上清，經(jīng)Ni-NTA 親和層析柱純化，再經(jīng)SDS-PAGE，UVP掃描分析蛋白純度。

1.2.6 重組蛋白免疫反應(yīng)性鑒定 純化蛋白經(jīng)電泳后轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素（NC）膜，以1：100稀釋的10份混合梅毒陽性血清或健康血清（陰性對(duì)照）為一抗，以1：10 000稀釋的HRP標(biāo)記羊抗人IgG為二抗進(jìn)行Western blot，ECL顯影，鑒定重組蛋白免疫反應(yīng)性。

2 結(jié)果

2.1 Tp基因PCR擴(kuò)增 PCR擴(kuò)增所得目的基因得到長度約為960 bp大小片段，與預(yù)期目的片段大小相符。

2.2 重組表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建與鑒定 重組表達(dá)質(zhì)粒經(jīng)雙酶切鑒定（圖1）和DNA測(cè)序（與GenBank上登錄基因序列完全一致）鑒定，表明pET-28a（+）/Tp0965表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建成功。

2.3 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)、表達(dá)形式及純化 誘導(dǎo)表達(dá)的菌體蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳，在約43 KDa處可見一明顯條帶，與預(yù)期分子量大小一致，重組蛋白主要以可溶性形式存在，純化的重組蛋白經(jīng)SDS-PAGE顯示出單一清晰條帶（圖2），UVP掃描顯示其純度達(dá)到95%以上。

2.4 重組抗原的免疫反應(yīng)性鑒定 Western blot結(jié)果顯示，重組蛋白僅被梅毒患者混合血清識(shí)別，而不能被健康人血清識(shí)別（圖3），表明表達(dá)產(chǎn)物有良好的免疫反應(yīng)性和特異性。endprint