西南地區(qū)水稻細(xì)菌性條斑病菌對申嗪霉素及噻唑鋅敏感基線的建立

周麗洪，韓 陽，楊 俊，李 淼，姬廣海

(云南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，云南昆明 650201)

水稻細(xì)菌性條斑病(bacterial leaf streak，簡稱BLS)是由Xanthomonas oryzae pv.oryzicola(Xoc)侵染引起的細(xì)菌性病害.1918年，Reinking［1－2］首先報道了菲律賓水稻上發(fā)生的細(xì)菌性條斑病.1955年在我國廣東省首次發(fā)現(xiàn)該?。?］.1957年方中達(dá)等［4］做了病原菌鑒定，并將該病害命名為水稻條斑病，其病原菌命名為稻生黃單胞菌(Xanthomonas oryzicola n.sp.Fang et al).該病是目前威脅我國南方稻區(qū)水稻生產(chǎn)的重要病害，也是我國、美國和澳大利亞等國重要的檢疫性水稻病害［5］.該病的發(fā)生具有流行性、暴發(fā)性和毀滅性等特點(diǎn)，嚴(yán)重時減產(chǎn)50%以上.

植物病原菌抗藥性是植物保護(hù)領(lǐng)域內(nèi)一個難以解決的問題，當(dāng)病原物群體中存在潛在的抗藥基因時，在藥劑選擇壓力下便會出現(xiàn)抗藥性.我國對植物病原菌抗藥性研究多針對病害抗性的監(jiān)測與生物學(xué)特性［6］，到目前為止，先后應(yīng)用于植物病害的殺菌劑已達(dá)數(shù)百種之多，用藥量持續(xù)上升［7－10］.目前細(xì)菌性條斑病及水稻白葉枯病的防治主要依賴噻枯唑、鏈霉素、申嗪霉素、噻唑鋅等殺菌劑來進(jìn)行病害防治［11－18］.已有研究證明煙草野火病菌、梨火疫病菌等已對鏈霉素產(chǎn)生了抗性［19－21］;2013 年，Zhang等［22］測定了中國江浙地區(qū)水稻白葉枯菌對噻唑鋅的敏感基線并得到了噻唑鋅抗性突變菌株;關(guān)于申嗪霉素等農(nóng)藥在稻田中的殘留問題也不斷被提出［23］，使用抗菌素防治病害潛在的安全性問題令人擔(dān)憂.雖然生物防治不斷被提出［24－25］，但仍然無法高效控制病害，所以對控病藥劑的研究也應(yīng)該繼續(xù)深入.目前并無關(guān)于水稻條斑病菌對申嗪霉素、噻唑鋅的抗藥性的研究報道.因此，及時建立水稻細(xì)菌性條斑病菌對申嗪霉素、噻唑鋅的敏感基線以及開展抗藥性風(fēng)險評價等相關(guān)研究，對該殺菌劑的田間科學(xué)使用、抗藥性監(jiān)測與治理和延長藥劑的使用壽命具有重要指導(dǎo)意義.

1 材料和方法

1.1 材 料

供試藥劑:1%申嗪霉素(phenazino－1－carboxylic acid)，上海樂農(nóng)生物制品股份有限公司;20%噻唑鋅(zinc thiazole)，浙江新農(nóng)化工股份有限公司.

供試菌株:2008年至2012年，從云貴川3省的條斑病發(fā)生地采集樣品.采用平板劃線分離法，對采來的標(biāo)本病葉進(jìn)行病原菌分離、純化、保存及致病性測定［26－27］.選取43株條斑病菌，測定各菌株對申嗪霉素及噻唑鋅的敏感性.菌株來源、數(shù)量及編號詳見表1.

表1 供試菌株及菌株來源Tab.1 The strains tested and source of strains

1.2 方 法

1.2.1 抗菌譜的測定

將在營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基(nutrition agar，簡稱NA)平板上生長的病原菌用滅菌移菌環(huán)移到裝有液體NB的三角瓶中，恒溫震蕩(28℃，170 r·min－1)48 h，得到菌懸液.申嗪霉素設(shè)置4個濃度梯度:將原液稀釋 10、30、50、100.噻唑鋅設(shè)置5 個濃度梯度:將原液稀釋 100、125、150、175、200 倍.

采用離體平板抑菌圈法［28－30］:在滅菌培養(yǎng)皿中加入濃度為3×108CFU(菌落形成單位，colong-forming unit)的病原菌懸液100 μL后加入培養(yǎng)基.混勻后在無菌條件下用吹風(fēng)機(jī)吹干待用.在每塊平板上放置6個牛津杯(直徑0.6 cm、高1.0 cm)，用移液槍分別向每個牛津杯內(nèi)加入不同濃度的申嗪霉素或噻唑鋅藥液100 μL，對照用無菌水100 μL，然后將平板放置在28℃培養(yǎng)箱培養(yǎng).各濃度設(shè)置3個重復(fù).將平板放在恒溫箱中28℃培養(yǎng)，每天觀察一次，并記載抑菌圈的變化情況.

1.2.2 敏感基線的建立

通過測定不同藥劑濃度下的抑菌圈的直徑(mm)，計算藥劑對細(xì)菌生長的抑制率，抑制率=(抑菌圈的直徑－牛津杯直徑)/牛津杯直徑.使用DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)［31］計算藥劑的有效抑制中濃度(EC50)、毒力回歸方程和相關(guān)系數(shù)(r)，比較不同地區(qū)的水稻細(xì)菌性條斑病菌對申嗪霉素及噻唑鋅的敏感性，根據(jù)水稻細(xì)菌性條斑病菌的敏感性頻率分布建立水稻細(xì)菌性條斑病菌對申嗪霉素及噻唑鋅的敏感基線.將抑制率換算成機(jī)率值，將藥劑濃度換算成濃度對數(shù)，以濃度對數(shù)為橫坐標(biāo)，抑制率為縱坐標(biāo)，用Microsoft Office Excel軟件求出回歸方程及致死中濃度(EC50).

2 結(jié)果和分析

2.1 噻唑鋅對水稻條斑病菌的室內(nèi)抑制率測定分析

云南、貴州、四川水稻條斑病菌對噻唑鋅的敏感性測定結(jié)果顯示:不同菌株對噻唑鋅的敏感性存在顯著性差異，供試菌株 EC50值范圍在 0.439 ～2.549 μg·mL－1，平均值為 1.641 μg·mL－1.來自云南臨滄的30－1－3菌株噻唑鋅敏感性最低，其EC50值為2.549 μg·mL－1;來自云南瑞麗的菌株20－4－1，噻唑鋅敏感性最高，其EC50值為0.439 μg·mL－1;敏感性最高和最低菌株的EC50值相差5.806倍，且均來自于云南省低海拔高緯度的延邊地區(qū)，說明云南省條斑病菌株對噻唑鋅敏感性涵蓋范圍最廣，云南省條斑病菌噻唑鋅抗性豐富度最高(表2).

表2 噻唑鋅對供試菌株的EC50值Tab.2 The EC50value of the strains to zinc thiazole

不同地區(qū)菌株群體對噻唑鋅的敏感性測定結(jié)果顯示:不同地區(qū)菌株的EC50差異性顯著.其中云南紅河的菌株對噻唑鋅的敏感性最低，即EC50均值最大，為1.986 μg·mL－1;四川西昌的菌株對噻唑鋅的敏感性最高，EC50均值最低，為 1.458 μg·mL－1;云南省菌株 EC50值涵蓋范圍最廣，為 0.439 ～ 2.549 μg·mL－1，其中也包含了噻唑鋅敏感性最低和最高的菌株，說明了云南省菌株對噻唑鋅抗性的多樣性較四川和貴州更豐富;四川西昌的菌株對噻唑鋅的敏感性最高，即西昌地區(qū)的條斑病菌株對噻唑鋅的抗性較低，表明噻唑鋅可以繼續(xù)用于西昌條斑病的防控;同理噻唑鋅則不太適合繼續(xù)用于云南紅河州、德宏州、楚雄州等地區(qū)條斑病的防控(表3).

表3 各地區(qū)菌株群體對噻唑鋅的EC50均值比較Tab.3 The EC50value of the strains from different regions to zinc thiazole

2.2 申嗪霉素對水稻條斑病菌的室內(nèi)抑制率測定分析

云南、貴州、四川水稻條斑病菌對申嗪霉素的敏感性測定結(jié)果顯示:不同菌株對申嗪霉素的敏感性存在顯著性差異，供試菌株 EC50值范圍在 0.035 ～1.598 μg·mL－1，平均值為 0.868 μg·mL－1.來自云南臨滄的菌株21－1－1對申嗪霉素敏感性最低，其EC50值為1.598 μg·mL－1;來自四川鹽邊的菌株細(xì)66對申嗪霉素敏感性最高，其EC50值為0.035 μg·mL－1;申嗪霉素敏感性最高和最低菌株的EC50值相差45.657倍;以上結(jié)果顯示，云南臨滄可能已經(jīng)出現(xiàn)申嗪霉素抗性菌株，也表明申嗪霉素目前仍適用于四川延邊條斑病的防控，卻不再適用于云南臨滄是、瑞麗市、德宏州等地區(qū)條斑病的防控(表4).

表4 申嗪霉素對供試菌株的EC50值Tab.4 The EC50value of the strains to phenazino－1－carboxylic acid

續(xù)表4

不同地區(qū)菌株群體對申嗪霉素的敏感性測定結(jié)果顯示:不同地區(qū)菌株的EC50差異性顯著.其中云南紅河的菌株對申嗪霉素敏感性最低，即EC50均值最大，為1.526 μg·mL－1;四川鹽邊的菌株對申嗪霉素敏感性最高，EC50均值最低，為0.609 μg·mL－1;云南省菌株 EC50值涵蓋范圍最廣，為 0.065 ～1.598 μg·mL－1，其中也包含了對申嗪霉素敏感性最高的菌株和敏感性偏低的菌株，說明了云南省菌株對申嗪霉素抗性的多樣性較四川和貴州更豐富;四川鹽邊的菌株對申嗪霉素的敏感性最高，即鹽邊地區(qū)的條斑病菌株對申嗪霉素的抗性較低，表明申嗪霉素可以繼續(xù)用于鹽邊條斑病的防控;同理申嗪霉素則不太適合繼續(xù)用于云南紅河州、德宏州、瑞麗市、臨滄市、玉溪市地區(qū)條斑病的防控(表5).

表5 各地區(qū)菌株群體對申嗪霉素的EC50均值比較Tab.5 The EC50value of the strains from different regions to phenazino－1－carboxylic acid

2.3 水稻細(xì)菌性條斑病菌對噻唑鋅及申嗪霉素的敏感基線的建立

作者通過平板抑菌圈法測定了云南、四川、貴州3省43個水稻條斑病菌株對新型農(nóng)藥噻唑鋅及申嗪霉素的敏感性.檢測結(jié)果顯示，不同地區(qū)的43個菌株對噻唑鋅及申嗪霉素的敏感性呈現(xiàn)連續(xù)性變化.從頻率分布看，呈現(xiàn)近似正態(tài)分布.根據(jù)野生敏感型病原群體對藥劑敏感性為正態(tài)分布的原理，確定測得的43個菌株對噻唑鋅及申嗪霉素 EC50值的平均值分別是1.641、0.868 μg·mL－1，故該研究將1.641、0.868 μg·mL－1分別作為水稻細(xì)菌性條斑病菌對噻唑鋅和申嗪霉素的敏感性基線［32］.

3 討論

病原菌對殺菌劑抗藥性的發(fā)展嚴(yán)重影響藥劑的使用效力，對于一種新殺菌劑，了解其抗性風(fēng)險，可加強(qiáng)對新候選物的研究，從而有利于新化合物合成、新藥劑的研究開發(fā)、新產(chǎn)品的登記使用、延長藥劑使用壽命等.農(nóng)藥的大量使用和抗性菌株的出現(xiàn)，使得農(nóng)藥的抗性監(jiān)測工作被推上歷史進(jìn)程.該研究通過測定云貴川3省條斑病菌株對新型農(nóng)藥噻唑鋅及申嗪霉素的敏感性，建立了西南地區(qū)水稻條斑病菌對噻唑鋅及申嗪霉素的敏感基線，分別為 1.641、0.868 μg·mL－1.

作者通過離體試驗(yàn)平板抑菌圈法，測定了來自于云南、貴州、四川3省的43個水稻細(xì)菌性條斑病菌株對新型農(nóng)藥噻唑鋅及申嗪霉素的敏感性.

研究結(jié)果顯示:供試菌株對噻唑鋅的抗藥性整體高于申嗪霉素;不同地區(qū)水稻條斑病菌株對噻唑鋅的敏感性存在顯著差異，云南省條斑病菌株對噻唑鋅的敏感性涵蓋范圍最廣，說明云南省條斑病菌對噻唑鋅的抗性豐富度最高，也表明了云南省條斑病菌的多樣性豐富度最高;四川西昌的菌株對噻唑鋅敏感性最高，即西昌地區(qū)的條斑病菌株對噻唑鋅的抗性較低，表明噻唑鋅可以繼續(xù)用于西昌條斑病的防控;同理噻唑鋅則不太適合繼續(xù)用于云南紅河州、德宏州、楚雄州等地區(qū)條斑病的防控.43株供試菌株對噻唑鋅的 EC50平均值為1.641 μg·mL－1，未發(fā)現(xiàn)對噻唑鋅敏感性顯著降低的菌株，所以將1.641 μg·mL－1作為西南地區(qū)水稻細(xì)菌性條斑病菌對噻唑鋅的敏感基線，該基線的建立可作為今后田間抗藥性監(jiān)測的依據(jù)［33］.

對云南、貴州、四川水稻條斑病菌對申嗪霉素的敏感性的測定結(jié)果顯示:不同地區(qū)的菌株對申嗪霉素的敏感性同樣存在顯著性差異;云南、四川、貴州三省菌株的申嗪霉素EC50值范圍分別為:0.065～1.598、0.035 ～1.182、0.415 ～1.147 μg·mL－1，其中云南省菌株 EC50值范圍最廣，包含對申嗪霉素抗性最高和偏低的菌株，說明云南省水稻條斑病菌對申嗪霉素抗性豐富度最高.結(jié)果顯示，申嗪霉素目前仍適用于四川延邊條斑病的防控，卻不再適用于云南臨滄市、瑞麗市、德宏州等地區(qū)條斑病的防控.43株供試菌株EC50平均值為0.868 μg·mL－1，對申嗪霉素敏感性最高和最低菌株的EC50值相差45.657倍;未發(fā)現(xiàn)對噻唑鋅敏感性顯著降低的菌株，所以將0.868 μg·mL－1作為西南地區(qū)水稻細(xì)菌性條斑病菌對噻唑鋅的敏感基線，該基線的建立可作為今后田間抗藥性監(jiān)測的依據(jù)［34］。

研究植物病原菌對殺菌劑產(chǎn)生抗藥性的原因和抗性機(jī)制，及時了解田間菌株的抗性情況，對有效防止或延緩對殺菌劑抗藥性的產(chǎn)生具有重要意義，此不僅可以加深對殺菌劑抗藥性的認(rèn)識，還為正確提出和制定科學(xué)的抗藥性治理策略提供理論依據(jù)［35－36］.農(nóng)業(yè)生產(chǎn)過程中應(yīng)用藥劑的混用和輪換交替可以延緩抗藥性的產(chǎn)生.

研究數(shù)據(jù)顯示，對噻唑鋅及申嗪霉素兩種藥劑抗藥性最高的菌株，即EC50值最高的菌株均來自云南省臨滄市，猜測該市有過度使用噻唑鋅及申嗪霉素的可能.供試菌株是否存在多種藥劑的交互抗性尚需進(jìn)一步研究.據(jù)報道，目前已發(fā)現(xiàn)3種鏈霉素抗性的機(jī)制［37－38］.但云南還未發(fā)現(xiàn)天然抗鏈霉素、噻唑鋅及申嗪霉素的水稻白葉枯和條斑菌株，也沒有關(guān)于噻唑鋅及申嗪霉素抗性機(jī)制及抗性突變菌株的相關(guān)報道，條斑病菌對各類農(nóng)藥是否具有交互抗藥性也未明確，作者課題組將針對這些問題進(jìn)行深入研究.

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