復(fù)方排毒止帶湯含藥血清對人宮頸鱗癌SiHa細(xì)胞人乳頭瘤病毒16型E6，E7，p53，Rb蛋白表達(dá)的影響

高月紅，鄒梅芳，李

(武進(jìn)中醫(yī)醫(yī)院，江蘇 常州213000)

宮頸癌是女性生殖道常見的惡性腫瘤［1］。全世界每年約有50萬宮頸癌新發(fā)病例，我國每年的新發(fā)病例超過13萬，占世界發(fā)病的28%。近年來，由于社會經(jīng)濟發(fā)展及人們生活方式的變化，宮頸癌的發(fā)病呈逐年升高趨勢，且“年輕化”明顯。國外學(xué)者就人乳頭瘤病毒(HPV)感染與宮頸癌的關(guān)系進(jìn)行了大量的研究，發(fā)現(xiàn)96.6%的宮頸癌標(biāo)本中可檢測出HPV病毒基因組或基因片段［2］。而且流行病學(xué)和分子生物學(xué)的研究也證實宮頸癌的發(fā)病與HPV感染密切相關(guān)［3］。人乳頭瘤病毒16型(HPV16)2個早期編碼框架E6，E7基因的表達(dá)產(chǎn)物E6，E7原癌蛋白在腫瘤發(fā)生、細(xì)胞周期的調(diào)控及凋亡中起到重要作用［4］，因此阻斷HPV16的E6，E7基因的表達(dá)，可能成為治療HPV相關(guān)性腫瘤的有效手段。本研究采用血清藥理學(xué)研究思路，采用靈敏度高、特異性強的Western Blot法，觀察中藥復(fù)方排毒止帶湯對HPV16 E6，E7，p53，pRb蛋白表達(dá)的影響。

1 實驗材料

人宮頸癌細(xì)胞系:SiHa，細(xì)胞于含10%胎牛血清的RMPI 1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)。96孔細(xì)胞培養(yǎng)板購自Costar公司，RMPI-1640培養(yǎng)基購自Gibco公司，胎牛血清購自GIBCO公司，兔抗人HPV E6多克隆抗體、兔抗人HPV E7多克隆抗體、兔抗人P53多克隆抗體、兔抗人pRb(Ser795)磷酸化多克隆抗體、兔抗人GAPDH多克隆抗體、HRP(辣根過氧化物酶)標(biāo)記的山羊抗兔二抗購自EnoGene公司，RIPA細(xì)胞裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒、ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購自南京恩晶生物科技有限公司。

2 實驗方法

2.1 含藥血清制備 選清潔級雌性健康SD大鼠18只，體質(zhì)量為100～150 g，南京醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，實驗動物合格證號:SCXK(蘇)2008-0004。隨機分為3組，空白對照組口服生理鹽水，25%含藥血清組及50%含藥血清組口服復(fù)方排毒止帶湯煎劑。中藥復(fù)方排毒止帶湯處方由白花蛇舌草15 g，苦參10 g，黃柏 10 g，紫草10 g，莪術(shù)10 g，懷牛膝 10 g，黃芪10 g，將1劑復(fù)方藥物水煎去渣制成水煎液，制成150 mL/袋，2袋，中藥液濃度為0.25 g/mL，水煎液由常州市武進(jìn)中醫(yī)醫(yī)院提供。該水煎液經(jīng)10倍濃縮后制成濃度為2.5 g/mL中藥液，于4℃冰箱密封保存。給藥劑量按人臨床給藥劑量的等效劑量的10倍給藥，計算公式為:200 g體質(zhì)量大鼠給藥劑量=70 kg體質(zhì)量人給藥劑量×0.018×10。中藥復(fù)方排毒止帶湯人日服300 mL(75 g生藥)，大鼠給藥劑量為5.4 mL 10倍濃縮液(2.5 g/mL)/200 g體質(zhì)量，即13.5 g生藥/200 g體質(zhì)量，每日灌胃給藥1次，連續(xù)給藥7d，末次灌胃給藥后1 h取血。分離血清，血清置于56℃水浴30 min滅活補體，分裝于1 mL無菌管中置于－80℃冰箱冷藏備用。

2.2 藥物處理 實驗前一天將5×105的SiHa細(xì)胞接種至6孔板中，用2 mL的MEM培養(yǎng)液或含排毒止帶湯血清的MEM培養(yǎng)液培養(yǎng)。

2.3 總蛋白提取 含藥血清作用一定時間后，各組細(xì)胞棄去培養(yǎng)液，PBS漂洗2次，加以冰預(yù)冷的RIPA裂解液(1 × PBS，1%NP-40，0.5%脫氧膽酸鈉，0.1%SDS，100 μg/mL PMSF)冰上裂解，超聲波處理(7 micro，30 s，4 次，每次間隔 1 min)，離心，取上清，BCA蛋白濃度測定試劑盒測定總蛋白含量。

2.4 蛋白免疫雜交 每孔蛋白上樣40 μg，經(jīng)分離膠為10%的SDS-PAGE凝膠電泳后，將SDS-PAGE凝膠80V恒壓轉(zhuǎn)移40 min電轉(zhuǎn)印至PVDF膜。取下PVDF膜，做好標(biāo)記，將PVDF膜放入10%的BSA中4℃封閉過液。將封閉好的PVDF膜加入一抗(1∶1 000，4℃孵育過夜，洗滌)，二抗(辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗，1∶10 000，室溫孵育1 h)，T-PBS洗滌。采用ECL化學(xué)發(fā)光顯色試劑盒檢測、攝影。

2.5 統(tǒng)計學(xué)方法 統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件。計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(珋±s)表示，2組間比較采用獨立樣本t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 實驗結(jié)果

排毒止帶湯50%含藥血清作用于SiHa人宮頸癌細(xì)胞 72 h HPV16 E6，E7，p53，pRb蛋白表達(dá)分別為:(0.73±0.05)，(0.69±0.04)，(1.51±0.05)，(1.75±0.06);排毒止帶湯50%含藥血清作用于Si-Ha人宮頸癌細(xì)胞120 h HPV16 E6，E7，p53，pRb 蛋白表達(dá)分別為:(0.59±0.05)，(0.19±0.06)，(1.80±0.02)，(2.48±0.09)。2者相應(yīng)指標(biāo)比較，P ＜0.05，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。復(fù)方排毒止帶湯25%含藥血清作用 120 h HPV16 E6，E7，p53，pRb 蛋白表達(dá)分別為:(0.79±0.08)，(0.92±0.08)，(0.91±0.05)，(2.14±0.09);復(fù)方排毒止帶湯50%含藥血清作用120 h HPV16 E6，E7，p53，pRb 蛋白表達(dá)分別為:(0.60±0.05)，(0.61±0.05)，(1.50±0.04)，(2.31±0.09)。2組相應(yīng)指標(biāo)比較，P＜0.05，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。實驗結(jié)果見圖1。

排毒止帶湯50%含藥血清作用于SiHa人宮頸癌細(xì)胞72 h即可下調(diào)HPV16 E6，E7蛋白表達(dá)水平，并上調(diào)p53、pRb蛋白表達(dá)水平。排毒止帶湯50%含藥血清作用于SiHa人宮頸癌細(xì)胞120 h，HPV16 E6，E7蛋白表達(dá)水平下降，p53、pRb蛋白表達(dá)水平增加。2組相應(yīng)指標(biāo)比較P均＜0.05，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。復(fù)方排毒止帶湯含藥血清對HPV16 E6，E7，p53，pRb蛋白表達(dá)影響具有一定的時效性。實驗結(jié)果見圖2。

復(fù)方排毒止帶湯25%含藥血清作用120 h出現(xiàn)HPV16 E6、E7蛋白表達(dá)水平下降，p53、pRb蛋白表達(dá)水平增加。復(fù)方排毒止帶湯50%含藥血清作用120 h HPV16 E6、E7蛋白表達(dá)水平下降，p53、pRb蛋白表達(dá)水平增加。2組相應(yīng)指標(biāo)比較P均＜0.05，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。復(fù)方排毒止帶湯含藥血清濃度對HPV16 E6，E7，p53，pRb蛋白表達(dá)影響存在差異。實驗結(jié)果見圖3。

圖1 Western Blot法檢測排毒止帶湯含藥血清對SiHa人宮頸癌 HPV16 E6，E7，p53，pRb蛋白表達(dá)的影響

圖2 復(fù)方排毒止帶湯50%含藥血清對SiHa人宮頸癌細(xì)胞HPV16 E6，E7，p53，pRb蛋白表達(dá)的影響

圖3 排毒止帶湯不同濃度含藥血清作用120 h對SiHa人宮頸癌細(xì)胞HPV16 E6，E7，p53，pRb蛋白表達(dá)的影響

4 討論

宮頸癌是最常見的女性惡性腫瘤之一，其發(fā)生與高危型人乳頭瘤病毒(HPV)的感染，p53，pRb抑癌基因分子突變，E6，E7原癌基因的激活，某些化學(xué)致癌物等密切相關(guān)［5］。1)E6蛋白能特異性與p53蛋白結(jié)合［6］，經(jīng)過泛素途徑快速誘導(dǎo)p53降解，E7蛋白可與pRb結(jié)合，活化核轉(zhuǎn)錄因子，p53是迄今發(fā)現(xiàn)與人類腫瘤相關(guān)性最高的抑癌基因［7］，從而使 p53和pRb喪失對細(xì)胞生長的調(diào)節(jié)作用，導(dǎo)致細(xì)胞永生化，甚至惡性轉(zhuǎn)化。2)E6，E7可與宿主細(xì)胞DNA發(fā)生高親和度的非特性結(jié)合，干擾基因的轉(zhuǎn)錄及表達(dá)。3)E6，E7可激活某些原癌基因，如C-myc，C-fos等，使細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化。4)E6在有效降解p53的同時，使E7高表達(dá)，避免了細(xì)胞的凋亡，INK4A對E6具有抑制作用，E7使得INK4A功能喪失，間接完成對E6協(xié)同作用。

中醫(yī)認(rèn)為，宮頸癌患者多因房事不潔或接觸污穢之品，濕、熱、毒邪結(jié)聚，日久導(dǎo)致氣血阻塞，耗傷氣血，損傷正氣所致。本病病機為正氣虛弱，下元不足，濕熱毒邪瘀結(jié)于胞宮子門，治療以“扶正祛邪”為宗旨。中藥復(fù)方制劑排毒止帶湯由白花蛇舌草、苦參、黃柏、紫草、懷牛膝、黃芪等組成，具有祛濕清熱，解毒化瘀，益氣和血之功效。方中紫草、苦參等對HPV有明顯抑制作用［8-9］。紫草的單味藥藥理研究也表明其含有抗病毒及提高免疫力的作用?，F(xiàn)代研究中黃柏對鉤端螺旋體、乙肝表面抗原等有抑制作用，對血小板有保護作用，還有促進(jìn)小鼠抗體生成作用［10］。黃芪對機體免疫系統(tǒng)影響廣泛，以免疫增強、免疫調(diào)節(jié)為主。由于中藥進(jìn)入體內(nèi)后存在藥物的吸收和代謝過程，以中藥體外直接作用于細(xì)胞往往無法客觀的評價藥物進(jìn)入體內(nèi)的效應(yīng)，本研究另辟蹊徑，采用血清藥理學(xué)的研究思路，采用靈敏度高、特異性強的Western Blot法，發(fā)現(xiàn)中藥復(fù)方制劑排毒止帶湯對HPV16 E6，E7蛋白存在明顯的抑制作用，能明顯提高抑癌基因p53和pRb的水平，但其作用機制有待進(jìn)一步深入探討。

近年來在HPV感染相關(guān)的宮頸癌治療方面，祖國醫(yī)學(xué)取得較大的研究進(jìn)展。王華等［11］采用中藥制劑疣毒凈膠囊治療宮頸高危型HPV感染，發(fā)現(xiàn)治療組治愈率65%，明顯高于對照組40.63%。徐俠等［12］采用清熱解毒扶正方治療HPV16/18型感染52例，有效率44.23%，明顯高于對照組11.54%。本研究發(fā)現(xiàn)，復(fù)方排毒止帶湯含藥血清對人宮頸鱗癌Si-Ha細(xì)胞HPV16 E6，E7，p53，Rb蛋白表達(dá)具有明顯調(diào)控作用，表明復(fù)方排毒止帶湯具有抗HPV16作用。未來研究將建立動物宮頸癌模型，重點研究復(fù)方排毒止帶湯對HPV感染相關(guān)宮頸癌的治療，為臨床工作提供指導(dǎo)。

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