氟西汀致大鼠腹瀉作用研究

任麗娜 張家瑞 劉 梅

氟西汀是一種選擇性5-羥色胺再吸收抑制劑型的抗抑郁藥，“百優(yōu)解”或“百憂解”為其商品名，在臨床上用于成人憂郁癥、強(qiáng)迫癥和神經(jīng)性貪食癥的治療［1］。氟西汀臨床應(yīng)用較為廣泛，但是在應(yīng)用過(guò)程中仍然存在全身或局部過(guò)敏，心跳加速，厭食，頭暈、頭痛，睡眠異常，疲乏，精神狀態(tài)異常，性功能障礙，視覺(jué)異常，呼吸困難等諸多不良反應(yīng)。氟西汀導(dǎo)致的胃腸道不良反應(yīng)尤為常見(jiàn)，如惡心、嘔吐、消化不良、腹瀉、吞咽困難等［2］。胃腸動(dòng)力的異常經(jīng)常會(huì)伴隨炎癥疾病的發(fā)生，比如炎性腸病，長(zhǎng)此以往易導(dǎo)致全身系統(tǒng)性疾病的發(fā)生［3］，因此考察氟西汀胃腸道不良反應(yīng)發(fā)生機(jī)制臨床意義深遠(yuǎn)。

氟西汀抗抑郁的作用機(jī)制主要是通過(guò)抑制神經(jīng)突觸細(xì)胞對(duì)神經(jīng)遞質(zhì)五羥色胺(5-HT)的再吸收以增加細(xì)胞外可以和突觸后受體結(jié)合的血5-HT水平，從而起到抗抑郁的作用［4］。5-HT經(jīng)釋放作用于相應(yīng)受體發(fā)揮作用后，必須重吸收至細(xì)胞內(nèi)，終止其神經(jīng)遞質(zhì)信號(hào)，該過(guò)程即由 5-HT轉(zhuǎn)運(yùn)體(serotonin transporter，SERT)完成。近年研究顯示，5-HT轉(zhuǎn)運(yùn)體在腸道動(dòng)力紊亂、內(nèi)臟感覺(jué)異常等機(jī)制中發(fā)揮重要作用。因此，本研究著重考察了氟西汀對(duì)腸道SERT表達(dá)的影響，有助于揭示其導(dǎo)致胃腸動(dòng)力紊亂的機(jī)制。結(jié)腸組織中誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)過(guò)度表達(dá)可以誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)的發(fā)生，導(dǎo)致炎癥性腹瀉的發(fā)生［6］，本研究同時(shí)研究了氟西汀是否通過(guò)iNOS誘導(dǎo)炎癥性腹瀉。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SD雄性大鼠40只(4～6周，體質(zhì)量160～180 g)隨機(jī)分為4組，每組10只。分別為對(duì)照組(每日以2 ml生理鹽水灌胃)、氟西汀低劑量組(每日以3 mg/kg氟西汀灌胃，灌胃總體積2ml)、氟西汀中劑量組(每日以6 mg/kg氟西汀灌胃，灌胃總體積2 ml)以及氟西汀高劑量組(每日以12 mg/kg氟西汀灌胃，灌胃總體積2 ml)。實(shí)驗(yàn)組大鼠共處理14 d。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥品 氟西汀使用的為鹽酸氟西汀原料藥。鹽酸氟西汀原料藥用生理鹽水溶解至適當(dāng)濃度作為儲(chǔ)備液使用。克氏液的組成:氯化鈉114.0 mmol/L、氯化鉀 4.7 mmol/L、氯化鎂 1.2 mmol/L、氯化鈣 2.5 mmol/L、磷酸二氫 1.8 mmol/L、葡萄糖 11.5 mmol/L、碳酸氫鈉18.0 mmol/L、pH(7.4 ±0.5)mmol/L。

1.3 離體結(jié)腸平滑肌條的制備以及張力測(cè)量［7，8］大鼠預(yù)先禁食48 h，但給水。離斷大鼠脊髓處死，迅速剖腹，取出一段結(jié)腸，迅速剪好約1～2 cm的腸管。麥?zhǔn)显〔蹆?nèi)水溫由恒溫裝置控制在37℃。麥?zhǔn)显」苤糜邴準(zhǔn)显〔壑幸允乖」軆?nèi)克氏液保持恒溫37℃。L型管置于浴管內(nèi)，其上端與氣源(充氣氣囊或氣泵等)相聯(lián)，用雙凹夾固定于鐵支架上，氣流量以l～2個(gè)氣泡/s為宜。浴管下端與排液管相聯(lián)，其上端可用不同形式隨時(shí)充入新的恒溫營(yíng)養(yǎng)液。將小腸平滑肌條下端固定于浴槽下部通氣側(cè)彎鉤上，上端與換能器相連，將平滑肌置入裝有20 ml的37℃克氏液浴槽中，并通以95%O2和5%CO2，穩(wěn)定約30 min，待小腸平滑肌運(yùn)動(dòng)恢復(fù)正常后，記錄1段正?；顒?dòng)曲線，開(kāi)始滴加給藥，記錄收縮曲線。氟西汀依照預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示的劑量范圍進(jìn)行給藥，預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示氟西汀在10～160 μM劑量范圍內(nèi)，對(duì)小腸收縮呈現(xiàn)良好的劑量依賴性。大鼠解剖后，取出一段結(jié)腸，迅速剪好約1～2 cm的腸管，在通氣冰浴中保存5～8 h。結(jié)腸腸斷一端系在L型管的小鉤上，另一端用小鉤鉤住，調(diào)節(jié)其緊張度適宜，即保證平滑肌收縮的前負(fù)荷為1.0 g，然后通過(guò)張力傳感器與記錄儀相連，穩(wěn)定50 min，記錄收縮張力曲線。

1.4 結(jié)腸組織中SERT，iNOS表達(dá)測(cè)定 取灌胃氟西汀發(fā)生腹瀉的大鼠結(jié)腸組織，結(jié)腸中SERT，iNOS蛋白質(zhì)含量采用Western Blotting方法進(jìn)行研究。組織分離蛋白定量后，進(jìn)行電泳轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜完畢后，帶有蛋白條帶的PVDF膜使用SERT抗體(1∶1 000稀釋)［Abcam公司(香港)］孵育過(guò)夜。條帶檢測(cè)和定量采用多光譜成像系統(tǒng)(UVP，劍橋，英國(guó))。結(jié)腸中iNOS蛋白質(zhì)含量采用和SERT含量檢測(cè)類似方法研究。孵育抗體為iNOS抗體(1∶1 000稀釋)［Abcam公司(香港)］。

1.5 大鼠排便情況觀察 每日灌胃前收集大鼠上次灌胃后的糞便數(shù)目，糞便數(shù)目即為上一次灌胃后到本次灌胃前的排便顆?？倲?shù)，腹瀉情況，以一個(gè)污跡計(jì)算為一顆糞便數(shù)。糞便濕重與糞便干重的差值與糞便濕重的比值即為糞便含水量。

1.6 統(tǒng)計(jì)方法 所有計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示。組間比較采用單因素方差分析，P＜0.01為具有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 氟西汀對(duì)結(jié)腸平滑肌組織收縮性作用研究 與對(duì)照組比較，10～160 μM氟西汀劑量-反應(yīng)依賴性地促進(jìn)了離體大鼠結(jié)腸平滑肌收縮，顯著促進(jìn)了其收縮張力，收縮幅度以及收縮頻率，其半數(shù)有效量(EC50)為40 μM。對(duì)照組數(shù)值設(shè)定為100%，160 μM氟西汀孵育下，結(jié)腸平滑肌收縮張力從(100.0±9.3)% 增加到(213.6 ±20.3)%(P ＜0.01;n=6 結(jié)腸段);收縮幅度從(100.0 ±5.6)%增加到(312.6 ±29.6)%(P ＜0.01;n=6結(jié)腸段);收縮頻率從(100.0±8.6)%增加到158.3±14.9)%(P ＜0.01;n=6 結(jié)腸段)。見(jiàn)圖1。

圖1 氟西汀對(duì)正常大鼠離體結(jié)腸平滑肌收縮性的影響

2.2 氟西汀促進(jìn)結(jié)腸收縮性作用與Ca2+以及膽堿能M受體關(guān)系研究 在無(wú)鈣克氏液孵育的基礎(chǔ)上，加入160 μM氟西汀，依然無(wú)法使結(jié)腸平滑肌恢復(fù)收縮功能，證實(shí)氟西汀對(duì)結(jié)腸平滑肌收縮的促進(jìn)作用依賴于細(xì)胞外的鈣離子的存在。但是，阿托品10 μM不能阻斷氟西汀興奮平滑肌收縮的作用，表明氟西汀興奮胃腸平滑肌收縮的作用不是通過(guò)膽堿能M受體的。見(jiàn)圖2。

2.3 氟西汀對(duì)大鼠排便習(xí)慣作用研究 與對(duì)照組比較，氟西汀灌胃2周后，各劑量組大鼠陸續(xù)開(kāi)始出現(xiàn)腹瀉現(xiàn)象，表現(xiàn)為排便數(shù)目及糞便含水量均顯著增加(P＜0.01)。見(jiàn)表1。

圖2 氟西汀興奮結(jié)腸平滑肌收縮性與細(xì)胞外鈣離子的關(guān)系研究

表1 氟西汀對(duì)大鼠排便習(xí)慣影響研究

2.4 氟西汀對(duì)大鼠結(jié)腸組織SERT作用研究 氟西汀對(duì)SERT的影響:氟西汀灌胃2周后，結(jié)腸SERT含量顯著降低，高劑量組結(jié)腸SERT含量相較于對(duì)照組的100.0% ±11.2% 降低至 21.02% ±1.93%，有顯著性差異(P＜0.01)。見(jiàn)圖3。

圖3 氟西汀對(duì)五羥色胺轉(zhuǎn)運(yùn)體(SERT)影響

2.5 氟西汀應(yīng)用致大鼠炎性腹瀉作用研究 氟西汀灌胃2周后，出現(xiàn)腹瀉的大鼠結(jié)腸中腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白細(xì)胞介素6(IL-6)、白細(xì)胞介質(zhì)1β(IL-1β)含量顯著增加。見(jiàn)圖4。結(jié)腸組織中一氧化氮(NO)含量顯著增加，誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)含量以及轉(zhuǎn)錄因子NF-KappaB含量均顯著增加。見(jiàn)圖5。

圖4 應(yīng)用氟西汀所致細(xì)胞因子的改變

圖5 應(yīng)用氟西汀所致一氧化氮(NO)相關(guān)改變

3 討論

離體實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，氟西汀劑量-反應(yīng)依賴性地興奮了大鼠離體結(jié)腸的平滑肌收縮，其興奮作用依賴于細(xì)胞外鈣離子的濃度，與膽堿能M受體無(wú)關(guān)。

胞質(zhì)內(nèi)的Ca2+濃度升高時(shí)，Ca2+與Ca2+調(diào)蛋白結(jié)合，生成Ca2+與Ca2+調(diào)蛋白的復(fù)合物。Ca2+·Ca2+調(diào)蛋白復(fù)合物與肌球蛋白輕鏈激酶結(jié)合，并使之激活，活化的肌球蛋白輕鏈激酶使肌球蛋白輕鏈磷酸化，引起肌球蛋白頭部構(gòu)像的變化，從而導(dǎo)致橫橋與細(xì)肌絲肌動(dòng)蛋白的結(jié)合，進(jìn)入橫橋周期，肌肉產(chǎn)生收縮［9］。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果提示，氟西汀顯著增加平滑肌收縮性，其促進(jìn)收縮的作用在無(wú)Ca2+條件下基本消失，提示其興奮作用依賴于細(xì)胞外的Ca2+濃度。

灌胃氟西汀兩周后，實(shí)驗(yàn)大鼠陸續(xù)出現(xiàn)腹瀉現(xiàn)象，尤其是高劑量氟西汀組腹瀉大鼠的數(shù)目比率顯著增加，并且糞便含水量以及糞便數(shù)目相對(duì)于對(duì)照組顯著增加。

5-HT體系在胃腸動(dòng)力方面發(fā)揮著非常重要的作用，5-HT受體超家族可分為7種亞型和14種亞型。目前已知胃腸道存在5種5-HT受體亞型，分別為5-HT1、5HT2、5-HT3、5-HT4和 5-HT7的受體，其中 5-HT3、5-HT4對(duì)于胃腸動(dòng)力的調(diào)節(jié)具有相對(duì)重要的作用［10］。SERT，即5-HT 轉(zhuǎn)運(yùn)體，為一種對(duì)五羥色胺具有高度親和力，可重新攝取細(xì)胞間隙內(nèi)的5-HT，從而調(diào)節(jié)神經(jīng)信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)［10，11］。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，灌胃氟西汀兩周后，大鼠結(jié)腸平滑肌 SERT含量顯著下降。SERT含量下降會(huì)導(dǎo)致局部5-HT含量增加，5-HT大量堆積于靶點(diǎn)部位，致使胃腸功能出現(xiàn)平滑肌收縮增強(qiáng)性質(zhì)的胃腸功能紊亂［5］，容易導(dǎo)致大鼠排便次數(shù)的增加。

在氟西汀導(dǎo)致的腹瀉大鼠中研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)腸中細(xì)胞因子TNF-α、IL-6以及 IL-1β均出現(xiàn)顯著增加，iNOS以及NF-kappaB蛋白含量也顯著增加，同樣結(jié)腸組織中通過(guò)Elisa方法檢測(cè)到的NO含量也顯著增加。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，氟西汀應(yīng)用的過(guò)程中，可能通過(guò) NF-kappaB通路誘導(dǎo)結(jié)腸iNOS表達(dá)增加，局部組織中NO含量過(guò)大，導(dǎo)致炎性免疫反應(yīng)的發(fā)生，繼而誘發(fā)炎性腹瀉［12］。

本實(shí)驗(yàn)采用在體灌胃以及離體組織灌流的方法，考察氟西汀對(duì)大鼠胃腸動(dòng)力改變，從在體和離體的角度證實(shí)了氟西汀使用具有增強(qiáng)胃腸動(dòng)力的作用，但是存在導(dǎo)致炎性腹瀉的危險(xiǎn)。本實(shí)驗(yàn)揭示了氟西汀在使用時(shí)出現(xiàn)腹瀉等不良反應(yīng)的可能機(jī)制，為以后臨床應(yīng)用氟西汀在降低胃腸道不良反應(yīng)方面提供科學(xué)參考信息。

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