柴芩承氣湯對急性胰腺炎大鼠腸道平滑肌細胞三磷酸肌醇的影響

王曉翔，林子琦，郭佳，張曉鑫，駱瑞杰，夏慶，薛平

（四川大學(xué)華西醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合科，成都 610041）

胃腸道是重癥急性胰腺炎（severe acute pancreatitis，SAP）病理生理過程中最早也是最易受損的器官之一，常表現(xiàn)為胃腸動力功能障礙，甚至發(fā)生腸麻痹［1］。胃腸動力功能障礙不僅與急性期全身炎性反應(yīng)有關(guān)，還與后期感染密切相關(guān)［2］。因此，胃腸動力功能障礙被認為是SAP病情惡化的扳機點，但西醫(yī)尚無行之有效的治療措施。近年來，國內(nèi)采用中西醫(yī)結(jié)合治療SAP取得很好療效。柴芩承氣湯（Chai－Qin－Cheng－Qi Decoction，CQCQD）是被華西醫(yī)院大樣本臨床研究所證實的療效確切的臨床驗方。前期研究［3］證實CQCQD可促進胃腸動力功能恢復(fù)，縮短器官衰竭的持續(xù)時間，降低后期感染發(fā)生率，但其具體作用機制尚不明確。

三磷酸肌醇 （inositol 1，4，5－triphosphate，IP3）作為細胞內(nèi)重要的第二信使，作用于內(nèi)質(zhì)膜或液泡膜上的Ca2＋通道，促進鈣庫釋放Ca2＋，液泡Ca2＋濃度升高，進而促進平滑肌細胞收縮［4，5］。CQCQD促進SAP胃腸動力功能的恢復(fù)是否與腸道平滑肌細胞IP3濃度的變化有關(guān)，目前尚無研究。

因此，本研究擬采用動物實驗，研究CQCQD對精氨酸誘導(dǎo)的急性壞死性胰腺炎（acute necrotizing pancreatitis，ANP）大鼠模型腸道平滑肌細胞IP3濃度的影響，探討CQCQD促進ANP胃腸動力功能恢復(fù)的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康成年Sprague－Dawley（SD）大鼠（scxk（川）2009－09）30只，3月齡，雌雄不拘，體質(zhì)量250～300 g，四川大學(xué)華西醫(yī)學(xué)中心實驗動物中心提供。

1.2 CQCQD制劑

方劑的組成：柴胡15g、黃芩15g、厚樸15g、枳實15g、茵陳15g、梔子20g、生大黃20g（后下）、芒硝20g（沖服）。將中藥用清水500mL浸泡1h，再用煎藥機煎0.5h，煎成200mL／劑。由四川大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生化測試中心－70℃制作成凍干粉。實驗前用注射用水按2.4g生藥／mL配制備用。采用相同容積的生理鹽水做安慰劑。

1.3 儀器

主要儀器設(shè)備：Maxi－MixII試管震蕩器（美國Barnstead／Thermolyne）；超凈工作臺（成都芯銳通風(fēng)空調(diào)凈化設(shè)備有限公司）；水平電泳儀（美國BIORAD公司）；激光掃描共聚焦顯微鏡（Zeiss 510duo）；PT－3502酶標(biāo)分析儀 （北京普通新橋技術(shù)有限公司）。

1.4 主要試劑

高糖 DMEM（GIBCO 公 司）；膠原酶 P（ROCHE公司）；精氨酸（美國Sigma公司）；大豆酶抑制劑（美國Promega公司）；L多聚賴氨酸（北京博潤萊特科技公司）；Flu3－AM（Beyotime）；Pluronic F－127（上海世澤生物科技）；ELISA mouse F Inosito1 1.4.5－Triphosphate，ELISA mouse F phospholipase C及ELISA mouse F protein kinase C均從美國GBD公司購得；其他試劑如未做特殊說明均購至Sigma公司。

1.5 動物模型的制作

造模方法如文獻［8味五參四苓湯聯(lián)合逐飲散配合順鉑胸］所述，大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7d，實驗前禁食12h，不禁水。將每只大鼠稱重，并做好標(biāo)記。固定大鼠，艾力克消毒，沿腹壁45°進針，將8%L－精氨酸按照5mL／100g計算劑量注入腹腔，1h后相同劑量再注射1次，72h后造模成功；對照組采用生理鹽水代替精氨酸，劑量及給藥方法與ANP模型相同。

1.6 分組及標(biāo)本收集

將健康30只SD大鼠隨機分成對照組、ANP組及CQCQD組，每組10只。對照組：采用假模型大鼠，適應(yīng)性喂養(yǎng)72h后，經(jīng)胃管注入生理鹽水1 mL／100g，1次／2h；ANP組：采用ANP模型大鼠，經(jīng)胃管注入生理鹽水 1mL／100g，1 次／2h；CQCQD組：采用ANP模型大鼠，經(jīng)胃管注入中藥1mL／100g，1次／2h。第6小時取血，分離血清，檢測血清膽囊收縮素－8（CCK－8），乙酰膽堿（Ach）及5－羥基色氨酸（5－HTP）；取胰腺組織做病理檢查；取肛門上2cm處腸道約10cm分離腸道平滑肌細胞，檢測細胞內(nèi)IP3及細胞內(nèi)鈣離子濃度（［Ca2＋］i）。

1.7 腸道平滑肌細胞分離

處死大鼠后，距離肛門2cm處，取腸道約10 cm，生理鹽水反復(fù)沖洗腸道組織，用手術(shù)刀輕輕刮去黏膜層和漿膜層；將腸道組織放入已消毒的小玻璃瓶中，剪碎，用移液管吸入消化酶液約5mL，將剪碎的組織與消化酶液一起吸入圓底離心管，放入水育搖床中，31℃，消化20min；取出用吹打管反復(fù)輕輕吹打后，再次用移液管吸入消化酶液約5mL，加入離心管中，繼續(xù)放入水育搖床中，31℃，消化20 min；加入終止液約20mL，混勻，反復(fù)輕輕吹打后，過細胞篩，離心，800r／min，4min，收集細胞；用DMEM培養(yǎng)液重懸細胞。用0.4%臺盼藍液染色，在3min內(nèi)確認細胞活力＞90%。

1.8 腸道平滑肌細胞［Ca2＋］i檢測

參照既往檢測胰腺腺泡［Ca2＋］i的方法［6］，具體按如下步驟進行：1）經(jīng)0.1g／L多聚賴氨酸37℃過夜浸泡的培養(yǎng)板和蓋玻片用三蒸水沖洗3遍，晾干備用。使用前用紫外線照射15min。2）新鮮分離成功的腸道平滑肌細胞置入培養(yǎng)板內(nèi)，在5%CO2，37℃的孵箱中，孵育6h。3）細胞貼壁后，吸盡培養(yǎng)板內(nèi)上清液，再向各孔中加入5μmol／L Flu－3－AM 及0.01%Pluronic F－127的 Hepes緩沖液，避光，于5%CO2孵箱中37℃孵育30min。4）洗凈各控?zé)晒馊玖希ㄓ肏epes緩沖液反復(fù)沖洗3次），加入Hepes緩沖液0.5mL。5）在共聚焦顯微鏡（laser scanning confocal microscopy，LSCM）下，采用激發(fā)波長488nm／560nm觀測。每個標(biāo)本隨機選取視野內(nèi)20個不同細胞，通過LSCM所附帶的熒光定量分析軟件對所選定區(qū)域進行熒光強度（fluorescent intensity，F(xiàn)I）的定量分析，［Ca2＋］i用FI表示。（注：每個標(biāo)本觀測時間控制在5min內(nèi)，室溫定為20～25℃）

1.9 血清CCK－8、Ach及平滑肌細胞IP3的檢測

血清CCK－8、Ach及平滑肌細胞IP3均采用酶聯(lián)免疫吸附劑 （enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）測定。具體操作步驟按試劑盒說明進行。

1.10 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 10.0軟件進行數(shù)據(jù)處理，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組資料比較采用方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組胰腺組織病理評分

ANP組胰腺病理評分（7±1.1）與對照組相比較（1±0.3），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；CQCQD組病理評分（4±0.7）與ANP組相比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

2.2 血清CCK－8、Ach及5－HTP比較

CQCQD組血清 CCK－8濃度（31.5±6.2）ng／mL低于對照組（44.0±8.1）ng／mL及 ANP組（46.0±7.6）ng／mL（P＜0.05）；ANP組血清 Ach濃度（236.1±23.6）ng／mL與對照組（310.0±26.1）ng／mL和 CQCQD組（298.5±24.7）ng／mL相比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），但CQCQD組與對照組相比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；3組血清5－HTP相比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）（見表1）。

表1 各組血清CCK－8，Ach and 5－HTP水平（±s）

表1 各組血清CCK－8，Ach and 5－HTP水平（±s）

與對照組及ANP組相比，aP＜0.05；與對照組及CQCQD組相比，b P＜0.05

組別 CCK－8／（ng／mL） Ach／（ng／mL） 5－HTP／（ng／mL）對照組44.0±8.1 310.0±26.1 15.5±6.1 ANP組 46.0±7.6 236.1±23.6b 14.3±5.4 CQCQD組 31.5±6.2a 298.5±24.7 14.5±7.4

2.3 腸道平滑肌細胞IP3及［Ca2＋］i比較

ANP組腸道平滑肌細胞IP3（16.3±1.1）pg／mL及［Ca2＋］i（108.0 ±15.5）與對照組IP3（21.9±1.3）pg／mL 及 ［Ca2＋］i（141.2 ± 20.2）和CQCQD組腸道平滑肌細胞IP3（21.6±1.7）pg／mL及［Ca2＋］i（138.8±16.3）相比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；但CQCQD組與對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）（見表2）。

表2 各組腸道平滑肌細胞IP3及［Ca2＋］i水平（±s）

表2 各組腸道平滑肌細胞IP3及［Ca2＋］i水平（±s）

與對照組及CQCQD組比較，aP＜0.05

組別 IP3／（pg／mL） ［Ca2＋］i／（FI）對照組21.9±1.3 141.2±20.2 ANP組 16.3±1.1a108.0±15.5a CQCQD組21.6±1.7 138.8±16.3

3 討論

胃腸動力功能障礙是SAP病情惡化的扳機點，與急性期器官衰竭及后期感染密切相關(guān)。及時恢復(fù)胃腸動力可進一步降低SAP患者病死率，已是國內(nèi)外學(xué)者的共識。但是，目前對SAP患者急性期胃腸動力障礙發(fā)生的具體機制尚未完全明了，西醫(yī)亦無行之有效的治療措施，而中醫(yī)藥則發(fā)揮出了獨到優(yōu)勢，療效已得到國內(nèi)學(xué)者的公認［9］。

現(xiàn)代中醫(yī)認為：SAP急性期常常表現(xiàn)為陽明腑實證，腸源內(nèi)毒素血癥是陽明腑實證病理生理過程中發(fā)生熱、驚、厥、閉、脫及臟器衰竭的主要原因，被認為是陽明腑實證之主要病理生理基礎(chǔ)。因此，促進腸道動力功能的恢復(fù)，減少腸源性內(nèi)毒素吸收入血，是中醫(yī)治療SAP的關(guān)鍵。近年來，國內(nèi)采用大承氣湯類復(fù)方湯劑為主的通里攻下法治療SAP已在臨床普遍應(yīng)用，并取得了較好療效。動物實驗發(fā)現(xiàn)：大承氣湯可升高血清胃動素（motilin，MTL）水平，促進胃腸運動功能的恢復(fù)。目前，國內(nèi)研究較多的大承氣湯類湯劑有：清胰湯、CQCQD及柴芍承氣湯［3，10，11］。其中，CQCQD 是被四川大學(xué)華西醫(yī)院大樣本臨床研究所證實治療急性期SAP療效確切的臨床驗方，由大承氣湯加柴胡、黃芩，茵陳及梔子組成。大量基礎(chǔ)與臨床研究［6］證實，CQCQD可通過減輕胰腺腺泡細胞鈣超載，減少SAP急性期炎性介質(zhì)釋放等多環(huán)節(jié)、多靶點作用，發(fā)揮治療SAP的療效。在促進SAP胃腸動力恢復(fù)方面，前期研究［5］已經(jīng)發(fā)現(xiàn)：CQCQD可促進SAP胃腸動力功能恢復(fù)，降低血清內(nèi)毒素水平，減輕SAP患者急性期炎性反應(yīng)，減少多器官功能不全發(fā)生率，縮短器官功能障礙的持續(xù)時間，降低病死率。因此，對其促SAP胃腸動力恢復(fù)機制的深入研究，有助于進一步提高SAP療效。但是，在促進SAP胃腸動力恢復(fù)方面，針對以上諸方的研究幾乎都集中在MTL、CCK、Ach及血管活性肽（vasoactive peptide，VIP）等胃腸激素的層面［7］，未對腸道動力的基本單元——腸道平滑肌細胞進行研究。

已有研究［12］證實：Ach可通過 M2受體，激活胃腸平滑肌的Gi蛋白，直接抑制腺苷酸環(huán)化酶（adenylyl cyclase，AC）活性，使其產(chǎn)物cAMP水平下降，引起Ca2＋內(nèi)流，促進平滑肌收縮；同時，細胞內(nèi)IP3水平下降可直接抑制細胞內(nèi)鈣庫釋放鈣離子［13］。本實驗直接以腸道平滑肌細胞為研究對象，探討CQCQD對腸道平滑肌細胞PLC信號傳導(dǎo)通路及其最關(guān)鍵的第二信使IP3［4］的影響。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)：ANP大鼠血清CCK－8及5－HTP與對照組無明顯變化（P＞0.05），但ANP大鼠血清Ach水平與對照組相比明顯降低（P＜0.05），同時平滑肌細胞內(nèi)IP3水平及［Ca2＋］i水平較對照組也明顯降低（P＜0.05），這說明SAP胃腸動力功能障礙的發(fā)生可能與血清Ach水平降低、平滑肌細胞IP3介導(dǎo)的PLC信號傳導(dǎo)障礙有關(guān)。本研究同時發(fā)現(xiàn)：CQCQD干預(yù)后，血清Ach水平較ANP組升高（P＜0.05），平滑肌細胞內(nèi)IP3及［Ca2＋］i也升高（P＜0.05），這說明CQCQD促進腸道動力功能的恢復(fù)可能與Ach升高、平滑肌細胞IP3濃度升高、促進鈣庫釋放［Ca2＋］i，進而促進腸道平滑肌收縮有關(guān)。

綜上所述，SAP胃腸動力功能障礙的發(fā)生與血清Ach及腸道平滑肌細胞內(nèi)IP3水平降低、細胞內(nèi)鈣庫釋放鈣離子減少有關(guān)。CQCQD促進ANP大鼠胃腸動力恢復(fù)可能與升高ANP大鼠血清Ach水平及平滑肌細胞IP3濃度，進而促進鈣庫釋放［Ca2＋］i有關(guān)。但是SAP胃腸動力功能障礙中IP3的上游及下游機制尚不清楚；CQCQD作為復(fù)方湯劑，是否還作用于IP3通路之外的其他信號通路，促進SAP胃腸動力障礙的作用尚不確定；且CQCQD組成成分較為復(fù)雜，具體發(fā)揮作用的有效成分也不清楚，還需進一步研究。

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