β－咔啉類生物堿誘導(dǎo)人胃癌細(xì)胞株SGC－7901細(xì)胞凋亡的研究

曾凡業(yè)，樊玉祥，何文婷，帕提瑪，王銳，張洪亮

（新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院腫瘤科，烏魯木齊 830000）

胃癌是臨床上常見的惡性腫瘤之一，其病死率居所有消化道腫瘤第一位，嚴(yán)重威脅著人類的健康［1］。β－咔啉類生物堿是一大類天然來源的生物堿，在自然界分布廣泛，其中以蒺藜科多年生草本植物駱駝蓬種子中提取出的β－咔啉類生物堿最為常見，其主要成分為去氫駱駝蓬堿和駱駝蓬堿，實(shí)驗(yàn)證明二者具有一定的抗腫瘤作用，但具體的作用機(jī)制目前尚未明確［2－4］。本研究從形態(tài)學(xué)方面分析β－咔啉類生物堿對(duì)人胃癌細(xì)胞株SGC－7901細(xì)胞凋亡的影響，為進(jìn)一步臨床研究提供依據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 β－咔啉類生物堿與人胃癌細(xì)胞株 β－咔啉類生物堿取自新疆道地藥材駱駝蓬，采用電噴霧質(zhì)譜技術(shù)，富集濃度為30%；人胃癌SGC－7901細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑及儀器 RPMI－1640培養(yǎng)基、胚胎牛血清、雙抗、胰蛋白酶和PBS均購(gòu)自美國(guó)HyClone公司；Hoechst 33258染液購(gòu)自美國(guó)sigma公司；超凈工作臺(tái)（蘇州凈化有限公司），酶標(biāo)儀（1500，美國(guó)Thermo公司），細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo公司），熒光顯微鏡（DMI6000B，德國(guó)Leica公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)試劑制備 β－咔啉類生物堿使用二甲基亞砜（DMSO）溶解，1 000r／min離心5min后取上清液，用0.22μm孔徑無菌濾膜除菌，置于4℃冰箱備用。人胃癌細(xì)胞株用含有10%胚胎牛血清＋0.5%雙抗（青霉素、鏈霉素）RPMI－1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，將細(xì)胞置于環(huán)境為37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)時(shí)取用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞。

1.2.2 電鏡前準(zhǔn)備 使用胰蛋白酶消化法消化細(xì)胞，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞變圓、細(xì)胞胞質(zhì)回縮，當(dāng)細(xì)胞間不再連接成片時(shí)，加入含有胚胎牛血清及雙抗的RPMI－1640 2mL終止消化。使用移液器反復(fù)吹打，盡可能使細(xì)胞脫落。將含有細(xì)胞的溶液轉(zhuǎn)移至15mL離心管中，在1 000r／min，5min條件下離心。離心結(jié)束后，棄除上清液，加入含有胚胎牛血清及雙抗的RPMI－1640，反復(fù)吹打，制備單細(xì)胞懸液。同時(shí)使用血球計(jì)數(shù)板行細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為（2～4）×105／mL，分別裝于培養(yǎng)瓶中，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，觀察細(xì)胞貼壁情況，選擇貼壁良好的培養(yǎng)瓶，每瓶加入1mLβ－咔啉類生物堿溶液，其濃度分別為0、5、10、20、40μg／mL?？瞻讓?duì)照組加入1mL含有胚胎牛血清及雙抗的RPMI－1640培養(yǎng)基。

1.2.3 SGC－7901細(xì)胞株超微結(jié)構(gòu)變化 待藥物作用48h后，收集細(xì)胞后使用2%戊二醛固定2h后，再次使用鋨酸固定，行乙醇梯度脫水、環(huán)氧樹脂包埋、切片，醋酸鈾及檸檬酸染色后，行透射電鏡觀察。

1.2.4 SGC－7901細(xì)胞株凋亡形態(tài)改變 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為（3～5）×108／mL單細(xì)胞懸液，置入6孔板中培養(yǎng)24h，選取貼壁良好的細(xì)胞棄去上清液，加入含β－咔啉類生物堿濃度為5、10、20、40μg／mL培養(yǎng)基0.5mL，對(duì)照加入等體積培養(yǎng)液。置入培養(yǎng)箱48h后，棄去上清液，PBS沖洗2次，加入甲醇與冰醋酸比例為3∶1的混合液于4℃下固定10min，每孔加入0.5mL Hoechst 33258染液染色15min，置于熒光顯微鏡下觀察并記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)記錄數(shù)據(jù)使用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SGC－7901細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化

透射電鏡結(jié)果顯示：經(jīng)不同濃度β－咔啉類生物堿作用48h的SGC－7901細(xì)胞可見一系列凋亡特征性的形態(tài)學(xué)改變，如細(xì)胞表面絨毛突起減少、細(xì)胞核內(nèi)線粒體趨于減少、核內(nèi)染色質(zhì)固縮、胞漿內(nèi)空泡增多，且隨藥物濃度增加凋亡表現(xiàn)越明顯（見圖1）。

圖1 不同β－咔啉類生物堿濃度作用SGC－7901細(xì)胞株48h后細(xì)胞改變情況

2.2 SGC－7901細(xì)胞形態(tài)變化

經(jīng)不同濃度β－咔啉類生物堿作用48h，熒光顯微鏡下可見：細(xì)胞核固縮、核內(nèi)染色質(zhì)在局部區(qū)域內(nèi)凝集、致密濃染、部分可見核碎裂、出現(xiàn)凋亡小體（見圖2）。β－咔啉類生物堿（0、5、10、20、40μg／mL）作用下SGC－7901細(xì)胞凋亡率分別為（3.25±025）%、（6.30±0.39）%、（9.34±0.54）%、（11.33±0.37）%、（19.86±0.55）%。0μg／mL組分別與其他藥物濃度組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），經(jīng)兩兩比較結(jié)果顯示：隨著β－咔啉類生物堿作用濃度增加，SGC－7901細(xì)胞凋亡率有所增加（見圖2）。

圖2 β－咔啉類生物堿作用SGC－7901 48h后細(xì)胞凋亡形態(tài)變化

3 討論

細(xì)胞凋亡又稱細(xì)胞程序性死亡，是在基因嚴(yán)密調(diào)控下發(fā)生的主動(dòng)性自我消亡過程。1972年Kerr等［5］詳細(xì)描述了凋亡細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化，包括胞漿濃縮，邊緣化，核染色質(zhì)固縮，晚期核片段化、碎裂，被膜包裹隆起，形成凋亡小體。盡管細(xì)胞凋亡是一種自主過程，但其可以被多種病理刺激誘導(dǎo)。同時(shí)，凋亡細(xì)胞不產(chǎn)生組織炎癥反應(yīng)，因此如何引導(dǎo)腫瘤細(xì)胞正常凋亡過程，成為近年來抗腫瘤藥物研制的發(fā)展方向［6］。

β－咔啉類生物堿是一類天然來源和化學(xué)合成的生物堿，以去氫駱駝蓬堿最具代表性。近年來，去氫駱駝蓬堿或駱駝蓬堿廣泛應(yīng)用于治療腫瘤的臨床實(shí)驗(yàn)中，張曉凱等［7］報(bào)道了去氫駱駝蓬堿能誘導(dǎo)人胰腺癌AsPC－1細(xì)胞的凋亡和自噬；曹明溶等［8］報(bào)道了駱駝蓬堿通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡而起到抗肝癌HepG2細(xì)胞株增殖的作用；另外，有研究顯示去氫駱駝蓬堿和駱駝蓬堿混合生物堿對(duì)胃癌細(xì)胞具有生長(zhǎng)抑制作用［9］。本實(shí)驗(yàn)所采用的β－咔啉類生物堿通過電噴霧質(zhì)譜儀制取，對(duì)駱駝蓬生物總堿經(jīng)行純化，在藥物層面能夠最大限度地排除干擾因素［10］。

通過透射電鏡觀察人胃癌SGC－7901細(xì)胞凋亡，結(jié)果顯示細(xì)胞表面微絨毛減少，但未直接觀察到典型的凋亡細(xì)胞，這可能與電鏡切片樣本含量不足或藥物濃度不足有關(guān)。熒光顯微鏡下運(yùn)用Hoechst 33258染色，能夠顯示細(xì)胞核固縮和斷裂情況［11，12］。該方法觀察凋亡細(xì)胞核染色特點(diǎn)的同時(shí)，還可以進(jìn)行初步計(jì)數(shù)，結(jié)合藥物濃度計(jì)算細(xì)胞凋亡率。本組實(shí)驗(yàn)中，β－咔啉類生物堿在5、10、20、40μg／mL濃度的細(xì)胞凋亡率分別與0μg／mL組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。然而，本研究尚未對(duì)不同濃度藥物影響下細(xì)胞凋亡關(guān)系做進(jìn)一步分析。國(guó)內(nèi)研究中，張強(qiáng)等［13］報(bào)道了人胃癌細(xì)胞SGC－7901凋亡和復(fù)方青龍衣不同濃度梯度之間的關(guān)系，鄧淑文等［14］研究發(fā)現(xiàn)姜黃素可呈劑量依賴性明顯抑制SGC7901的生長(zhǎng)。因此，對(duì)于β－咔啉類生物堿抑制SGC－7901的細(xì)胞濃度依賴性仍需進(jìn)一步研究確定［15，16］。

綜上所述，β－咔啉類生物堿對(duì)人胃癌細(xì)胞株SGC－7901細(xì)胞凋亡具有潛在誘導(dǎo)作用，后續(xù)研究可以從細(xì)胞凋亡的藥物濃度依賴性方面開展，為其抗腫瘤制劑的研制和臨床實(shí)驗(yàn)提供依據(jù)。

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